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(1.南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南 衡陽(yáng)421001；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

二烯丙基二硫下調(diào)uPA和MMP9抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移

劉曉旺1，陳霄霄1*，周志剛2**，熊婷1，李麗丁1，陳雪艷1，彭露1，涂劍1**

(1.南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南 衡陽(yáng)421001；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科)

目的研究大蒜提取物二烯丙基二硫(DADS)對(duì)MCF-7和MDA-MB-231兩種人乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移的作用。方法采用不同濃度(0,100,200,400 μmol/L)DADS處理MCF-7和MDA-MB-231兩種人乳腺癌細(xì)胞24 h，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DADS對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)觀察DADS對(duì)細(xì)胞遷移能力的改變；western blot檢測(cè)兩種細(xì)胞中尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)的表達(dá)。結(jié)果Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DADS呈濃度依賴性抑制MCF-7和MDA-MB-231兩種乳腺癌細(xì)胞的侵襲，劃痕愈合實(shí)驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)DADS呈濃度依賴性抑制兩種乳腺癌細(xì)胞的遷移。與此同時(shí)，Western blot結(jié)果顯示DADS可濃度依賴性下調(diào)侵襲遷移相關(guān)蛋白u(yù)PA和MMP9的表達(dá)。結(jié)論DADS可下調(diào)uPA和MMP9表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移。

二烯丙基二硫； 人乳腺癌細(xì)胞； 細(xì)胞侵襲； 細(xì)胞遷移

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率逐年升高[1-2]。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是乳腺癌致死的主要原因之一[3]，但相關(guān)機(jī)制尚未闡明。

二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)是從大蒜中分離出的一種脂溶性有機(jī)硫化合物，對(duì)乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌和白血病等多種腫瘤均有明顯的抑制作用[4-9]，提示DADS是一種具有開(kāi)發(fā)潛力的新型抗癌藥物。前期研究中用DADS 50、100、200、400 μmol/L處理MCF-7細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示DADS能降低MCF-7細(xì)胞的增殖活性，其作用呈濃度依賴性?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)中基質(zhì)金屬蛋白酶9 (matrix metalloproteinase 9,MMP9)與腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能關(guān)系最密切[10]。尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-type plasminogen activator,uPA)是一種絲氨酸蛋白水解酶[11]，許多研究證實(shí)uPA在多種腫瘤中過(guò)表達(dá)，在腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中扮演重要角色[12]。本研究探討DADS對(duì)人乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移能力和對(duì)細(xì)胞中uPA /MMP9表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料MCF-7和MDA-MB-231兩種人乳腺癌細(xì)胞均購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，DADS、β-actin一抗、Transwell小室和基質(zhì)膠均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，MMP9一抗為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品，uPA一抗購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔和抗鼠二抗均購(gòu)自聯(lián)科生物公司。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和DADS分組 MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。采用不同濃度(0,100,200,400 μmol/L) DADS處理MCF-7和MDA-MB-231兩種人乳腺癌細(xì)胞24 h。

1.2.2 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 將4 ℃的Matrigel用無(wú)血清培養(yǎng)基以1∶5稀釋混勻。在transwell上室均勻鋪40 μL稀釋的Matrigel，放入5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，使之形成均勻的凝膠。將細(xì)胞重懸至1×106個(gè)/mL，上室每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，下室加入500 μL含有10%胎牛血清的DMEM，培養(yǎng)24 h。取出transwell小室，擦去上室面的Matrigel和非侵襲細(xì)胞，下室用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色后漂洗晾干，在倒置顯微鏡下觀察。用Image ProPlus軟件對(duì)圖片分析掃描，對(duì)各組細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.3 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 在6孔板背后均勻的劃?rùn)M線，每孔加入細(xì)胞5×105個(gè)，穿過(guò)5條線；放入5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育12 h后，用tip頭垂至于背后的橫線劃痕，PBS洗去劃下的細(xì)胞，加入各處理因素后繼續(xù)培養(yǎng)24 h后在顯微鏡下拍照。使用Image ProPlus軟件對(duì)圖片分析掃描，計(jì)算各組細(xì)胞的遷移率。

1.2.4 Western blot檢測(cè)uPA和MMP9的蛋白表達(dá) 將各處理組蛋白收集后根據(jù)BCA 蛋白定量試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)各組蛋白濃度。高溫變性后，對(duì)各樣品上樣進(jìn)行電泳，將SDS-PAGE膠轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上，室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌15 min×3次。二抗37 ℃孵育45 min后用 TBST 洗滌 15 min×4次，顯影。條帶用AlphaImager2200軟件灰度掃描。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，組間比較采用方差分析及t檢驗(yàn)，P<0.05判定差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 DADS對(duì)人乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明：隨著DADS處理濃度的增加，100、200和400 μmol/L DADS組MCF-7細(xì)胞穿過(guò)基底膜的數(shù)目均明顯減少 (P<0.05)，尤以200和400 μmol/L DADS組效果顯著 (P<0.01,圖1A2)；200和400 μmol/L DADS組MDA-MB-231細(xì)胞穿過(guò)基底膜的數(shù)目均明顯減少 (P<0.05)，尤以400 μmol/L DADS組效果顯著 (P<0.01,圖1B2)。DADS可隨著處理濃度的增高，顯著抑制MCF-7 和MDA-MB-231兩種乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。

2.2 DADS對(duì)人乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)DADS處理后的MCF-7細(xì)胞，與0μmol/L DADS組相比，隨著處理濃度的增加，細(xì)胞遷移能力顯著降低(圖2A2)；經(jīng)DADS處理后的MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力也顯著降低且具有濃度依賴性(圖2B2)。DADS可以明顯抑制MCF-7和MDA-MB-231兩種人乳腺癌細(xì)胞的遷移能力。

2.3 DADS對(duì)人乳腺癌細(xì)胞中uPA與MMP9蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著DADS處理濃度的增加，MCF-7細(xì)胞中uPA與MMP9蛋白表達(dá)逐漸減弱，且差異具有顯著性(P<0.05,圖3A2)。而MDA-MB-231細(xì)胞中同樣也可觀察到DADS呈濃度依賴性下調(diào)uPA與MMP9的蛋白表達(dá) (圖3B2)。

3 討 論

DADS是一種具有開(kāi)發(fā)潛力的新型抗癌藥物，已有報(bào)道對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用[4-5]。另有研究提示[13]，大蒜內(nèi)另一含硫成分DATS可以抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的血行轉(zhuǎn)移過(guò)程。而DADS是否存在相似的作用效果？

圖1 DADS對(duì)人乳腺癌細(xì)胞侵襲的影響 *:P<0.05,**:P<0.01,與0 μmol/L DADS處理細(xì)胞組相比. A1:細(xì)胞顯微鏡觀察DADS對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲的影響(×100)，A2：DADS對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲的相對(duì)密度； B1:細(xì)胞顯微鏡下DADS對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲的影響(×100);B2:DADS對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲的相對(duì)密度； a:0 μmol/L;b:100 μmol/L;c:200 μmol/L;d:400 μmol/L DADS

圖2 DADS對(duì)人乳腺癌細(xì)胞遷移的影響 與0 μmol/L DADS處理細(xì)胞組相比,**:P<0.01. A1:DADS對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移的細(xì)胞劃痕(×40)；A2:DADS對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移的相對(duì)速度;B1:DADS對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移的細(xì)胞劃痕(×40)；B2：DADS對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移的相對(duì)速度. a:0 μmol/L;b:100 μmol/L;c:200 μmol/L;d:400 μmol/L DADS.

圖3 DADS對(duì)人乳腺癌細(xì)胞中uPA和MMP9蛋白表達(dá)的影響(western blot檢測(cè)) 與0 μmol/L組相比,*:P<0.05. A1:DADS對(duì)MCF-7細(xì)胞中uPA和MMP9蛋白表達(dá)的電泳圖；A2：DADS對(duì)MCF-7細(xì)胞中uPA和MMP9蛋白表達(dá)的相對(duì)表達(dá)；B1：DADS對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中uPA和MMP9蛋白表達(dá)的電泳圖；B2：DADS對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中uPA和MMP9蛋白表達(dá)的相對(duì)表達(dá)

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DADS隨處理濃度的增加，可明顯抑制MCF-7和MDA-MB-231兩種乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

侵襲/轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征，是腫瘤生長(zhǎng)發(fā)展過(guò)程中密不可分的相關(guān)階段[14]。在侵襲/轉(zhuǎn)移過(guò)程中，癌細(xì)胞與基底膜或細(xì)胞外基質(zhì)粘附，然后釋放和激活多種蛋白水解酶降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，在趨化因子、自分泌以及旁分泌生長(zhǎng)因子等作用下遷移到達(dá)靶組織，克隆增殖從而形成轉(zhuǎn)移灶[15]。Aharinejad等[10,16]的研究顯示,MMP9能降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，使基底膜完整性的破壞引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DADS抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的同時(shí)可顯著下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中MMP9的蛋白表達(dá)，可證實(shí)DADS對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用。

許多研究證實(shí)uPA在多種腫瘤中過(guò)表達(dá)，在腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中扮演重要角色[12]。通過(guò)DADS抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的同時(shí)可顯著下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中uPA的蛋白表達(dá)，則進(jìn)一步證實(shí)DADS對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的體外抑制作用。接下來(lái)將進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其在體內(nèi)是否具有一致作用并探討可能機(jī)制，以期為乳腺癌提供新的治療靶點(diǎn)并深入開(kāi)發(fā)DADS的抗腫瘤作用。

綜上所述，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)DADS顯著抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的同時(shí)可下調(diào)細(xì)胞中uPA和MMP9的蛋白表達(dá)。

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DiallylDisulfideInhibitstheInvasionandMigrationofBreastCancerCellsDown-regulatinguPAandMMP9

LIU Xiaowang,CHEN Xiaoxiao,ZHOU Zhigang,etal

(InstituteofPharmacyandPharmacology,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo explore the role of diallyl disulfide (DADS) on the invasion and migration of human breast cancer cells.MethodsMCF-7 and MDA-MB-231 human breast cancer cells were in vitro treated with different concentration (0,100,200,400 μmol/L) of DADS for 24h.Then,Transwell chamber assay and wound healing assay were used to detect the ability of cell invasion/migration.The protein expression of uPA and MMP9 were detected by western blot.ResultsDADS inhibited the invasion and migration of MCF-7 and MDA-MB-231 cells in a dose-dependent manner.At the same time,the invasion and migration-related protein expression of uPA and MMP9 were both down-regulated.ConclusionDADS could inhibit the invasion and migration of MCF-7 and MDA-MB-231 cells by down-regulating the protein expression of uPA and MMP9.

diallyl disulfide (DADS); human breast cancer cells; cell invasion; cell migration

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.02.002

2015-11-21；

2016-02-28

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201410555008)和湖南省大學(xué)生創(chuàng)新性課題(2014-234);湖南省中醫(yī)藥局課題(2014144);南華大學(xué)研究生創(chuàng)新性課題(2015XCX33);“湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心”培育項(xiàng)目(2014-405)和湖南省“十二五”重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目.

*：并列第一作者.

**通訊作者，E-mail:zhouzhigang0734@sina.com;E-mail:tujian0734@aliyun.com.

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蔣湘蓮)