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(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所 湖南 衡陽 421001；2.邵陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校醫(yī)學(xué)檢驗系；3.深圳市南山區(qū)婦幼保健院檢驗科)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

梅毒螺旋體粘附素Tp0751重組菌影的構(gòu)建與鑒定

江銀波1,曹二龍1,2,朱洪3,趙飛駿1,甄紅嬌1,張佳俐1,余堅1,曾鐵兵1*

(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所 湖南 衡陽 421001；2.邵陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校醫(yī)學(xué)檢驗系；3.深圳市南山區(qū)婦幼保健院檢驗科)

目的構(gòu)建梅毒螺旋體(Tp)粘附素Tp0751的重組大腸埃希菌菌影(E.colibacterial ghosts，EBG)，為深入評價其在抗Tp感染中的潛在免疫保護(hù)作用奠定基礎(chǔ)。方法將含有噬菌體PhiX174裂解基因E的質(zhì)粒pHH43轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，42 ℃溫控誘導(dǎo)使其形成EBG并計算裂解效率，用瓊脂糖DNA電泳和透射電鏡(TEM)鑒定EBG。構(gòu)建含有裂解基因盒E-box、膜錨定序列E′-linker及Tp0751目的基因的原核雙表達(dá)重組質(zhì)粒pET28a-E′-Tp0751-E-box，28 ℃誘導(dǎo)重組E.coliBL21表達(dá)Tp0751并用Western Blot鑒定；42 ℃誘導(dǎo)形成重組EBG(rEBG)，計算裂解效率并用DNA電泳和TEM鑒定。結(jié)果構(gòu)建的EBG裂解率為98.13%，DNA電泳未觀察到DNA條帶，TEM顯示絕大部分細(xì)菌都裂解成缺乏胞漿成分的細(xì)胞空殼并保持活菌基本形態(tài)。rEBG在28 ℃時高效表達(dá)重組Tp0751蛋白，且僅與梅毒患者血清特異性結(jié)合； 42 ℃下其rEBG裂解率為96.37%，電泳和TEM鑒定結(jié)果與EBG的相似。結(jié)論成功構(gòu)建表達(dá)Tp粘附素Tp0751的rEGB，其所表達(dá)目的蛋白具有良好免疫反應(yīng)性。

梅毒螺旋體；Tp0751；粘附素；菌影；大腸埃希菌

梅毒是由梅毒螺旋體(Treponemapallidum，Tp)感染引起的一種性傳播疾病(STD)，嚴(yán)重危害成人和新生兒健康，并明顯增加感染艾滋病風(fēng)險[1]。我國梅毒發(fā)病數(shù)近年來呈迅速上升趨勢[2]，但目前缺乏高效疫苗進(jìn)行預(yù)防[3]，這與Tp外膜蛋白不明確及相對落后的梅毒疫苗研究方法學(xué)等因素有關(guān)[3,4]?？拐掣胶筒ド⒆饔檬前l(fā)展梅毒疫苗的重要內(nèi)容[3,4]。Tp0751是目前已知最為重要的Tp粘附素分子[3,4]，還具有降解宿主蛋白的金屬蛋白酶活性[6,7]，導(dǎo)致Tp感染和擴(kuò)散；以重組Tp0751免疫血清體外能阻止Tp在培養(yǎng)細(xì)胞間擴(kuò)散[4]。因此，Tp0751成為最為理想的梅毒疫苗候選分子之一[3,4]，但目前尚未見評價其體內(nèi)免疫保護(hù)作用的研究報道。

保持重組抗原的天然構(gòu)象、選擇適當(dāng)?shù)目乖f送系統(tǒng)/佐劑對誘導(dǎo)機(jī)體高水平適應(yīng)性應(yīng)答至關(guān)重要。在當(dāng)今眾多的抗原遞送系統(tǒng)/佐劑中，菌影(Bacterial ghost，BG)是近乎完美的一種[9]。BG作為一種高效的遞送系統(tǒng)，能將外來蛋白抗原、核酸、藥物等錨定于胞膜或胞質(zhì)間隙[8]。理論上革蘭陰性菌均可作為BG，其中以大腸埃希菌(E.coli)最常見。本實驗采用單質(zhì)粒雙表達(dá)法構(gòu)表達(dá)Tp0751的重組EBG并對其鑒定，為深入探討其免疫保護(hù)作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料pHH43質(zhì)粒為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院王惠教授惠贈；E.coliDH5α、BL21、表達(dá)載體pET28a(+)、pET32a(+)為美國Novagen公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒與DNA純化試劑盒為美國Omega公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶(NcoI、BamHI、XhoI、BglII、kpnI、EcoRⅤ)、堿性磷酸酶(CIP)、T4 DNA連接酶購自美國NEB(北京)有限公司；DNA Marker購自廣州東盛生物科技有限公司；預(yù)染蛋白Marker為加拿大Fermentas公司產(chǎn)品；一抗為南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科經(jīng)TPPA和ELISA確診梅毒血清；二抗(HRP-羊抗小鼠)購自北京康為世紀(jì)有限公司。

1.2方法

1.2.1 EBG制備與裂解率計算 將質(zhì)粒pHH43轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，接種于含氯霉素(150 μg/mL)的LB平板上，28 ℃過夜培養(yǎng)；挑單個克隆接種于含氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖菌過夜培養(yǎng)，次日轉(zhuǎn)種28 ℃培養(yǎng)至OD600值為0.5時，升溫至42 ℃培養(yǎng)誘導(dǎo)細(xì)菌裂解，每30 min測定OD600值，當(dāng)OD600值降至0.3時，離心收集菌體，重懸于無菌水中，剩余菌液加入DNaseⅠ (3.3 μg/mL) ，充分混勻后靜置1 h，沉淀洗滌3次重懸于無菌水中，保存于4 ℃?zhèn)溆?。同時設(shè)置非誘導(dǎo)組作對照。將誘導(dǎo)前后的菌液離心，菌體沉淀經(jīng)稀釋后涂布于LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，次日計數(shù)菌落數(shù)目。根據(jù)菌落形成單位(CFU)計算裂解效率：裂解率= 1-(誘導(dǎo)后的CFU/誘導(dǎo)前的CFU)]×100%。

1.2.2 EBG鑒定 取制備好的20 μl BG用1%瓊脂糖凝膠電泳(取同體積對照菌液裂解去除蛋白后的上清液作對照)，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。新鮮制備的BG，經(jīng)PBS洗滌、固定、包埋、脫水和切片，透射電鏡觀察鑒定(由中南大學(xué)湘雅生物醫(yī)學(xué)電鏡實驗室完成)。

1.2.3 PCR擴(kuò)增膜錨定序列 膜錨定序列E′是pHH43質(zhì)粒上裂解基因E的第1～56位核苷酸，設(shè)計一對含linker(堿基序列為TACGCGCCGCAGGATCCT)的引物：P1：5′-GCGCCGCCATGGTACGCTGGACTTTGTG-3′(劃線處為NcoI酶切位點(diǎn))、P2：5′-AGGATCCTGCGGTGCATAGACGCTCGACGCCATT-3′ (劃線處為BamH I酶切位點(diǎn))，將linker序列設(shè)計在E′基因的3′端，便于與已構(gòu)建的pET28a-Tp0751(本研究所保存)上的Tp0751基因融合，引物由上海生工公司合成。PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒純化。

1.2.4 pET28a-E′-Tp0751表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定 將上述擴(kuò)增的E′-linker產(chǎn)物和已經(jīng)構(gòu)建好的pET28a-Tp0751均分別用NcoI和BamHI雙酶切，用T4連接酶連接得到后pET28a-E′-Tp0751表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化E.coliBL21，酶切鑒定和測序鑒定重組子。

1.2.5 重組質(zhì)粒pET32a-E-box與pET28a--E′-Tp0751-E-box構(gòu)建與鑒定 含裂解基因盒E-box的pHH43經(jīng)kpnI+EcoRⅤ雙酶切，與同樣雙酶切的載體pET-32a連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-E-box，再經(jīng)BglⅡ單酶切，將酶切完全的線性化載體 pET28a-E’-Tp0751通過柱離心的方法純化DNA，再溶在1×CIP 去磷酸化反應(yīng)緩沖液中，按每μg載體加0.5單位的酶，37 ℃溫育60 min，再次純化載體DNA。將經(jīng)BglⅡ單酶切的pET32a-E-box與同樣單酶切質(zhì)粒pET28a-E’-Tp0751連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET28a-E′-Tp0751-E-box，酶切與測序鑒定。

1.2.6 重組Tp0751-EBG制備與鑒定 以pHH43/DH5α為裂解陽性對照菌，將pET28a-E′-Tp0751-E-box轉(zhuǎn)化的E.coliBL21以終濃度1 mM的IPTG在28 ℃誘導(dǎo)90 min表達(dá)Tp0751后，迅速升溫至42 ℃熱誘導(dǎo)裂解，按上述方法觀察OD600值和收集BG，通過CFU計算裂解率。以梅毒陽性血清為一抗(1∶100)，正常人血清為陰性對照，Western Blot鑒定Tp0751的表達(dá)；用瓊脂糖凝膠電泳及透射電鏡觀察鑒定BG的形成。

2 結(jié) 果

2.1熱誘導(dǎo)E.coliDH5α(pHH43)裂解及裂解率計算三組細(xì)菌在28 ℃培養(yǎng)至OD600值為0.5后，將轉(zhuǎn)化與未轉(zhuǎn)化對照組升溫至42 ℃，轉(zhuǎn)化組OD600值在42 ℃誘導(dǎo)至90 min時開始下降，240 min左右時降到最低值；而42 ℃下未轉(zhuǎn)化組和保持28 ℃培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化組的OD600值均隨著培養(yǎng)延長而呈持續(xù)上升趨勢(圖1)。以上表明42 ℃下pHH43上E基因被激活導(dǎo)致E.coli裂解形成BG。BG裂解效率=[1-(30×104/160×105) ]×100% = 98.13%，即熱誘導(dǎo)后有98.13%左右細(xì)菌被裂解。

圖1 E.coli DH5α (pHH43)生長動態(tài)

2.2 EBG鑒定制備的E.coliDH5α BG和對照菌體經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，對照組有明顯的大小不等的 DNA 條帶，而BG組無條帶顯示，表明EBG內(nèi)DNA已隨菌體裂解而釋放 (圖2) 。TEM顯示，大部分細(xì)菌呈空泡狀結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)容物被排出，基本形態(tài)無明顯改變，未裂解的細(xì)菌(箭頭所指處)很少(圖3)。

2.3 pET28a-E′-Tp0751表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定PCR 擴(kuò)增 E’-Linker 基因得到一長度約180 bp的片段，與預(yù)期大小一致。酶切后的擴(kuò)增的E′-linker和pET28a-Tp0751的連接產(chǎn)物經(jīng)雙酶切鑒定(圖4)和測序鑒定，表明pET28a-E′-Tp0751載體構(gòu)建成功。

圖2 E.coli DH5α BG的DNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定 Note:1:DNA Marker;2:lysis of E.coli DH5α harboring pHH43;3:lysis of E.coli DH5α

圖3 E.coli DH5α BG的透射電鏡(TEM)圖

圖4 pET28a-E′-Tp0751酶切鑒定 Note:1:DNA Marker;2:pET28a-E’-Tp0751 digested with BamH I and Xho I;3:pET28a-E’-Tp0751 digested with Nco I and BamH I

2.4重組質(zhì)粒pET32a-E-box與pET28a-E’-Tp0751-E-box的構(gòu)建與鑒定重組質(zhì)粒pET32a-E-box經(jīng)BglⅡ或kpnI+EcoRⅤ酶切后，目的片段大小約1 435 bp，載體約為5 900 bp，初步表明該質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖5-A)。重組質(zhì)粒pET28a-E’-Tp0751-E-box 經(jīng)BglⅡ單酶切后，得到一約1435bp的目的條帶及一條與載體pET28a-E’-Tp0751單酶切后大小相當(dāng)?shù)?,104bp的片段(圖5-B)，測序結(jié)果顯示E-box核苷酸序列與理論序列完全相同，以上表明表達(dá)質(zhì)粒pET28a-E’-Tp0751-E-box構(gòu)建成功。

2.5重組BG中Tp0751蛋白表達(dá)與鑒定

pET28a-E′-Tp0751-E-box轉(zhuǎn)化的E.coliBL21經(jīng)28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)一分子量約28 KDa大小的明顯條帶(圖6-A)，結(jié)果顯示，純化的重組蛋白僅與梅毒陽性血清反應(yīng)(圖6-B)，表明該重組蛋白為Tp0751。在 42 ℃誘導(dǎo)重組BG 70 min后，OD600值開始下降，150 min后又開始上升。計算裂解率為96.37%。TEM顯示，大部分細(xì)菌都裂解成空泡狀的BG形式，形態(tài)完好，僅極少量裂解不完全。

圖5 pET32a-E-box (A)與pET28a-E’-Tp0751-E-box (B)的酶切鑒定 Note:A.1:DNA Marker;2,4:pET32a-E’-box digested with kpn I and EcoRⅤ;3,5:pET32a-E’-box digested with BglⅡ,B.1:DM10000;2:pET28a-E’-Tp0751 digested with BglⅡ;3:pET28a-E’-Tp0751-E-box digested with BglⅡ

圖6 重組EBG中Tp0751的表達(dá)(A)與鑒定(B) Note:A.1:Protein marker;2,3:uninduced pET28a-E’-Tp0751-E-box/BL21;4,5:induced pET28a-E’-Tp0751-E-box/BL21,B.1-3:Syphilitic serum.1:pET28a /BL21;2,3:pET28a-E′-Tp0751-E-box/BL21;4:Healthy serum.pET28a-E′-Tp0751-E-box/BL21

3 討 論

BG是一種裂解E基因被激活后表達(dá)裂解蛋白后導(dǎo)致革蘭陰性細(xì)菌裂解、釋放胞漿和核酸而形成的空細(xì)菌體[8]。裝載外源目的基因的重組BG在較低溫度(如28 ℃)時誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，再通過較高溫度(如42 ℃)時激活表達(dá)質(zhì)粒中的裂解基因E表達(dá)E蛋白，裂解宿主菌而形成BG。雙鏈 DNA 噬菌體至少需兩個編碼基因激活來裂解宿主細(xì)胞，而單鏈DNA噬菌體PhiX174只需單一的裂解E基因就能誘導(dǎo)宿主菌裂解[9]。本研究選擇的pHH43是人工構(gòu)建的新一代裂解質(zhì)粒，含有裂解基因盒E-box，即裂解基因E和相應(yīng)的調(diào)控組件λP Rmut啟動子/CI857抑制子序列。本研究瓊脂糖電泳和電鏡結(jié)果顯示，E.coliDH5α BG及Tp0751重組BL21 BG均充分釋放胞內(nèi)核酸且保持基本形態(tài)，裂解效率達(dá)到98%以上，表明42 ℃下pHH43的E基因表達(dá)產(chǎn)物具有強(qiáng)大的裂解效率。

本研究中采用單質(zhì)粒雙基因表達(dá)系統(tǒng)，即將表達(dá)E蛋白的E-box和表達(dá)錨定Tp0751的E′-Tp0751構(gòu)建在一個表達(dá)質(zhì)粒pET28a中，該重組質(zhì)粒包含T7Lac啟動子下的Tp0751表達(dá)系統(tǒng)和λPRmut啟動子/CI857 抑制子調(diào)控的E 基因表達(dá)系統(tǒng)[10]。采用單質(zhì)?？山鉀Q雙質(zhì)粒在同一宿主菌的拷貝限制問題，以pET28a作為最終表達(dá)載體，因其是一種用于在E.coli中的高效表達(dá)載體，克隆到該質(zhì)粒的目的基因受噬菌體T7強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號控制，表達(dá)由宿主細(xì)胞提供的T7RNA聚合酶誘導(dǎo)。本研究表明，28 ℃下誘導(dǎo)了Tp0751的高水平表達(dá)，而42 ℃下又誘導(dǎo)E蛋白表達(dá)，高效裂解形成BG。

外源目的蛋白可以通過錨定蛋白OmpA、E’和L’、SbsA以融合蛋白形式分別被錨定在BG的外膜、內(nèi)膜、周質(zhì)間隙胞漿[8]，其中E’ 錨定蛋白最為常用。作為膜錨定序列，構(gòu)象應(yīng)以疏水的α螺旋為優(yōu)，無裂解細(xì)胞效應(yīng)，抗酶解且具有與細(xì)胞膜整合功能。本研究中選擇的膜錨定蛋白是噬菌體phiX174上的裂解蛋白E的第1～54位氨基酸，其編碼基因序列明確，可直接從裂解E基因中克隆獲得；其N段30個氨基酸基本屬于強(qiáng)疏水區(qū)，構(gòu)象主要為α螺旋。此外，E’ 錨定目的蛋白后不會干擾后者空間構(gòu)象的正確折疊[11]。動物實驗也表明，內(nèi)膜表達(dá)HIV-1 RT和HIV-1 gp41蛋白的重組BG能誘導(dǎo)明顯的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)[12]。膜錨定序列與重組目的蛋白之間需要靠一段柔性疏水的氨基酸序列即 linker 來連接，本研究中選用的linker由6個氨基酸組成，含有兩個脯氨酸殘基，具有良好的柔韌性。

總之，本研究成功構(gòu)建了表達(dá)Tp0751的重組EBG，為后續(xù)探討其免疫原性和免疫保護(hù)性奠定了基礎(chǔ)。

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ConstructionandIdentificationofRecombinantE.coliBacterial
GhostsExpressingTreponemaPallidumAdhesinTp0751

JIANG Yinbo,CAO Erlong,ZHU Hong,etal

(InstitutionofPathogenicBiology,MedicalCollege,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo construct the recombinantE.colibacterial ghosts (EBG) expressing Treponema pallidum(Tp) adhesin Tp0751 and to further investigate its potential immunoprotection against Tp infection.MethodsE.coliDH5α cells transformed with the plasmids pHH43,containing phagephiX174 lysis E gene,were induced at 42 ℃ to produce EBG.The lysis rate was calculated and EBG were identified by DNA agarose gel electrophoresis and Transmission Electron Microscope (TEM).E.coliBL21 cells with prokaryotic double expression recombinant plasmids pET28a-E′-Tp0751-E-box,containing lysis gene cassette (E-box),membrane anchor sequence E’-linker and target gene Tp0751,were induced to express recombinant prtotein Tp0751 at 28 ℃ and to generate EBG at 42 ℃.Recombinant Tp0751 was identified by western blot.The lysis rate of recombinant EBG(rEBG) was calculated,DNA agarose gel electrophoresis and TEM were used to identify the EBG.ResultsThe lysis rate of EBG was 98.13%.No DNA ladder was observed by DNA gel electrophoresis and TEM showed that the vast majority of bacteria were lysed into empty cell envelopes lacking cytoplasmic content yet retaining unaltered morphological features of their living counterparts.At 28 ℃,rEBG effectively expressed Tp0751 that were specifically reactive with syphilitic sera by Western blot.At 42 ℃,the lysis rate of rEBG was 96.37%.and similar to EBG tested by electrophoresis and TEM.ConclusionThe recombinant EBG expressing Tp0751 are successfully constructed and expressed Tp0751 shows good immunoreactivity.

Treponemapallidum; Tp0751; adhesion; bacterial ghost; Esherichia coli

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.02.001

2016-02-24；

2016-03-10

國家自然科學(xué)基金(No.81273322)；湖南省教育廳開放創(chuàng)新平臺基金(No.15K110)；湖南省教育廳資助科研項目(No.15C1256)；湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心(湘教通[2014])405號)；湖南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊支持計劃資助(湘教通[2010]53號).

*通訊作者，E-mail：nhdxztb@126.com.

R377.1

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秦旭平)