肖星 張軍民 馮姣 陳志文 陳春梅 何婭 賀丹 孫九峰 席麗艷

(1.中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院皮膚科，廣州 510120；2.吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病原生物學系，吉林大學真菌研究中心·教育部人獸共患病重點實驗室，長春 130021；3.廣東省疾病預防控制中心，廣州 510120)

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·論著·

Fonsecaeamonophora多聚酮合酶基因的擴增及敲除載體的構(gòu)建

肖星1張軍民1馮姣1陳志文1陳春梅1何婭1賀丹2孫九峰3席麗艷1

(1.中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院皮膚科，廣州 510120；2.吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病原生物學系，吉林大學真菌研究中心·教育部人獸共患病重點實驗室，長春 130021；3.廣東省疾病預防控制中心，廣州 510120)

目的 擴增Fonsecaeamonophora中控制黑素合成的多聚酮合酶 (polyketide synthases，PKS)基因并測序，構(gòu)建PKS基因敲除載體。方法 擴增PKS基因，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計引物，從Fonsecaeamonophora基因組DNA擴增PKS基因5’-同源臂和3’-同源臂，從質(zhì)粒pBHt1中擴增潮霉素B抗性標記基因 (hyg)，最后將各片段插入載體PDHt/sk中。結(jié)果 測序得到5 389 bp大小的PKS基因序列，構(gòu)建了PKS基因的敲除載體，用酶切及測序等方法鑒定載體構(gòu)建成功。結(jié)論 成功構(gòu)建FonsecaeamonophoraPKS基因敲除載體，為研究PKS基因及黑素的生物學功能奠定了良好的基礎(chǔ)。

Fonsecaeamonophora；多聚酮合酶基因；根癌農(nóng)桿菌；載體構(gòu)建

[Chin J Mycol，2016，11(2):70-74]

黑素是一類常見于微生物和動植物體內(nèi)的非均質(zhì)、高分子量、多功能、結(jié)構(gòu)復雜的聚合體，具有帶負電荷、疏水、不溶于酸和大部分有機溶劑等特點。黑素是真菌細胞壁的重要成分，具有吸收紫外線、抗氧化、抗溶菌酶、增強病原真菌表面的黏附性，抵御宿主吞噬細胞的吞噬，緩沖外界不良環(huán)境對細胞的傷害作用[1]。另外，一些研究表明，黑素具有免疫活性，與病原真菌致病關(guān)系密切，它能影響細胞因子的分泌，調(diào)節(jié)宿主免疫類型[2-3]。在真菌黑素的合成途徑中，兩種最重要的途徑分別是1,8-二羥基萘 (DHN)途徑和二羥苯基丙氨酸 (DOPA)途徑，合成兩種不同黑素，即DHN-黑素和DOPA-黑素。不同真菌合成黑素的途徑不同，DHN-黑素主要見于子囊菌真菌，是著色霉菌屬的重要特征[4-5]。多聚酮合酶 (polyketide synthases，PKS)是控制DHN-黑素合成的關(guān)鍵酶，故常被用作獲得黑素合成缺陷株的突變靶位，從而研究黑素在病原真菌中的作用。

Fonsecaeamonophora是從多株裴氏著色霉 (Fonsecaeapedrosoi)菌株中發(fā)現(xiàn)的一種新種，被證實為我國南方地區(qū)著色芽生菌病 (Chromoblastomycosis，CBM)的主要致病菌[6-7]。研究證明，F(xiàn).monophora能夠抑制TH1和TH17型免疫反應，誘導宿主細胞向TH2型免疫轉(zhuǎn)換，導致固有免疫的不足，感染慢性化[8]。在新生隱球菌感染的鼠模型中，無色素減毒株能更強的誘導T細胞介導的保護性反應，其TNF-α、IL-12、iNOS轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，用減毒株免疫過的小鼠再次注射野生株，其存活時間延長[9]。黑素為何導致宿主對F.monophora免疫反應差異，是否參與F.monophora和宿主的相互識別過程，是否與感染慢性化相關(guān)，尚不十分明確。本研究設(shè)計引物擴增F.monophoraPKS基因并測序，構(gòu)建PKS基因的敲除載體，以期利用根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù) (Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation，ATMT)獲得PKS基因缺陷株，為研究F.monophoraPKS基因及黑素的生物學功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

F.monophora是本實驗室鑒定并保存的特有的分生孢子變異株CBS122845 (SUMS0505)，于2009年分離自一位81歲男性患者皮損。質(zhì)粒PDHt/sk由北大醫(yī)院李若瑜實驗組饋贈。pBHt1雙元載體質(zhì)粒提供潮霉素B抗性標記基因 (hyg)，由吉林大學白求恩醫(yī)學院王麗教授饋贈。In-fusion?HD Cloning Kit (美國Clontech公司)；Q5?High-Fidelity DNA Polymerase (美國NEB公司)。Pfu DNA Polymerase、切膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、D2000 DNA Marker、1kb DNA Marker、TOP10感受態(tài)細胞 (北京天根生化科技有限公司)。PrimerSTAR Max DNA Polymerase、dNTPs (2.5 mmol/L )、HindⅢ限制性內(nèi)切酶 (大連寶生物工程有限公司)。PCR儀 (美國伯樂BIO-RAD公司)。擴增F.monophoraPKS基因及敲除PKS基因的相關(guān)引物如表1所示。所有引物合成 (PAGE純化方式)及測序工作由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2 方法

F.monophora基因組的抽提 將F.monophora接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7 d，刮取適量菌，液氮研磨后，采用酚/氯仿抽提法提取基因組DNA。

確定F.monophoraPKS基因序列并設(shè)計引物 在前期的研究中，通過對F.monophora轉(zhuǎn)錄組的測序，獲得了PKS基因的cDNA全長序列。并在NCBI上的BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對cDNA序列進行比對，經(jīng)過同源性分析，根據(jù)與同源基因的比較，獲得了5 326 bp大小的PKS基因序列，用primer primer 5.0 (PP5)軟件針對PKS基因設(shè)計引物F1、F2 (見表1)。

表1 引物序列

注：15 bp的同源序列用小寫字母表示

擴增PKS基因 因PKS基因片段總長5 300 bp左右，為大片段，普通的Taq酶難以滿足要求，兼測序需要高保真性，因此本實驗采用了保真性能高的Q5?High-Fidelity DNA Polymerase。PCR反應體系：模板DNA 1 μL，5×Q5反應緩沖液10 μL，dNTPs (2.5 mmol/L )4 μL，Q5?High-Fidelity DNA Polymerase 0.5 μL，5×Q5 High GC Enhancer (GC≥65%時可選)10 μL，引物1 (10 μmol/L)2.5 μL，引物2 (10 μmol/L)2.5 μL，加水補齊至50 μL。擴增程序為：98℃預變性30 s；98℃變性8 s，56℃退火20 s，72℃延伸3 min，35個循環(huán)，最后72℃延伸2 min。電泳，利用切膠回收試劑盒回收目的片段，送測序。

設(shè)計引物擴增同源序列及抗性標記基因 采用傳統(tǒng)的同源重組方法設(shè)計F.monophoraPKS基因根癌農(nóng)桿菌敲除載體，即在潮霉素抗性標記基因的兩端分別連接F.monophoraPKS基因的5’-同源臂和3’-同源臂。In-fusion技術(shù)的原理是在擴增目的片段的過程中由引物5’添加待連接片段的15 bp同源序列，從而實現(xiàn)任意片段融合。根據(jù)引物設(shè)計的一般原理和In-fusion引物15 bp同源序列添加原理，分別設(shè)計待敲除區(qū)域的5’-同源臂 (1 303 bp)和3’-同源臂 (1 331 bp)引物，即引物對F3/F4和F7/F8 (見表1)；同理設(shè)計引物擴增潮霉素抗性標記基因，即引物對F5/F6 (見表1)。各引物的5’端為待連接片段的15 bp同源序列。

獲取目的片段及線性化載體 選取Q5?High-Fidelity DNA Polymerase擴增各目的片段。PCR反應體系：模板DNA (F.monophora基因組DNA、pBHt1質(zhì)粒)1 μL，5×Q5反應緩沖液10 μL，dNTPs (2.5 mmol/L)4 μL，Q5高保真DNA聚合酶0.5 μL，5×Q5 High GC Enhancer (GC≥65%時可選)10 μL，引物1 (10 μmol/L)2.5 μL，引物2 (10 μmol/L)2.5 μL，加水補齊至50 μL。擴增程序為：98℃預變性30 s；98℃變性8 s，56℃退火20 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后72℃延伸2 min。電泳，回收目的條帶。酶切體系：10×QC Green Buffer 5 μL，PDHt/sk質(zhì)粒3 μL (1 000 ng/μL)，HindⅢ 1 μL，加水補齊至50 μL。反應條件為：37℃，5 min。電泳，回收目的條帶。

多個片段載體構(gòu)建 依照回收目的片段的濃度，各目的片段分別加1 μL，線性化載體加3 μL，5×In-Fusion HD Enzyme Premix加2 μL，ddH2O補齊至10 μL。50℃反應15 min后，取連接產(chǎn)物5 μL用于轉(zhuǎn)化50 μL的大腸桿菌 (TOP10)，經(jīng)菌液PCR及測序獲得目的克隆。

重組質(zhì)粒酶切驗證 挑取測序正確的單克隆，200 r/min培養(yǎng)過夜，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，采用ApaⅠ單切，BamHⅠ單切，KpnⅠ單切，BamHⅠ和KpnⅠ雙切，ApaⅠ和BamHⅠ雙切驗證。酶切體系：10×QC Green Buffer 5 μL，重組質(zhì)粒3 μL (1 000 ng/μL)，酶1 μL，加水補齊至50 μL。反應條件為：37℃，5 min。電泳檢測酶切結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1F.monphoraPKS基因片段擴增及測序結(jié)果

本實驗選取PrimerSTAR Max DNA Polymerase、Pfu DNA Polymerase、Q5?High-Fidelity DNA Polymerase三種高保真酶擴增PKS基因，電泳結(jié)果顯示僅Q5?High-Fidelity DNA Polymerase獲得目的片段，長度約為5 300 bp (見圖1)。通過分析測序結(jié)果，獲得了5 389 bp大小的F.monophoraPKS基因序列。

2.2 目的片段擴增結(jié)果

以F.monophora基因組DNA為模板，表1中的F3/F4引物，擴增PKS基因5’端1 303 bp的DNA片段，F(xiàn)7/F8引物，擴增PKS基因3’端的1 331 bp的DNA片段，以pBHt1為模板，F(xiàn)5/F6引物，擴增潮霉素抗性標記基因共1 601 bp (見圖2)。

2.3 目的片段與載體連接、轉(zhuǎn)化結(jié)果

混合克隆片段按1.2中“設(shè)計引物擴增同源序列及抗性標記基因”的條件進行連接，即得到敲除載體 (見圖3)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 (Top10)，取200 μL涂布于含50 mg/mL卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)16 h后，觀察菌落 (見圖4)。挑取克隆，37℃，200 r/min培養(yǎng)2 h，用F3、F4引物進行菌液驗證，選取陽性克隆菌株酶切驗證，送測序。

2.4 重組質(zhì)粒的酶切驗證及測序結(jié)果

ApaⅠ、BamHⅠ和KpnⅠ為單切位點，片段大小為11 718 bp，BamHⅠ和KpnⅠ雙切應該切下4 307 bp大小的目的條帶，ApaⅠ和BamHⅠ雙切應該切下4 301 bp大小的目的條帶 (見圖5)。選取酶切結(jié)果正確的質(zhì)粒和引物對F1/F2，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司雙向測通插入片段 (4 253 bp)，并與目的序列通過Vector NTI (Invitrogen公司，美國)軟件進行比對，結(jié)果與目的序列100%相同。

圖1 PKS基因PCR擴增結(jié)果 (Marker.1 kb DNA Marker,1.PrimerSTAR Max DNA Polymerase PCR結(jié)果,2.Pfu DNA Polymerase PCR結(jié)果,3.Q5?High-Fidelity DNA Polymerase PCR結(jié)果) 圖2 目的片段PCR擴增結(jié)果 (Marker.D2000 DNA Marker,1.PKS上游序列片段,2.潮霉素B抗性基因片段,3.PKS下游序列片段) 圖3 PKS基因敲除載體圖譜 圖4 大腸桿菌轉(zhuǎn)化結(jié)果 圖5 重組質(zhì)粒酶切驗證結(jié)果 (M.D5000 DNA Marker,1.ApaⅠ酶切結(jié)果,2.BamHⅠ酶切結(jié)果,3.KpnⅠ酶切結(jié)果,4.BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切結(jié)果,5.ApaⅠ和BamHⅠ雙酶切結(jié)果)

Fig.1 PCR results of PKS (Marker.1 kb DNA Marker,1.PCR result of PrimerSTAR Max DNA Polymerase,2.PCR result of Pfu DNA Polymerase,3.PCR result of Q5?High-Fidelity DNA Polymerase) Fig.2 PCR results of target fragment (Marker.D2000 DNA Marker,1.upstream of PKS fragment,2.hygromycin B resistance gene,3.downstream of PKS fragment) Fig.3 The picture of PKS knockout vector Fig.4 Result of escherichia coli transformation Fig.5 Results of recombinant plasmid verified by digestion (M.D5000 DNA Marker,1.Result ofApaⅠ digestion,2.Result ofBamHⅠ digestion,3.Result ofKpnⅠ digestion,4.Result ofBamHⅠ andKpnⅠ digestion,5.Result ofApaⅠ andBamHⅠ digestion)

3 討 論

PKS基因編碼的多聚酮合酶被認為是子囊菌真菌中DHN-黑素合成途徑的限速酶。Feng B等[10]通過打斷皮炎外瓶霉的PKS基因，成功獲得了黑素缺陷株，此種缺陷株的毒力明顯下降，且對中性粒細胞的抵抗能力減弱。Paolo WJ[11]的研究證實，PKS基因缺陷的皮炎外瓶霉細胞壁表面的高電子密度顆粒層出現(xiàn)缺失，且表現(xiàn)出對伏立康唑、兩性霉素B等抗真菌藥物的敏感性增強。由此可見，PKS基因在黑素合成過程中起至關(guān)重要的作用，而PKS基因缺陷的菌株不僅致病性降低，對多種抗真菌藥物敏感性也有增強。

F.monophora是我國南方著色芽生菌病的主要病原體，但國內(nèi)外并無針對F.monophora的PKS基因功能學的研究。在前期的實驗中，我們通過對F.monophora基因轉(zhuǎn)錄組進行分析，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生大量黑素色素株CBS122845 (SUMS0505)與白化突變株CBS125149 (SUMS0510)間PKS基因表達差異明顯 (數(shù)據(jù)未發(fā)表)。研究還發(fā)現(xiàn)色素株能夠上調(diào)IL-10等TH2細胞因子，下調(diào)IL-12、TNF-α等TH1細胞因子，抑制巨噬細胞對其的炎癥反應[12]。通過建立F.monophora與小鼠巨噬細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)色素株組與白化突變株組中巨噬細胞Dectin-1、TLR-2、TLR-4等受體表達存在差異[13]。為更深入地探討為何色素株和白化突變株會導致宿主免疫反應的差異，黑素及PKS基因在其中起到的作用，本實驗選取PKS基因為研究對象，以期闡明PKS基因的生物學功能。

根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)被廣泛應用于真菌基因功能的研究。目前，ATMT技術(shù)已成功運用于多種真菌，如煙曲霉[14]、土曲霉[15]、申克孢子絲菌[16]、馬爾尼菲青霉[17]、尖孢鐮刀菌[18]等?；虻那贸椒ㄓ胁迦敕ā⑼粗亟M法、基因沉默的RNAi和近幾年興起的Crispr/Cas9等方法，但是對于穩(wěn)定敲除株的獲取，傳統(tǒng)的同源重組方法有無可替代的穩(wěn)定性和優(yōu)勢。本研究獲得了5 389 bp大小的F.monophoraPKS基因序列，且成功構(gòu)建了由根癌農(nóng)桿菌介導的PKS基因敲除載體，為研究F.monophora的PKS基因及黑素的生物學功能奠定了基礎(chǔ)。

[1] 周真，杜妍嫻，李希清.黑色素與常見病原真菌致病性的關(guān)系[J].中國真菌學雜志,2011(06):373-376.

[2] Da Silva MB,Marques AF,Nosanchuk JD,et al.Melanin in the dimorphic fungal pathogenParacoccidioidesbrasiliensis:effects on phagocytosis,intracellular resistance and drug susceptibility[J].Microbes Infect,2006,8(1):197-205.

[3] Nosanchuk JD,Casadevall A.Impact of melanin on microbial virulence and clinical resistance to antimicrobial compounds[J].Antimicrob Agents Chemother,2006,50(11):3519-3528.

[4] Cunha MM,Franzen AJ,Seabra SH,et al.Melanin inFonsecaeapedrosoi:a trap for oxidative radicals[J].BMC Microbiol,2010,10(16):80.

[5] Pal AK,Gajjar DU,Vasavada AR.DOPA and DHN pathway orchestrate melanin synthesis inAspergillusspecies[J].Med Mycol,2014，52(1):10-18.

[6] Queiroz-Telles F,Esterre P,Perez-Blanco M,et al.Chromoblastomycosis:an overview of clinical manifestations,diagnosis and treatment[J].Med Mycol,2009,47(1):3-15.

[7] Xi L,Sun J,Lu C,et al.Molecular diversity ofFonsecaea(Chaetothyriales) causing chromoblastomycosis in southern China[J].Med Mycol,2009,47(1):27-33.

[8] Wevers B A,Kaptein TM,Zijlstra-Willems E M,et al.Fungal engagement of the C-type lectin mincle suppresses dectin-1-induced antifungal immunity[J].Cell Host Microbe,2014,15(4):494-505.

[9] Barluzzi R,Brozzetti A,Mariucci G,et al.Establishment of protective immunity against cerebral cryptococcosis by means of an avirulent,non melanogenicCryptococcusneoformansstrain[J].J Neuroimmunol,2000,109(2):75-86.

[10] Feng B,Wang X,Hauser M,et al.Molecular cloning and characterization of WdPKS1,a gene involved in dihydroxynaphthalene melanin biosynthesis and virulence inWangiella(Exophiala)dermatitidis[J].Infect Immun,2001,69(3):1781-1794.

[11] Paolo WJ,Dadachova E,Mandal P,et al.Effects of disrupting the polyketide synthase gene WdPKS1 inWangiella[Exophiala]dermatitidison melanin production and resistance to killing by antifungal compounds,enzymatic degradation,and extremes in temperature[J].BMC Microbiol,2006,6:55.

[12] Zhang J,Wang L,Xi L,et al.Melanin in a meristematic mutant ofFonsecaeamonophorainhibits the production of nitric oxide and Th1 cytokines of murine macrophages[J].Mycopathologia,2013,175(5-6):515-522.

[13] 蔣麗，張軍民，孫九峰，等.Fonsecaeamonophora對巨噬細胞TLR2、TLR4、Dectin-1和TNF-α表達的影響[J].中國真菌學雜志,2014,9(3):134-138.

[14] Sugui JA,Chang YC,Kwon-Chung KJ.Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation ofAspergillusfumigatus:an efficient tool for insertional mutagenesis and targeted gene disruption[J].Appl Environ Microbiol,2005,71(4):1798-1802.

[15] Wang D,He D,Li G,et al.An efficient tool for random insertional mutagenesis:Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of the filamentous fungusAspergillusterreus[J].J Microbiol Methods,2014,98(13):114-118.

[16] Zhang Y,Li G,He D,et al.Efficient insertional mutagenesis system for the dimorphic pathogenic fungusSporothrixschenckiiusing Agrobacterium tumefaciens[J].J Microbiol Methods,2011,84(3):418-422.

[17] Kummasook A,Cooper CR,Vanittanakom N.An improvedAgrobacterium-mediated transformation system for the functional genetic analysis ofPenicilliummarneffei[J].Med Mycol,2010,48(8):1066-1074.

[18] Mullins ED,Chen X,Romaine P,et al.Agrobacterium-mediated transformation ofFusariumoxysporum:an efficient tool for insertional mutagenesis and gene transfer[J].Phytopathology,2001,91(2):173-180.

[本文編輯] 王 飛

The amplification and targeting vector construction of a polyketide synthases gene ofFonsecaeamonophora

XIAO Xing1,ZHANG Jun-min1,FENG Jiao1,CHEN Zhi-wen1,CHEN Chun-mei1,HE Ya1,HE Dan2,SUN Jiu-feng3,XI Li-yan1

(1.DepartmentofDermatology,SunYat-SenHospital,SunYat-SenUniversity,Guangzhou510120,China;2.DepartmentofPathogenobiology,JilinUniversityMycologyResearchCenter,CollegeofBasicMedicalSciences,JilinUniversity,Changchun130021,China;3.GuangdongProvincialCenterforDiseaseandPrevention,Guangzhou510120,China)

Objective To amplify and sequence a polyketide synthases gene ofFonsecaeamonophora,and to construct its targeting vector.Methods A polyketide synthases gene ofFonsecaeamonophorawas amplified and sequenced.Then we designed primers to amplify the 5’ and 3’ flanking region of PKS gene fromFonsecaeamonophoragenomic DNA,and the Hygromycin B resistance gene (hyg) from plasmid pBHt1.At last,all fragments were inserted into the vector PDHt/sk.Result The sequence of PKS gene was acquired,and its length was 5 389 bp.The targeting vector of PKS gene was constructed,and the vector was identified by restriction enzyme digestion and nucleotide sequencing.Conclusion This study acquired the targeting vector of PKS gene ofFonsecaeamonophorasuccessfully,and laid a good foundation for biological functions research of PKS gene and melanin.

Fonsecaeamonophora；polyketide synthases gene；Agrobacteriumtumefaciens；vector construction

國家自然科學基金 (81571970)

肖星，女 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:136591052@qq.com

張軍民，E-mail:junminmx@163.com

R 379.9

A

1673-3827(2016)11-0070-05

2015-12-22