金龍哲，車成來，王霞，王宇輝，王欣宇，林花

(延邊州農(nóng)業(yè)科學院，吉林延吉133001)

?

有機靈芝破壁孢子粉增強免疫力功能的實驗研究

金龍哲，車成來，王霞，王宇輝，王欣宇，林花＊

(延邊州農(nóng)業(yè)科學院，吉林延吉133001)

選用小鼠為實驗對象，隨機分成實驗組和對照組。實驗組分別按3.33g、6.67g、20.00g加蒸餾水定容至200mL，按0.2mL/10g·bw體積給小鼠灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃至少30d。對照組灌胃予以等體積的蒸餾水。進行遲發(fā)型變態(tài)反應、ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗、抗體生成細胞檢測、半數(shù)溶血值(HC50)的測定、小鼠碳廓清實驗、小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗、NK細胞活性的測定實驗。結(jié)果表明：經(jīng)口灌胃給予小鼠不同劑量的靈芝破壁孢子粉30d，能顯著提高小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應能力、NK細胞活性、抗體生成細胞數(shù)、半數(shù)溶血值。靈芝破壁孢子粉具有增強小鼠免疫力作用。

有機靈芝；破壁孢子粉；免疫調(diào)節(jié)；小鼠

靈芝孢子粉(Ganodermaspore)，是靈芝在生長成熟期，從靈芝菌蓋彈射出來的極其微小的卵形生殖細胞即靈芝的種子。每個靈芝孢子只有4～6μm，是活體生物體，雙壁結(jié)構(gòu)，外被堅硬的幾丁質(zhì)纖維素所包圍，人體很難充分吸收。破壁后更適合人體腸胃直接吸收，它是靈芝的精華部分，具有靈芝的全部遺傳物質(zhì)和保健作用[1]。它具有增強機體免疫力[2]、抑制腫瘤[3]、 降血糖[4]、降血脂[5]、護肝[6]、 抗病毒[7]、抗輻射等多種藥理作用。 長白山有機靈芝是在長白山區(qū)獨特的冷涼氣候條件下按國際有機靈芝栽培規(guī)范栽培的有機靈芝[G.lucidum(Leyss ex Fr.)Krast]，本研究利用長白山有機靈芝破壁孢子粉對實驗小鼠進行了免疫調(diào)節(jié)功能試驗，為其功能性食品的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品：由延邊州農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)特產(chǎn)品加工研究所提供，人口服推薦劑量為每日4g，成人體重按60kg計算，折合劑量0.0667g/kg·bw。

1.2 實驗動物與分組：湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(湘)2011-0003)提供的SPF級ICR種雌性小鼠200只，體重18～22g。每40只小鼠為1大組，共5大組。免疫Ⅰ組，進行碳廓清實驗；免疫Ⅱ組，進行ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗、NK細胞的活性測定；免疫Ⅲ組，進行臟體比值測定、半數(shù)溶血值(HC50)的測定和抗體生成細胞數(shù)的測定；免疫Ⅳ組，進行遲發(fā)型變態(tài)反應實驗；免疫Ⅴ組，進行小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗。每大組40只小鼠按體重隨機分為4小組，即對照組和低、中、高劑量組。

1.3 實驗條件：為屏障環(huán)境，實驗期間環(huán)境溫度23～24℃，濕度54%～58%，實驗動物使用許可證號為SYXK(湘)2010-0011。

1.4 劑量選擇及樣品處理：據(jù)人體口服推薦量，設(shè)有機靈芝破壁孢子粉低、中、高劑量分別為0.333、0.667、2.000g/kg·bw(分別相當于人體推薦劑量的5倍、10倍、30倍)。試驗時，分別取有機靈芝破壁孢子粉3.33、6.67、20.00g加蒸餾水定容至200mL，按0.2mL/10g·bw體積給小鼠灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃至少30d。對照組灌胃予以等體積的蒸餾水。

1.5 主要儀器與試劑

動物臺秤、分析天平、潔凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機、722分光光度計、恒溫水浴箱、酶標儀、顯微鏡等。

無菌手術(shù)器械、游標卡尺、微量注射器、細胞計數(shù)器、24孔和96孔平底細胞培養(yǎng)板、96孔U型細胞培養(yǎng)板、玻璃平皿、紗布、試管、玻片架、200目篩網(wǎng)、計時器、血色素吸管、載玻片等。

SRBC、生理鹽水、Hank’s液、RPMI1640培養(yǎng)液、小牛血清、青鏈霉素、ConA、1%冰醋酸、1mol/L的HCl溶液、酸性異丙醇、MTT、PBS緩沖液(pH7.2～7.4)、補體(豚鼠血清)、SA緩沖液、瓊脂糖、都氏試劑、YAC-1細胞、乳酸鈉、硝基氧化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸鹽、氧化型輔酶I、0.2mol/L的Tris-HCl緩沖液、2.5%Triton、印度墨汁、0.1%碳酸鈉、雞紅細胞、甲醇、Giemsa染液等。

1.6 實驗方法

1.6.1 臟器/體重比值測定。稱重后處死小鼠，取出脾臟和胸腺，在電子分析天平上稱重，計算臟/體比值。

1.6.2 遲發(fā)型變態(tài)反應(DTH)(足跖增厚法)。小鼠腹腔注射2%(v/v)SRBC(0.2mL/每鼠)致敏后4天，測量左右足跖部厚度，然后在測量部位皮下注射20%(v/v)SRBC(20μL/每鼠),于注射后24h測量左右足跖部厚度，同一部位測量3次，取平均值。以攻擊前后足跖厚度差值(足跖腫脹度)來表示DTH的程度[3]。

1.6.3 ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗(MTT法)。無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’s液的小平皿中，制成細胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾。用Hank’s液洗2次，每次離心10min(1000r/min)。然后將細胞懸浮于1mL完全培養(yǎng)液中，計數(shù)活細胞數(shù)，用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為3×106個/mL。再將細胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1mL，在其中一孔加75μLConA液(相當于7.5μg/mL)，另一個孔作為對照，置5%二氧化碳培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔輕輕吸去上清液0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每孔作3個平行孔，用酶標儀，以570nm波長測定光密度值。淋巴的增值能力用加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值表示[8]。

1.6.4 抗體生成細胞檢測(Jerne改良玻片法)。取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心(2000r/min)，將壓積SRBC用生理鹽水配成2%(v/v)的細胞懸液，200目篩網(wǎng)過濾，洗滌、離心2次，最后將細胞懸浮在8 mLHank’s液中，計數(shù)細胞，并將細胞濃度調(diào)整為5×106個/ mL。將表層培養(yǎng)基加熱溶解后與等量的pH7.4/2倍濃度的Hank’s液混合，分裝小試管，每管0.5 mL，再向管內(nèi)加入用SA液配制的10%SRBC 50μL(v/v)、20μL脾細胞懸液(5×106個/mL)，迅速混勻后傾倒于已刷薄層瓊脂糖的玻片上，待瓊脂糖凝固后將玻片水平扣放在玻片架上，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中溫育1.5h，然后用SA液稀釋的補體(1∶8)加入到玻片凹槽內(nèi)，繼續(xù)溫育1.5h后計數(shù)溶血空斑數(shù)。

1.6.5 半數(shù)溶血值(HC50)的測定。取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每只鼠經(jīng)腹腔注射2%(v/v，用生理鹽水配制)SRBC 0.2mL進行免疫。4天后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1h，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，2000rpm離心10min，收集血清。用SA緩沖液將血清稀釋為200倍，取1mL置試管內(nèi)，依次加入10%(v/v，用SA緩沖液配制)SRBC 0.5mL，補體1mL(用SA緩沖液按1∶8稀釋)。另設(shè)不加血清的對照管(以SA緩沖液代替)。置37℃恒溫水浴中保溫30min后，冰浴終止反應。2000rpm離心10min，取上清1mL，加都氏試劑3mL。同時取10%(v/v，用SA緩沖液配制)SRBC0.25mL，加都氏試劑至4mL于另一試管中，充分混勻，放置10min后，于540nm處以對照管作空白，分別測定各管光密度值。溶血素的量以半數(shù)溶血值(HC50)表示，按下式計算：半數(shù)溶血值(HC50)=樣品光密度值/SRBC半數(shù)溶血時的光密度值×稀釋倍數(shù)

1.6.6 小鼠碳廓清實驗。小鼠尾靜脈注射以生理鹽水稀釋4倍的印度墨汁，每10g體重注射0.1mL，墨汁注入后立即計時，于注入墨汁后第2、10min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20μL，加入到2mL 0.1%Na2CO3溶液中，搖勻。以0.1%Na2CO3溶液作空白對照，用722型分光光度計在600nm波長處比色測光密度值。將小鼠處死，取肝、脾，稱重，計算吞噬指數(shù)a。

1.6.7 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗(半體內(nèi)法)。小鼠腹腔注射20%(v/v，用生理鹽水配制)的雞紅細胞(2000rpm,10min)懸液1mL，間隔30min,頸椎脫臼處死，仰位固定于鼠板上，正中剪開腹壁皮膚，經(jīng)腹腔注入生理鹽水2 mL，轉(zhuǎn)動鼠板1min。取腹腔巨噬細胞洗液1mL，滴于載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內(nèi)，置37℃孵箱溫育30min。孵畢，于生理鹽水中漂洗以除去未貼片細胞。晾干，以甲醇∶丙酮(1∶1)固定，4%(v/v) Giemsa-磷酸緩沖液染色，用蒸餾水漂洗晾干。油鏡下每片計數(shù)100個巨噬細胞，按下式計算巨噬率和吞噬指數(shù)：吞噬率%=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)/計數(shù)的巨噬細胞數(shù)×100吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細胞總數(shù)/計數(shù)的巨噬細胞數(shù)

1.6.8 NK細胞活性的測定(乳酸脫氫酶測定法)。受試小鼠頸椎脫臼處死，無菌取脾，制成脾細胞懸液，用Hank’s液洗2次，每次離心10min(1000轉(zhuǎn)/min)，棄上清液將細胞漿彈起，加入0.5mL滅菌水20s，裂解紅細胞后再加入0.5mL 2倍Hank’s液及8mL Hank’s液，1000rpm離心10min，用1mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，用1%冰醋酸稀釋后計數(shù)，用臺酚蘭染色計數(shù)活細胞數(shù)(活細胞數(shù)應在95%以上)，調(diào)整細胞濃度為2×107個/mL此為效應細胞，取傳代后24h生長良好的YAC-1細胞用PRMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為4×105個/mL 此為靶細胞；取靶細胞和效應細胞各100μL(效靶比50∶1)，加入U型96孔培養(yǎng)板中；靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養(yǎng)液各100μL，靶細胞最大釋放孔加靶細胞和2.5%Triton各100μL；上述各項均設(shè)3個平行孔，于37℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，然后將96孔培養(yǎng)板以1500r/min離心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培養(yǎng)板中，同時加入LDH基質(zhì)液100μL，根據(jù)室溫反應3～10min，每孔加入1mol/L的HCI30μL，在酶標儀490nm處測定光密度(OD)。

NK細胞活性=〔(反應孔OD-自然釋放孔OD)/(最大釋放孔OD-自然釋放孔OD)〕×100%

1.7 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計

用Eecel、Spss軟件進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化和統(tǒng)計分析。用Spss13.0軟件分析時，先對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，若方差齊，采用單因素方差分析進行總體比較，發(fā)現(xiàn)差異再用Dunnett法進行多個劑量組與1個對照組均數(shù)間的兩兩比較。若方差不齊則對原始數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，滿足方差齊性檢驗后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到方差齊，則改用秩和檢驗進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)總體比較有差異，則采用不要求方差齊性的Tamhane’s T2檢驗進行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 樣品對小鼠體重的影響

見表1～5，各劑量組實驗初期、實驗中期、實驗末小鼠體重及試驗期間小鼠體重增長與對照組比較，差異均無顯著性(P﹥0.05)。

表1 免疫Ⅰ組小鼠體重

表2 免疫Ⅱ組小鼠體重

表3 免疫Ⅲ組小鼠體重

表4 免疫Ⅳ組小鼠體重

表5 免疫Ⅴ組小鼠體重

2.2 樣品對小鼠免疫器官臟器/體重比值的影響

見表6。樣品各劑量對小鼠脾臟/體重比值和胸腺/體重比值無顯著影響(P﹥0.05)。

表6 樣品對小鼠免疫器官臟器/體重比值的影響

2.3 樣品對小鼠細胞免疫功能的影響

2.3.1 樣品對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(DTH)的影響。見表7。中、高劑量組小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應能力與對照組比較顯著提高(P﹥0.05)。

表7 樣品對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(DTH)的影響

2.3.2 樣品對小鼠ConA誘導的淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力的影響。見表8。樣品各劑量對小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力無顯著影響(P﹥0.05)。

表8 樣品對小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力的影響

2.4 樣品對小鼠體液免疫的影響

2.4.1 樣品對小鼠抗體生成細胞數(shù)的影響。見表9。中、高劑量組小鼠抗體生成細胞數(shù)與對照組比較顯著提高(P﹥0.05)。

表9 樣品對小鼠抗體生成細胞數(shù)的影響

2.4.2 樣品對小鼠半數(shù)溶血值(HC50)的影響。見表10。高劑量組小鼠半數(shù)溶血值(HC50)與對照組比較顯著提高(P﹥0.05)。

表10 樣品對小鼠半數(shù)溶血值(HC50)的影響

2.5 樣品對小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能的影響

2.5.1 樣品對小鼠單核-巨噬細胞碳廓清的影響。見表11。各劑量組對小鼠碳廓清能力的影響(P﹥0.05)。

表11 樣品對小鼠單核-巨噬細胞碳廓清的影響

2.5.2 樣品對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響。見表12-1、12-2。樣品各劑量對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力無顯著影響(P﹥0.05)。

表12-1 樣品對小鼠巨噬細胞吞噬 雞紅細胞吞噬率的影響

表12-2 樣品對小鼠巨噬細胞吞噬 雞紅細胞吞噬指數(shù)的影響

2.6 樣品對小鼠NK細胞活性的影響

見表13。中、高劑量組對小鼠NK細胞活性與對照組比較顯著提高(P﹤0.05)。

表13 樣品對小鼠NK細胞活性的影響

3 結(jié)論

在本實驗室條件下，經(jīng)口灌胃給予小鼠0.333、0.667、2.000g/kg·bw劑量的有機靈芝破壁孢子粉30天，與對照組比較，0.667、2.000g/kg·bw劑量能顯著提高小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應能力、NK細胞活性、抗體生成細胞數(shù)，2.000g/kg·bw劑量能顯著提高小鼠半數(shù)溶血值(P﹤0.05)，各劑量對小鼠體重增長、胸腺/體重比值、脾臟/體重比值、單核-巨噬細胞碳廓清能力、淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力及巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力均無顯著影響(P﹥0.05)。本研究通過測定小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應、ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗、抗體生成細胞檢測、半數(shù)溶血值(HC50)的測定、小鼠碳廓清能力、小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗、NK細胞活性等指標，分析長白山有機靈芝破壁孢子粉對實驗小鼠的免疫功能作用。根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003)判定，有機靈芝破壁孢子粉對小鼠具有提高免疫力功能。

[1]唐柳，張志軍，魏雪生，等.靈芝孢子粉藥理作用研究進展[J].天津農(nóng)業(yè)科學,2011,17(3)：25-28 .

[2]楊國光，黃建康，黃瓊，等.幾種不同破壁方法的靈芝孢子粉增強免7疫調(diào)節(jié)作用研究[J].衛(wèi)生研究，2007，36(4)：482-484.

[3]陳雪華.靈芝孢子粉對荷 HAC 肝癌小鼠抗腫瘤的實驗性研究[J].上海免疫學雜志，2000，20 (2)：10.

[4]張靈華.靈芝孢子粉提取物對實驗性糖尿病的防治作用[J].中草藥，1993，24 (5)：272.

[5]張衛(wèi)明.靈芝孢子粉調(diào)節(jié)血脂作用研究[J].中國野生植物資源，2001，20(2)：16.

[6]劉昕，袁劍剛，鐘志強，等.靈芝孢子對小鼠肝癌的抑制及對肝臟的保護[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2000，10(5)：32.

[7]王添章，陳光明.破壁靈芝孢子粉對 HBV 感染者療效的臨床研究[J].食品工業(yè)科技，2000(21)：19-20.

[8]彭亮，趙鵬，李彬，等.破壁靈芝孢子粉對小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的實驗研究[J].應用預防醫(yī)學，2011，17(4)：241-243.

2016-08-24

金龍哲(1965-),男,副研究員,主要從事天然產(chǎn)物提取和功效成分研究；*通訊作者：林花，助理研究員， E-mail：23124951@qq.com。

S567.3+1

A

DOI.:11.13268/j.cnki.fbsic.2016.06.005