吳杰 駱驥才 陳文虎 許志良 張劍英 張毅敏 金元 劉鵬 徐笑紅

卵巢癌患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化及其臨床意義

吳杰 駱驥才 陳文虎 許志良 張劍英 張毅敏 金元 劉鵬 徐笑紅

目的 探討卵巢癌患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）水平變化的意義及其臨床意義。方法 采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定130例卵巢癌患者和50例體檢健康女性的外周血中CD4+、CD8+、NK以及Treg等不同淋巴細(xì)胞亞群的比例，比較兩組間的差異，分析卵巢癌不同臨床病理因素患者Treg水平的差異，并比較手術(shù)和化療患者手術(shù)前后或化療前后Treg水平的變化。結(jié)果 卵巢癌組外周血CD4+、NK細(xì)胞比例以及CD4+/CD8+比值均明顯低于正常對(duì)照組，而Treg細(xì)胞比例明顯高于正常對(duì)照組；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移卵巢癌患者其Treg水平高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移，且在不同的FIGO分期中III、IV期患者的Treg細(xì)胞比例要高于I、II期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；手術(shù)后Treg細(xì)胞比例較手術(shù)前明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；化療后Treg細(xì)胞比例與化療前的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 卵巢癌患者外周血Treg水平與卵巢癌的分期和進(jìn)展有關(guān)，在卵巢癌預(yù)后判斷以及療效監(jiān)測(cè)中有重要意義。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 卵巢癌 流式細(xì)胞術(shù)

卵巢癌是目前常見的婦科腫瘤之一，雖然發(fā)病率低于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，但由于早期診斷困難，70%～80%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為中晚期，治療效果不理想，其病死率已躍居?jì)D科惡性腫瘤的首位[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展除與癌細(xì)胞的惡性增殖和侵襲有關(guān)外，還與患者自身的免疫調(diào)節(jié)功能失衡密切相關(guān)[2]，而淋巴細(xì)胞亞群的變化在這一過程中起重要作用。在淋巴細(xì)胞亞群與免疫功能的研究中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）已成為近年來研究的熱點(diǎn)，Treg是一類高表達(dá)CD4、CD25而弱表達(dá)CD127抗原（CD4+CD25+CD127low）的T細(xì)胞亞群，通過抑制機(jī)體CD4+和CD8+細(xì)胞的活化和增殖、抑制NK細(xì)胞的增殖在維持機(jī)體免疫自穩(wěn)和調(diào)控免疫應(yīng)答等方面起重要作用，但在腫瘤患者中Treg的表達(dá)水平異常升高從而抑制了自身的抗腫瘤作用[3]。筆者通過檢測(cè)卵巢癌患者血漿中Treg等淋巴細(xì)胞亞群水平的變化，分析Treg對(duì)卵巢癌患者免疫功能的影響及其與臨床病理因素間的關(guān)系，探討Treg在卵巢癌研究中的意義。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 2013年6月至2014年12月于浙江省腫瘤醫(yī)院婦科住院的卵巢癌患者130例，年齡27～76（53± 11）歲；所有患者均經(jīng)病理檢查確診，排除嚴(yán)重感染和自身免疫病史。其中漿液性癌82例，黏液性癌29例，子宮內(nèi)膜樣癌10例，混合性上皮癌9例；選取同期在浙江省腫瘤醫(yī)院體檢健康50例女性作為正常對(duì)照組，年齡28～70（49±10）歲；兩組間年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。同時(shí)從130例患者中選取30例手術(shù)患者和30例未手術(shù)的化療患者，其中30例手術(shù)患者為Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者，年齡31～68（49±9）歲，30例化療患者為Ⅲ～Ⅳ期晚期患者，年齡35～74（54±10）歲；化療均采用TP方案：紫杉醇（175mg/m2）+卡鉑（AUC=5）。

1.2 方法 采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定卵巢癌患者和健康者外周血中CD4+、CD8+、NK以及Treg等不同淋巴細(xì)胞亞群的比例。采集清晨空腹靜脈血，EDTA-K2抗凝，采用Beckman Coulter公司生產(chǎn)的CytomicsTMFC 500儀器，所用抗體均為Beckman Coulter公司儀器的配套產(chǎn)品，檢測(cè)CD4+、CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例以及Treg占CD4+T細(xì)胞的比例，其中T細(xì)胞亞群以CD4-FITC/ CD8-PE/CD3-PC5組合標(biāo)記，NK細(xì)胞以CD3-FITC/CD（16+56）-PE組合標(biāo)記，Treg細(xì)胞以 CD25-FITC/ CD127-PE/CD4-PC5組合標(biāo)記，以同熒光素標(biāo)記同源的IgG1或IgG2作為同型對(duì)照。實(shí)驗(yàn)步驟：取流式試管加入100μl抗凝全血，分別加入標(biāo)記單克隆抗體各20μl，渦旋混勻后室溫避光孵育20min，加入500μl紅細(xì)胞裂解液OptiLyse C，渦旋混勻，室溫避光10min，加入PBS 500μl洗2次，離心棄上清液，再加入PBS 500μl，混勻后上機(jī)檢測(cè)。比較術(shù)前和術(shù)后1個(gè)月以及化療前和化療1周期后Treg水平的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌組和正常對(duì)照組淋巴細(xì)胞亞群的比較 卵巢癌組CD4+、NK比例以及CD4/CD8比值明顯低于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；卵巢癌組Treg細(xì)胞比例明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），詳見表1。

表1 卵巢癌組和正常對(duì)照組淋巴細(xì)胞亞群的比較（%）

2.2 不同臨床病理因素卵巢癌患者Treg水平的比較 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者Treg水平高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的患者，在FIGOⅢ、Ⅳ期組患者的Treg水平明顯高于Ⅰ、Ⅱ期組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而Treg水平在年齡、分化程度、病理分型中的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），詳見表2。

2.3 手術(shù)及化療前后卵巢癌患者血漿Treg水平的變化 手術(shù)1個(gè)月后患者Treg比例為（4.16±1.01）%，較術(shù)前 [（4.86±1.43）%]有明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；化療后Treg比例為（5.11±1.52）%，較化療前[（5.43±1.81）%]略有下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

Treg是目前研究漸熱的一種免疫抑制細(xì)胞，由Sakaguchi等[4]在1995年首次報(bào)道。Treg具有低反應(yīng)性和免疫抑制性兩大功能，通過抑制CD4+和CD8+細(xì)胞的活化和增殖、抑制NK細(xì)胞的增殖，下調(diào)樹突狀細(xì)胞（DC）的表面共刺激分子的表達(dá)、降低抗原遞呈的效率等發(fā)揮作用[5-7]，研究表明Treg在多種實(shí)體腫瘤組織和外周血中均有顯著增加[8-11]，并且其水平與腫瘤的分級(jí)、進(jìn)展以及患者的預(yù)后相關(guān)[12-15]，本研究旨在通過分析Treg對(duì)卵巢癌患者免疫功能的影響以及在不同臨床病理因素分組下的變化，探討Treg在卵巢癌研究中的意義。

本研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者體內(nèi)免疫功能處于低下和失衡狀態(tài)，其CD4+、NK細(xì)胞的水平以及CD4+/CD8+的比值明顯低于正常對(duì)照組，而Treg水平高于正常對(duì)照組，提示卵巢癌患者體內(nèi)免疫功能低下與異常增加的Treg細(xì)胞相關(guān)，這一結(jié)果與Dowlatshahi等[16]的研究結(jié)果一致，另有研究者發(fā)現(xiàn)下調(diào)腫瘤患者Treg水平后患者的抗腫瘤功能得到顯著改善[17-18]，進(jìn)一步證實(shí)Treg通過抑制CD4+、NK等淋巴細(xì)胞的活化、增殖從而限制了機(jī)體的抗腫瘤免疫功能。

表2 卵巢癌患者Treg在不同臨床病理因素中的比較

在卵巢癌不同臨床病理因素分組比較中，筆者發(fā)現(xiàn)Treg水平在不同年齡階段表達(dá)較為穩(wěn)定，在≥50歲和＜50歲中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與Santner-Nanan等[19]的研究結(jié)果相同。同時(shí)Treg在卵巢癌不同的病理分型和分化程度中均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在FIGOⅢ、Ⅳ期組的Treg水平明顯高于Ⅰ、Ⅱ期，同時(shí)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者的Treg水平也明顯高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組，提示Treg水平與腫瘤的分期和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散密切相關(guān)，因此對(duì)卵巢癌患者的預(yù)后有重要價(jià)值。此外筆者對(duì)其中部分患者手術(shù)前后和化療前后的Treg水平進(jìn)行比較，結(jié)果顯示術(shù)后Treg水平較術(shù)前有顯著下降，而化療后Treg水平較化療前有一定程度下降但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)這一結(jié)果認(rèn)為術(shù)后Treg水平的下降可能是由于術(shù)后腫瘤細(xì)胞對(duì)Treg的誘導(dǎo)作用消失所致，已有研究證實(shí)腫瘤細(xì)胞能產(chǎn)生某些細(xì)胞因子和CCL22趨化因子從而導(dǎo)致Treg的增生分化和局部聚集，并構(gòu)成一個(gè)免疫耐受的微環(huán)境[20-21]，而術(shù)后這一作用消失Treg水平也隨之下降。化療作為卵巢癌治療的另一種重要手段，其作用機(jī)制較為復(fù)雜。有研究認(rèn)為化療藥物可通過抑制腫瘤微環(huán)境中的血管生成，促進(jìn)Treg細(xì)胞調(diào)亡減少，從而有效控制腫瘤的發(fā)展[22]，國內(nèi)有學(xué)者報(bào)道化療后Treg水平在乳腺癌、直腸癌、肺癌等腫瘤中均有明顯下降[23-25]，在本研究中化療后Treg水平較化療前水平有下降但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能是因?yàn)槿脒x的研究樣本相對(duì)偏少，另一方面則與患者不同的免疫狀態(tài)以及化療敏感性的個(gè)體差異有關(guān)，筆者將在增加樣本量和化療周期以及統(tǒng)一給藥時(shí)間、方法等基礎(chǔ)上作進(jìn)一步的研究。

綜上所述，卵巢癌患者中Treg抑制了機(jī)體正常的抗腫瘤免疫功能，其水平與卵巢癌患者的免疫狀態(tài)及腫瘤分期密切相關(guān)，因此能夠作為卵巢癌預(yù)后以及療效監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)，但Treg水平與腫瘤細(xì)胞間的具體作用機(jī)制尚未明確，需作更深入的研究。

[1] JemalA,SiegelR,Xu J,et al.Cancer statistics,2010[J].CACancer J Clin,2010,60(5):277-300．

[2] Winkler I,Wilczynska B,Bojarska-Junak A,et al.Regulatory T lymphocytes and transform-ing growth factor beta in epithelialovarian tumors-prognostic significance[J].J Ovarian Res,2015,8 (1):39.

[3] Curiel T J.Tregs and rethinking cancer immunotherapy[J].J Clin Invest,2007,117(5):1167-1174.

[4] SakaguchiS,SakaguchiN,Asano M,et al.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25):breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases[J].J Immunol,1995,155(3):1151-1164．

[5] Horwitz D A,Zheng S G,Gray J D.The role of the combination of IL-2 and TGF-β or IL-10 in the generation and function of CD4 CD25+and CD8+regulatory Tcellsubsets[J].J Leukoc Biol,2003, 74(4):471-478．

[6] Piccirillo C A,Shevach E M.Cutting edge:control of CD8+T cell activation by CD4+CD25+immunoregulatory cells[J].J lmmunol, 2001,167(3):1137-1140.

[7] Azuma T,TakahsshiT,Kunisato A,et al.Hu man CD4+CD25+regulatory T cells suppress NKT cell function[J].Cancer Res,2003, 63(15):4516-4520.

[8] Maruyama T,Kono K,Izawa S,et al.CCL17 and CCL22 chemokines within tumor microenvironment are related to infiltration of regulatory T cells in esophageal squamous cell carcinoma[J].Dis Esophagus,2010,23(5):422-429.

[9] Liu F,Lang R,Zhao J,et al.CD8(+)cytotoxic Tcelland FOXP3(+) regulatory Tcellinfiltration in relation to breast cancer survivaland molecular subtypes[J].Breast Cancer Res Treat,2011,130(2): 645-655.

[10] Ormandy LA,Hillemann T,Wedemeyer H,et al.Increased populations of regulatory T cells in peripheral blood of patients with hepatocellular carcinoma[J].Cancer Res,2005,65(6):2457-2464.

[11] Beyer M,Schultze J L.Regulatory T cells in cancer[J].Blood,2006,108(3):804-811.

[12] Sasada T,Kimura M,Yoshida Y,et al.CD4+CD25+regulatory T cells in patients with gastrointestinal malignancies:possible involvement of regulatory T cells in disease progression[J].Cancer,2003,98(5):1089-1099.

[13] Kim S,Lee A,Lim W,et al.Zonal difference and prognostic significance of foxp3 regulatory T Cell infiltration in breast cancer[J]. J Breast Cancer,2014,17(1):8-17.

[14] Gobert M,Treilleux I,Bendriss-Vermare N,et al.Regulatory T cells recruited through CCL22/CCR4 are selectively activated in lymphoid infiltrates surrounding primary breast tumors and lead to an adverse clinical outcome[J].Cancer Res,2009,69(5): 2000-2009.

[15] Tae Jung Jang.Progressive increase of regulatory T cells and decrease ofCD8+Tcells and CD8+Tcells/regulatory Tcells ratio during colorectal cancer development[J].The Korean Journal of Pathology,2013,47(5):443-451.

[16] Dowlatshahi M,Huang V,Gehad A E,et al.Tumor-specific T cells in human Merkel cell carcinomas:a possible role for Tregs and T-cell exhaustion in reducing T-cell responses[J].J Invest Dermatol,2013,133(7):1879-1889.

[17] DannullJ,Su Z,RizzieriD,et al.Enhancement of vaccine-mediated antitumor immunity in cancer patients after depletion of regulatory Tcells[J].J Clin Invest,2005,115(12):3623-3633.

[18] Pastille E,BardiniK,Fleissner D,et al.Transient ablation ofregulatory T cells improves antitumor immunity in colitis-associated colon cancer[J].Cancer Res,2014,74(16):4258-4569.

[19] Santner-Nanan B,SeddikiN,Zhu E,et al.Accelerated age-dependent transition ofhuman regulatory Tcells to effector memory phenotype[J].Int Immunol,2008,20(3):375-383.

[20] CurielTJ,Coukos G,Zou L,et al.Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival[J].Nat Med,2004,10(9):942-949.

[21] LiYQ,Liu F F,Zhang XM,et al.Tumor secretion of CCL22 activates intratumoralTreg infiltration and is independent prognostic predictor ofbreast cancer[J].PLoS One,2013,8(10):e76379.

[22] Chu Y,Wang LX,Yang G,et al.Efficacy Efficacy of GM-CSF-producing tumor vaccine after docetaxel chemotherapy in mice bearing established Lewis lung carcinoma[J].J Immunother, 2006,29(4):367-380.

[23] 盧曉婷,劉俊田,任秀寶,等.化療對(duì)乳腺癌患者外周血中treg細(xì)胞數(shù)目的影響及意義[J].中國腫瘤臨床,2008,35(9):508-511.

[24] 劉海義,王海波,張毅勛,等.直腸癌新輔助治療對(duì)外周血CD4+CD25HighCD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制作用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2014,31(11):2505.

[25] Chen C,Chen Z,Chen D,et al.Suppressive effects of gemcitabine plus cisplatin chemotherapy on regulatory Tcells in nonsmall-celllung cancer[J].J Int Med Res,2015,43(2):180-187.

Regulatory T cell levels in peripheral blood of patients with ovarian cancer and its clinicopathological significance

WU Jie,LUO Jicai,CHEN Wenhu,et al.Department of Clinical Laboratory,Zhejiang Cancer Hospital,Hangzhou 310022,China

【 Abstract】 Objective To investigate the levels of CD4+CD25+CD127low regulatory T cells in peripheral blood of patients with ovarian cancer and its relation to clinicopathological features of the disease. Methods Plasma levels of CD4,CD8,NK and regulatory T cells were measured in 130 ovarian cancer patients and 50 healthy controls by flow cytometry.The relation between the plasma levels of regulatory T cells and clinicopathologic features of the disease was analyzed,and changes of regulatory T cells levels in 30 ovarian cancer patients before and after surgery and chemotherapy were compared. Results The percentages of CD4+,NK and CD4+/CD8+ratio in ovarian cancer group were significantly lower than those in control group.The percentage of regulatory T cells in ovarian cancer group was significantly higher than that in controls;the percentage of regulatory T cells in patients with lymphatic metastasis was significantly higher than that in those without lymphatic metastasis;and the percentage of regulatory T cells in advanced cancer patients was significantly higher than that in early cancer patients(P＜0.05).The levels of regulatory T cells dropped significantly after surgery(P＜0.05),but had no significant changes after chemotherapy(P＞0.05). Conclusion The results indicate that regulatory Tcells may be a valuable marker for prognosis and treatment monitoring in patients with ovarian cancer.

Regulatory Tcells Ovarian cancerFlow cytometry

2015-09-09）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

浙江省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目（2015KYA042）

310022 杭州，浙江省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科（吳杰、陳文虎、張劍英、張毅敏、金元、劉鵬、徐笑紅）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科（駱驥才）；中國科學(xué)院（杭州）生命科學(xué)院（許志良）

徐笑紅，E-mail：zjhzxxh@163.com