馮 雪，柳艷霞，賀澤英,王雯雯，趙改名*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全環(huán)境因子風(fēng)險評估實驗室,天津 300191；3.安捷倫科技有限公司，北京 100102)

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稻米代謝組學(xué)分析方法的建立及在產(chǎn)地溯源中的應(yīng)用

馮 雪1,2，柳艷霞1，賀澤英2,王雯雯3，趙改名1*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全環(huán)境因子風(fēng)險評估實驗室,天津 300191；3.安捷倫科技有限公司，北京 100102)

采用氣相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜(GC/Q-TOF MS)建立了稻米的代謝組學(xué)分析方法，并將其應(yīng)用于產(chǎn)地溯源。利用D-最優(yōu)設(shè)計對提取溶劑進行優(yōu)化，通過偏最小二乘分析法考察了不同溶劑對代謝物提取效率的影響?？疾炝搜苌噭┓N類、衍生溫度及時間對代謝物檢測的影響,最終確定分析條件為：甲醇-水(1∶1)為提取溶劑,N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷(MSTFA-TMCS，99∶1)于60 ℃條件下衍生1 h。選取10種代謝物考察儀器精密度、方法重現(xiàn)性和衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性，相對標準偏差(RSD)均小于9%，證明了方法的可靠性。結(jié)合Mass Profiler Professional(MPP)軟件,以主成分分析(PCA)法區(qū)分黑龍江省4個地區(qū)的29個綏粳4號稻米樣本，分類效果顯著。對顯著變化(P<0.05，倍率變化≥2)的差異性代謝物進行鑒定，確定了11種特征標記物。結(jié)果表明,利用GC/Q-TOF MS建立代謝組學(xué)分析方法，結(jié)合主成分分析鑒別稻米產(chǎn)地具有可行性，為大米市場的規(guī)范和資源開發(fā)利用提供了依據(jù)。

稻米；氣相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜；代謝組學(xué)；主成分分析；產(chǎn)地鑒別

稻米是我國的主要糧食作物之一，近三分之二的人口以大米為主食[1]。稻米中含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類、脂肪、膳食纖維等營養(yǎng)成分以及大量人體必需的微量元素[2]。隨著生活水平的不斷提高，消費者越來越注重其風(fēng)味和營養(yǎng)品質(zhì)。大米的品質(zhì)特征不僅與品種有關(guān)，還與其產(chǎn)地環(huán)境，包括氣候、土壤、水源等條件的關(guān)系十分密切[3]，優(yōu)質(zhì)稻米種植的區(qū)域性特點比較明顯。方正米是繼遼寧盤錦米、黑龍江五常米之后，我國第3個稻米原產(chǎn)地域保護產(chǎn)品，主產(chǎn)品種為綏粳4號稻米[4]。為了牟取暴利，一些不法商販假冒地理標志，損害了消費者的利益。因此，建立一種行之有效的稻米產(chǎn)地鑒別方法具有重要意義。

目前，國內(nèi)外關(guān)于稻米產(chǎn)地溯源的研究主要集中在礦物元素、穩(wěn)定同位素、脂肪酸、蛋白質(zhì)組分以及DNA指紋的分析方面，如電感耦合等離子質(zhì)譜法測定稻米中的礦物元素[5]和碳氮穩(wěn)定同位素[6]，氣相色譜法測定稻米中的脂肪酸組成及含量[7]，近紅外光譜結(jié)合偏最小二乘模式識別法鑒別不同產(chǎn)地的稻米[8],生物法測定稻米的遺傳物質(zhì)等[9]。代謝組學(xué)是以生物樣品中的低分子量代謝產(chǎn)物(如有機酸、脂肪酸、氨基酸、糖等)為研究對象，通過高通量檢測和數(shù)據(jù)處理，進行信息整合及生物標記物鑒定的科學(xué)[10]。在衍生化的基礎(chǔ)上利用稻米的非靶標代謝輪廓對其進行產(chǎn)地鑒別的研究尚未見報道。

四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀可進行最高特異性的結(jié)構(gòu)確認分析和最準確的分子式解析，適用于分析目標化合物和未知化合物，已廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)研究。本實驗利用氣相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜(GC/Q-TOF MS)對不同產(chǎn)地稻米的代謝物進行分析，考察了不同試劑對代謝物提取效率的影響,優(yōu)化衍生條件，建立了稻米代謝組學(xué)分析方法，并結(jié)合主成分分析對稻米進行產(chǎn)地鑒別，找出特征標記物，為稻米的產(chǎn)地溯源和真?zhèn)舞b別提供了技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

7200 GC/Q-TOF MS(美國Agilent公司),Neoguege 23R centrifuge離心機(香港Heal Force公司)，高速臺式離心機(上海安享科學(xué)儀器公司)，ULTRA-TURRAX勻漿機(美國IKA公司)，氮吹儀，旋渦混合器(美國Thermo公司)，水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)。

甲氧基胺鹽酸鹽(純度98%)，吡啶(色譜純)，N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA),N-甲基-N-(叔丁基二甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(MTBSTFA),含1% 叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCI)購自阿拉丁試劑有限公司(上海)；三甲基氯硅烷(TMCS)購自百靈威科技有限公司(北京)；甲醇、乙腈、丙酮購自Fisher公司(美國)。實驗用水為Millipore超純水。

綏粳4號稻米由黑龍江省農(nóng)科院提供，包括方正縣地標保護區(qū)域的7個樣本，延壽縣7個樣本，虎林縣9個樣本，木蘭縣6個樣本。經(jīng)晾曬、脫殼、精磨、磨粉，室溫風(fēng)干后冷藏。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 精確稱取5 g樣品于100 mL離心管中，加提取溶劑20 mL，18 000 r/min高速均質(zhì)2 min,離心(5 000 r/min)后取上清液400 μL至1.5 mL離心管中，加入20 μL濃度為2 mg/L的核糖醇水溶液，氮氣吹干，加入100 μL甲氧基胺鹽酸鹽的吡啶溶液(20 mg/mL)，渦旋40 s，水浴加熱。之后加入100 μL硅烷化衍生試劑,密封，渦旋40 s，水浴加熱。衍生結(jié)束后取出離心管冷卻至室溫，15 000 r/min 離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)移至進樣瓶中上機。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為HP-5MS(Agilent，30 m× 250 μm × 0.25 μm)，進樣模式為不分流進樣，進樣量1 μL，流速為1 mL/min。升溫程序：初始溫度 60 ℃，保持1 min，以40 ℃/min升溫至120 ℃，再以5 ℃/min升溫至310 ℃。載氣為氦氣，進樣口溫度280 ℃。

1.2.3 質(zhì)譜條件 采用全掃描方式分析稻米的代謝物，采用EI模式采集。離子源溫度280 ℃，掃描速度5 spectra/s，溶劑延遲時間3 min，質(zhì)量掃描范圍45～550 amu。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 利用Mass Hunter Unknown Analysis(Agilent，美國)軟件解卷積，提取質(zhì)譜信息，并與NIST14庫、Fiehn庫比對，對代謝物進行鑒定。使用SIMCA-P軟件(V11.5，Umetrics AB，Umea，Sweden)對數(shù)據(jù)進行偏最小二乘(PLS)分析，以確定最佳提取溶劑。利用SPSS16.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析確定衍生試劑種類。用Mass Profiler Professional(MPP) 軟件(Agilent，美國)對數(shù)據(jù)進行主成分分析，并篩選特征標記物。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的優(yōu)化

2.1.1 提取試劑的優(yōu)化 代謝組學(xué)的研究對象是生物樣本中相對分子質(zhì)量小于1 000的內(nèi)源性小分子化合物[11]。稻米樣本中的代謝物種類繁多，且含量和極性差別較大，既有極性較強的糖、氨基酸類等，又包括極性較弱的脂類、固醇類等代謝物。甲醇、乙腈、丙酮、水是代謝組學(xué)中較常用的提取溶劑，它們極性不同，且能互溶。為建立稻米的非靶標代謝輪廓分析方法，全面反映代謝物組分信息，且在提取過程中兼顧不同性質(zhì)的化合物，本實驗采用上述4種溶劑及其混合溶液提取稻米中代謝物，通過代謝物峰面積考察不同溶劑對稻米代謝物整體提取效率和穩(wěn)定性的影響。根據(jù)D-最優(yōu)設(shè)計原理，使用Modde 11.5軟件(Umetrics，Sweden)對4種溶劑進行方案設(shè)計(見表1)。

表1 不同比例提取溶劑試驗設(shè)計

Table 1 Experimental design of different compositions of extraction reagent

ExperimentNo．Volumeratio(methanol∶acetonitrile∶acetone∶water)ExperimentNo．Volumeratio(methanol∶acetonitrile∶acetone∶water)11∶0∶0∶0141∶1∶1∶020∶1∶0∶0155∶1∶1∶130∶0∶1∶0161∶5∶1∶140∶0∶0∶1171∶1∶5∶151∶1∶0∶0181∶1∶1∶561∶0∶1∶0191∶1∶1∶171∶0∶0∶1201∶1∶1∶180∶1∶1∶0211∶1∶1∶190∶1∶0∶1221∶0∶0∶0100∶0∶1∶1230∶1∶0∶0110∶1∶1∶1240∶0∶1∶0121∶0∶1∶1250∶0∶0∶1131∶1∶0∶1

圖1 不同提取試劑的PLS分析得分圖Fig.1 PLS scores plot obtained with different solvents

數(shù)據(jù)經(jīng)MassHunter Unknown Analysis軟件解卷積后，對篩選出的峰進行鑒定。以鑒定出的代謝物的峰面積作為數(shù)據(jù)集X，以提取溶劑不同組成作為數(shù)據(jù)集Y，利用SIMCA-P軟件進行偏最小二乘分析，得到提取兩個主成分的PLS模型，該模型具有較好的可解釋性(R2X=0.4,R2Y=0.3)及可預(yù)測性(Q2=0.3)，可以解釋30%的數(shù)據(jù)。PLS分析結(jié)果以t[1]和u[1]構(gòu)建得分圖(圖1)，表示第一個主成分下峰面積和溶劑之間的整體對應(yīng)關(guān)系。左下角的樣品提取效率低，而右上角的樣品提取效率高。由圖1可知，各點近似呈一條45°的直線，表明代謝物的峰面積與提取溶劑之間呈現(xiàn)較好的相關(guān)性。結(jié)果顯示，用甲醇-水(1∶1)作為提取溶劑的提取效率最高，僅用20 mL乙腈作為提取溶劑的提取效率最低。試驗組平行樣本的分布相對集中,表明方法的重復(fù)性較好。

圖2 不同提取溶劑的PLS分析載荷圖Fig.2 PLS loading plots obtained with different solvents

以第一、二個主成分得到的X、Y數(shù)據(jù)綜合權(quán)重W*C[1]、W*C[2]作圖，得到的PLS載荷圖(圖2)可以直觀地表示X數(shù)據(jù)集和Y數(shù)據(jù)集之間的關(guān)聯(lián)性[12]。圖中小方塊表示溶劑相對位置，小三角表示不同代謝物。每個方塊周圍的化合物表明該溶劑對這些化合物有較高的提取效率。由圖可知，只有少數(shù)化合物(如圖中圈出的化合物：磷酸鹽、尿囊素)可以通過乙腈或丙酮的提取獲得較大的峰面積，這與文獻的研究結(jié)果一致[13]。靠近中心位置的化合物受混合溶劑的影響較小，大部分化合物靠近甲醇和水的位置，說明甲醇和水對這些代謝物的提取有促進作用，二者混合可得到更大的代謝物覆蓋面。經(jīng)鑒定，這些化合物以糖、氨基酸、有機酸為主。

圖3 衍生試劑對4個稻米樣本代謝物種類的影響Fig.3 Effects of different derivatization reagents on metabolites for 4 rice samples

2.1.2 衍生條件的優(yōu)化 一些含有氨基、羧基、羥基等極性基團的化合物因不易揮發(fā)，易熱分解而不易被GC/Q-TOF檢測。在硅烷化反應(yīng)過程中，含活性氫的基團會被硅烷基團所取代，衍生后的分析產(chǎn)物具有更高的揮發(fā)性、更低的極性和更好的熱穩(wěn)定性[14]。其中，MSTFA是最常用的硅烷化衍生試劑[15]，TMCS可以促進MSTFA與酰胺、仲胺以及一些與單獨的MSTFA無法發(fā)生衍生反應(yīng)的羥基反應(yīng)。MTBSTFA可與羥基、羧基、巰基以及伯胺和仲胺發(fā)生反應(yīng)，其衍生產(chǎn)物較MSTFA的衍生產(chǎn)物更穩(wěn)定[16]。稻米中的代謝物種類繁多，而且含量差異較大，對分析方法的覆蓋度要求較高。因此本文以4個地區(qū)的稻米樣本為研究對象，比較對其進行不同衍生處理(不衍生，MSTFA衍生，MSTFA-TMCS 99∶1以及MTBSTFA衍生)所獲得的代謝物數(shù)量(圖3)。

由圖可知，對于木蘭、虎林和延壽縣的稻米，用MSTFA-TMCS(99∶1)進行硅烷化所得到的代謝物數(shù)量均最多，并且與其他處理得到的代謝物數(shù)量存在顯著差異。對于方正縣的稻米，用MSTFA硅烷化得到的代謝物數(shù)量與MTBSTFA差異顯著，但TMCS的加入對代謝物的提取并未起到明顯的改善作用。不進行硅烷化衍生得到的代謝物最少，驗證了硅烷化的必要性。所以實驗最終選用MSTFA-TMCS(99∶1)作為硅烷化試劑。

在硅烷衍生化過程中，衍生化時間及溫度對代謝物的提取效率有很大影響。為確定最佳條件，將硅烷化反應(yīng)溫度設(shè)為20，30，40，50，60，70，80 ℃，硅烷化反應(yīng)時間為100 min，考察溫度對總相對峰面積和代謝物數(shù)量的影響；將硅烷化反應(yīng)時間設(shè)為10，20，40，60，80，100，120，140 min，硅烷化反應(yīng)溫度為60 ℃，考察總相對峰面積和代謝物數(shù)量隨時間的變化情況。

圖4 方正米的總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram(TIC) of rice from Fangzheng

結(jié)果表明，隨著衍生溫度的升高，總相對峰面積和代謝物數(shù)量先增加后減小，在60 ℃時達到最大值。隨著衍生時間的增加，代謝物總數(shù)和總相對峰面積呈先增加后趨于平穩(wěn)的趨勢，在60 min時，二者達到最大值，說明此時已達到最好的衍生效果。最終確定將各樣品于60 ℃條件下硅烷化衍生60 min。

2.2 方法學(xué)考察

典型的稻米總離子流色譜圖如圖4所示。經(jīng)解卷積、譜庫檢索后確定的代謝物種類包括糖、脂肪酸、有機酸、氨基酸、甾體等。選取甘醇酸、亮氨酸、絲氨酸等10種匹配度較高的代謝物進行方法學(xué)考察。以相對響應(yīng)因子(代謝物峰面積與內(nèi)標峰面積的比值)為指標，考察方法重現(xiàn)性(同一樣本取5份制樣上機)、儀器精密度(樣品溶液連續(xù)重復(fù)上機5次)及衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性(樣品溶液于-20 ℃下儲存，分別于0，6，12，24，36，48 h檢測)，結(jié)果如表2所示。各代謝物的精密度、重現(xiàn)性及穩(wěn)定性良好，相對標準偏差(RSD)均小于9%,滿足生物樣本的分析要求。

表2 方法重現(xiàn)性、儀器精密度以及衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性

Table 2 Reproducibility，precision of the method and stability of the derived products

Retentiontime(min)CompoundReproducibility(RSD/%)Precision(RSD/%)Stability(RSD/%)502Glycolicacid(甘醇酸)532989515Leucine(亮氨酸)361326627Serine(絲氨酸)611536746Uracil(尿嘧啶)264048812Malicacid(蘋果酸)781432831Threonine(蘇氨酸)513860960Cyclamicacid(環(huán)拉酸)4226511038Sinapicacid(芥子酸)3516431494Arabinitol(阿拉伯糖醇)4839651942Mannitol(甘露糖醇)3410562468Maltitol(山梨糖醇)281668

2.3 稻米代謝組學(xué)分析方法在產(chǎn)地溯源中的應(yīng)用

圖5 4個不同產(chǎn)地稻米的PCA得分圖Fig.5 Score plot of rice from 4 different geographical origins

主成分分析可對數(shù)據(jù)進行降維，消除眾多信息中重疊的部分，進而用少數(shù)因子解釋原始數(shù)據(jù)中的大部分信息，區(qū)分變量間的相似度和差異[17]。4個地區(qū)29個稻米樣本的數(shù)據(jù)經(jīng)Mass Hunter Unknown Analysis軟件解卷積后，利用MPP軟件對數(shù)據(jù)進行主成分分析。圖5結(jié)果顯示，29個稻米樣本明顯分為4類，且每個地區(qū)樣本的聚合度較好。主成分PC1，PC2，PC3的累計貢獻率達83.41%。對顯著變化(P<0.05，倍率變化≥2)的代謝物進行初步鑒定，確定了11種對化學(xué)組成上的產(chǎn)地區(qū)分有較大貢獻的特征標記物，結(jié)果如表3所示。其中鑒定出的代謝物有8種，分別為芥子酸、肌醇、十八碳烯酸、維生素E、亞油酸單甘油酯、蔗糖、麥芽糖、海藻糖，根據(jù)文獻報道進一步確定這些化合物為稻米中的內(nèi)源代謝物[16，18]，其余3個化合物有待進一步鑒定。

表3 差異性代謝物的鑒定

Table 3 Identification of differential compounds

NumberRetentiontime(min)CompoundMatchfactor11038Sinapicacid(芥子酸)884222233Inositol(肌醇)960132275Unknown(未知)42418Octadecenoicacid(十八碳烯酸)864552538Unknown(未知)63240Tocopherol(維生素E)879273255Glyceryllinoleate(亞油酸單甘油酯)926883278Sucrose(蔗糖)901593489Maltose(麥芽糖)9367103627Trehalose(海藻糖)9637113717Unknown(未知)

3 結(jié) 論

本文通過對稻米代謝物的提取試劑、衍生條件進行優(yōu)化，建立了基于GC/Q-TOF MS技術(shù)的稻米代謝輪廓的分析方法。最終確定代謝物的最佳提取溶劑為甲醇-水(1∶1),硅烷化衍生條件為：MSTFA-TMCS(99∶1) 60 ℃條件下衍生1 h。方法學(xué)考察結(jié)果證明，該法具有良好的精密度、重現(xiàn)性以及穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上，利用主成分分析建立了不同產(chǎn)地稻米的鑒別方法，實驗結(jié)果顯示，方正縣及其周邊的延壽、木蘭、虎林縣4個產(chǎn)地的稻米在PCA分析中存在明顯差異，并鑒定出11個特征標記物。本實驗所建分析方法及產(chǎn)地鑒別模型僅通過少量稻米樣本獲得，其穩(wěn)定性和代表性有待進一步探索驗證。在今后的研究中，將進一步擴大產(chǎn)地范圍，增加樣本數(shù)量，得到更科學(xué)的溯源體系，并從機理層面研究產(chǎn)地和年際對稻米中代謝物種類及含量的影響，進一步完善稻米產(chǎn)地溯源技術(shù)。

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Development of an Analysis Method of Metabolomics in Rice and Its Application in Geographic Authenticity

FENG Xue1,2，LIU Yan-xia1，HE Ze-ying2，WANG Wen-wen3，ZHAO Gai-ming1*

(1.College of Food Science & Technology，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China；2.Laboratory of Environmental Factors Risk Assessment of Agro-product Quality Safety，Agro-environmental Protection Institute， Ministry of Agriculture，Tianjin 300191，China；3.Agilent Technologies(China) Company，Ltd.，Beijing 100102，China)

An effective method was established for the analysis of metabolomics in rice from different geographical origins by gas chromatography-quadrupole time-of-flight-mass spectrometry(GC/Q-TOF MS)，and was applied in geographic authenticity identification of rice.D-optimal experimental design was used to optimize the different extraction solvents，and the extraction efficiency was evaluated by partial least squares(PLS).Effects of derivatization reagents，derivatization temperature and time on the analysis of metabolites were investigated.The best result was obtained using methanol-water(1∶1) as extraction reagent，and derivatizing with N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide-trimethylchlorosilane(MSTFA-TMCS,99∶1) at 60 ℃ for 1 h.10 highly matched metabolites were selected to assess the precision，reproducibility of the method and the stability of derived products.Satisfactory results were obtained with relative standard deviations(RSD) lower than 9%，confirming reliability of the method.Principal component analysis(PCA) prediction model was establised by mass profiler professional(MPP) to classify the Suijing 4 rice from four different geographical origins in Heilongjiang Province，and the results showed that samples from different places clustered into four different groups significantly.11 differential compounds were determined，which satisfiedP<0.05 and a fold change cut-off ≥2.This demonstrates the feasibility of the developed analysis method in rice by GC/Q-TOF MS and its application in geographic authenticity identification of rice combined with PCA analysis.The method could provide a scientific basis for the standardization of rice market and the utilization of the resources.

rice；gas chromatography-quadrupole time-of-flight-mass spectrometry(GC/Q-TOF MS)；metabolomics；principal component analysis(PCA)；geographic authenticity

2015-09-14；

2015-11-18

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.05.003

O657.71；TS213.3

A

1004-4957(2016)05-0514-06

*通訊作者：趙改名，博士，教授，研究方向:肉類加工與產(chǎn)品質(zhì)量控制技術(shù)，Tel:0371-63558150，E-mail:gmzhao@126.com