梁 華，彭小寶，楊軍平，楊建安，周愛明

(1、江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006，2、江西新余市中醫(yī)院，江西新余336500，3、江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科，江西南昌330006)

清開靈、雙黃連聯(lián)合頭孢哌酮-舒巴坦鈉對產ESBLs肺炎克雷伯菌抗菌作用研究

梁 華1，彭小寶2，楊軍平1，楊建安1，周愛明3

(1、江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006，2、江西新余市中醫(yī)院，江西新余336500，3、江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科，江西南昌330006)

目的探討中藥清開靈、雙黃連對產ESBLs肺炎克雷伯菌的抗菌活性。方法取分離自臨床標本的產ESBLs肺炎克雷伯菌，建立耐藥菌模型，并將實驗菌液以5×105cfu/ml接種量預加到試管中；配制清開靈、雙黃連、頭孢哌酮-舒巴坦鈉藥液，按藥物不同組合和藥物作用時間的不同進行實驗分組，并采用對倍稀釋法分別加入到含有實驗菌液的相應試管中，35℃培養(yǎng)24h，肉眼觀察抑制細菌生長的最低藥物濃度即最低抑菌濃度（MIC）。結果清開靈、雙黃連、頭孢哌酮-舒巴坦鈉對產ESBLs肺炎克雷伯菌的MIC分別是31.25ml/L、7.5g/L、117mg/L，清開靈聯(lián)合應用頭孢哌酮-舒巴坦鈉至最佳效應組合時，二者MIC分別降低了93.76%和75%；雙黃連聯(lián)合應用頭孢哌酮-舒巴坦鈉至最佳效應組合時，二者MIC分別降低了75%和87.52%。結論清開靈注射劑和雙黃連粉針對產ESBLs肺炎克雷伯菌具有抑制作用，兩藥分別與頭孢哌酮-舒巴坦鈉聯(lián)合應用具有明顯的協(xié)同作用，可以有效提高抗生素對耐藥菌的敏感性，尤其以中藥作用6h為最佳。

清開靈；雙黃連；耐藥肺炎克雷伯菌；抑菌作用

肺炎克雷伯菌是革蘭陰性桿菌中產生ESBLs的代表菌種，主要引起下呼吸道感染。近年來，隨著抗菌藥物使用日益增多，尤其是三代頭孢菌素的不合理使用，產生ESBLs肺炎克雷伯菌耐藥菌株比例高達34.2%，并呈現(xiàn)出種類多、分布廣、抗藥性強的特點。它的廣泛流行使得臨床抗感染治療在抗生素選擇方面越來越受限制，這已經成為目前有效治療細菌感染的一個關鍵問題[3]。因此，當前對耐藥菌的對策研究以及開發(fā)新的抗菌藥物正成為重要的研究領域。

清開靈、雙黃連是清熱解毒類中藥的代表品種，具有明顯的抗炎和清熱解毒效果，在臨床上適用于各種熱毒病癥。在臨床感染性疾病的治療中，清開靈、雙黃連不僅可以抑制肺炎鏈球菌、β-溶血性鏈球菌、銅綠假單胞菌等，還具有廣譜抗菌作用，但對產ESBLs的肺炎克雷伯菌的作用尚未見報道。本研究通過觀察清開靈、雙黃連凍干粉針在體外對產ESBLs的肺炎克雷伯菌的作用以及與抗生素的協(xié)同抗菌作用，來探討中藥清除產ESBLs的肺炎克雷伯菌耐藥性的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細菌產ESBLs肺炎克雷伯菌：來源于江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院檢驗科微生物室臨床送檢的痰標本，肺炎克雷伯菌ESBLs篩查和確認依據(jù)美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）的標準判斷；質控菌：肺炎克雷伯菌ATCC700603（ESBLs陽性），購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.1.2 藥品清開靈注射液：10ml/支，河北神威藥業(yè)生產，批號130851；雙黃連凍干粉，600mg/支，河南福森藥業(yè)生產，批號120745；頭孢哌酮-舒巴坦鈉粉針劑（2：1），3g/瓶，山東羅欣藥業(yè)生產，批號65639647。

1.1.3 試劑與儀器M-H瓊脂、M-H肉湯培養(yǎng)基、哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基（均為杭州天和公司生產），藥敏紙片（英國OXOID公司產品），Walkway-96全自動微生物鑒定和藥敏系統(tǒng)（德國西門子公司產品），HH.B11電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠生產），BHC-1300ⅡA2型生物安全柜（北京阿爾泰實驗室設備公司生產）。

1.2 方法

1.2.1 ESBLs菌株鑒定送檢痰標本經分離培養(yǎng)獲取單個菌落后，用Walkway-96全自動微生物鑒定和藥敏系統(tǒng)對菌落進行鑒定并做藥敏，對可疑產ESBLs菌株應用確證試驗予以確認：在M-H平板上，以間距≥24mm貼頭孢他啶/克拉維酸、頭孢他啶、頭孢噻肟/克拉維酸、頭孢噻肟藥敏紙片，35℃培養(yǎng)18~24h，測量抑菌環(huán)直徑，若頭孢他啶/克拉維酸與頭孢他啶抑菌環(huán)直徑之差≥5mm，或頭孢噻肟/克拉維酸與頭孢噻肟抑菌環(huán)直徑之差≥5mm，即為產ESBLs肺炎克雷伯菌株，同時以標準質控菌株做對照，將上述鑒定后的菌株4℃保存?zhèn)溆?/p>

1.2.2 細菌培養(yǎng)和菌液制備用接種環(huán)挑取上述菌株，采用平板分區(qū)劃線法接種于哥倫比亞血瓊脂分離培養(yǎng)，經35℃18~24h后，挑取純化菌落2~3個，用適量M-H肉湯培養(yǎng)液調整濃度至0.5麥氏濁度，再用M-H肉湯作1；10稀釋，使含菌量達5× 107cfu/mL，此為實驗菌液。

1.2.3 藥液制備和分組方法將清開靈注射液加滅菌水10mL配成1L/L溶液，雙黃連粉劑加5ml滅菌水配成120g/L溶液，頭孢哌酮-舒巴坦鈉加50ml滅菌水配成60g/L溶液，按實驗分組分別加入相應藥液，并做對倍稀釋；取5ml試管，共設12個組，分別為清開靈組、雙黃連組、西藥組、清開靈聯(lián)合西藥Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組、雙黃連聯(lián)合西藥Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組、陰性對照組，中藥聯(lián)合西藥Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組為中藥分別作用0、4、6、8h后添加西藥。

1.2.4 對倍稀釋法測定實驗藥物最低抑菌濃度（MIC）

1.2.4.1 排試管方法按實驗分組排好試管（11排× 12列，再加1管菌液和藥液雙陰性對照管），第1排至第11排依次為清開靈組、雙黃連組、西藥組、清開靈聯(lián)合西藥Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組、雙黃連聯(lián)合西藥Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組，第12排為單管對照管，即菌液和藥液雙陰性對照管，所有試管均加M-H肉湯1ml；

1.2.4.2 加藥液方法第1~3排第1列，加0.5ml M-H肉湯和相應藥液0.5ml，混勻后吸取1ml棄去，第2~12列，加0.5ml M-H肉湯和相應藥液0.5ml后依次作對倍稀釋，最后1管1ml棄去；第4~7排第1列和第8~11排第1列，分別加清開靈和雙黃連各1ml，混勻后吸取1ml棄去，第4~7排和第8~11排第2~12列分別加清開靈和雙黃連各1ml后依次作對倍稀釋，最后1管1ml棄去；在中藥作用第0，4，6，8h后，對第4~11排加西藥：第1列加0.5ml M-H肉湯和0.5ml頭孢哌酮-舒巴坦鈉溶液，混勻后吸取1ml棄去，第2~12列加0.5ml M-H肉湯和0.5ml頭孢哌酮-舒巴坦鈉溶液后，混勻吸取1ml再依次作對倍稀釋，最后1管1ml棄去。

1.2.4.3 加菌液方法按上述加好藥液后，第1列為菌液陰性對照管，即不加菌液，第2列至第12列均加菌液10μl，使最終接種菌量達5×10cfu/ml；所有試管經35℃培養(yǎng)24h后初步肉眼觀察肉湯的清亮和混濁程度。

1.2.5 結果判定培養(yǎng)24h后各支試管2000rpm/ min離心5min，倒去上清液，用接種環(huán)挑取底層沉淀物接種到哥倫比亞瓊脂平板上，35℃培養(yǎng)18~ 24h，以肉眼觀察管底清晰不出現(xiàn)細菌沉淀的最低抗菌藥物濃度為最低抑菌濃度（MIC），同時計算FIC指數(shù)，F(xiàn)IC=A藥聯(lián)用時的MIC/A藥單用時的MIC+B藥聯(lián)用時的MIC/B藥單用時的MIC，F(xiàn)IC≤0.5為協(xié)同作用；0.52為拮抗作用。

2 結果

2.1 清開靈、頭孢哌酮-舒巴坦鈉在單獨使用與分不同時段聯(lián)合使用時對產ESBLs肺炎克雷伯菌株MIC和FIC指數(shù)均不同。本研究顯示，清開靈作用4h后加頭孢哌酮-舒巴坦鈉和作用6h后加頭孢哌酮-舒巴坦鈉，各自的MIC均下降，清開靈MIC分別為3.91ml/L和1.95ml/L，相比單獨使用時的31.25ml/L，分別下降87.48%和93.76%，頭孢哌酮-舒巴坦鈉MIC則分別為58.5mg/L和29.25mg/L，相比單獨使用時的117mg/L，分別下降50%和75%；而兩藥在聯(lián)合同時使用和清開靈作用8h后使用頭孢哌酮-舒巴坦鈉，清開靈MIC分別為7.81ml/L和3.91ml/L，相比單獨使用時的31.25ml/L，分別下降75%和87.48%，但頭孢哌酮-舒巴坦鈉MIC均不變。本研究同時顯示，清開靈作用6h后加頭孢哌酮-舒巴坦鈉聯(lián)用，F(xiàn)IC指數(shù)為0.312，表明此時對產ESBLs肺炎克雷伯菌株的抑菌具有最佳的協(xié)同抑菌作用。結果見表1、圖1。

表1 清開靈、頭孢哌酮-舒巴坦鈉單用與分時聯(lián)用對產ESBLs肺炎克雷伯菌的MIC比較

圖1 清開靈、頭孢哌酮-舒巴坦鈉分時聯(lián)用對產ESBLs肺炎克雷伯菌的MIC折線圖

2.2 雙黃連、頭孢哌酮-舒巴坦鈉在單獨使用與分不同時段聯(lián)合使用時對產ESBLs肺炎克雷伯菌株MIC和FIC指數(shù)均不同。雙黃連和頭孢哌酮-舒巴坦鈉在單獨使用時的MIC分別為7.5g/L和117mg/ L，兩藥聯(lián)合同時使用和雙黃連分別作用4h、6h、8h后使用頭孢哌酮-舒巴坦鈉，各自的MIC均有下降，其中雙黃連的MIC分別為1.87g/L、3.75g/L、1.87g/L、3.75g/L，分別下降75%、50%、75%、50%；頭孢哌酮-舒巴坦鈉的MIC則分別為58.5mg/L、29.25mg/L、14.60mg/L、29.25mg/L，分別下降50%、75%、87.52%、75%，這表明兩藥在聯(lián)用時對產ESBLs肺炎克雷伯菌株的抑菌具有協(xié)同或部分協(xié)同作用，F(xiàn)IC指數(shù)顯示，在雙黃連作用6h后加頭孢哌酮-舒巴坦鈉，此時具有最佳的協(xié)同抑菌效果。結果如表2、圖2。

表2 雙黃連、頭孢哌酮-舒巴坦鈉單用與分時聯(lián)用對產ESBLs肺炎克雷伯菌的MIC比較

3 討論

圖2 雙黃連、頭孢哌酮-舒巴坦鈉分時聯(lián)用對產ESBLs肺炎克雷伯菌的MIC折線圖

近30年間，產ESBLs的肺炎克雷伯菌在全世界范圍內廣泛流行，并且不斷有新的產ESBLs菌株出現(xiàn)，各種ESBLs的特性千差萬別[4]。由質粒介導的ESBLs的主要特點為能水解青霉素類、頭孢菌素類、單環(huán)類抗生素，使其喪失抗菌活性[5]，產ESBLs菌株的這種耐藥性可通過產酶基因的水平傳播（如整合、轉化、轉導等）和產酶株的克隆傳播導致更多細菌產生ESBLs，并使得多種耐藥基因在質粒上不斷群聚和轉移，致使細菌產生多重耐藥性，使許多抗生素失效[6]。而作為產ESBLs的多重耐藥菌，肺炎克雷伯菌在發(fā)酵菌中占有重要地位，也是臨床標本檢測當中的常見菌[7，8]，因而深入研究中西藥聯(lián)用對多重耐藥肺炎克雷伯菌的抑菌效果就顯得非常必要和緊迫。

我國中醫(yī)中藥治療歷史悠久，具有極其豐富的中醫(yī)藥寶藏和資源，許多中藥具有抗菌活性，同時副作用小，很少發(fā)生耐藥性等優(yōu)點，因而從天然藥物中尋找高效、低毒的抗菌藥物，對解決細菌耐藥性具有重要意義[9，10]。清開靈和雙黃連是清熱解毒類中藥中具有代表性的制劑，在臨床具有明顯的抗炎和清熱解毒效果，清開靈注射液主要成分為牛黃、水牛角、珍珠母、黃芪、梔子、金銀花、板藍根等，具有清熱解毒、涼血消腫、祛風化濕、通血活絡等功能；雙黃連凍干粉針為金銀花、黃芪、連翹3種中藥提取物，具有清熱解毒、表里雙解、氣血兩清、燥濕瀉火、消癰腫、散熱結之功效，藥理學研究證實，雙黃連所含這3種中藥成分都有廣譜抗菌作用，可增強NK細胞活性，提高人體細胞免疫水平。

許韋[11]等證明黃岑、黃連、金銀花等10味中藥對產ESBLs和非產ESBLs大腸埃希菌均有抑制作用，為臨床治療特殊耐藥菌提供了新的思路和依據(jù)。張偉[12]的研究則表明，雙黃連與氯唑西林鈉聯(lián)用對多重耐藥金葡菌具有較好的體外抗菌活性，并可顯著保護受多重耐藥金葡菌感染的小鼠。何明[13]的研究則證實清開靈注射液、雙黃連粉針對產ESBLs的大腸埃希氏菌有明顯抑制作用，在與頭孢哌酮-舒巴坦鈉聯(lián)合使用時，可以使得該抗生素的MIC下降50%~70%，這說明中西藥聯(lián)合應用對產ESBLs的大腸埃希氏菌有明顯的協(xié)同抑菌作用。

中藥抗菌作用機制主要有干擾細胞壁合成、損傷胞漿膜、影響細胞蛋白合成、影響核酸合成、干擾遺傳密碼復制等，而對于已經產生抗生素耐藥的細菌，中藥同樣具有逆轉其耐藥性的機制，包括清除耐藥質粒、抑制β-內酰胺酶、抑制耐藥菌外排泵、抑制細菌生物被膜的形成以及基因突變等[14]。本實驗研究結果顯示，清開靈注射液、雙黃連凍干粉對產ESBLs肺炎克雷伯菌具有一定的抑制作用，而與頭孢哌酮-舒巴坦鈉聯(lián)合使用則可以提高對該耐藥菌的抑菌效果，并使頭孢哌酮-舒巴坦鈉的MIC降低50%~87.52%，由于頭孢哌酮-舒巴坦鈉本身對非產ESBLs肺炎克雷伯菌的敏感率可達到98.9%，對產ESBLs的菌株也依然有較高的敏感率[15]，而其一旦與中藥聯(lián)合應用，則可顯著增強該抗生素的抗菌藥效，從而減少抗生素的使用，聯(lián)用時這2種中藥的MIC濃度較單獨使用時的MIC降低50%~93.76%，所以這也同時增強中藥本身的抑菌效果。根據(jù)FIC指數(shù)判斷，尤其以在清開靈注射液、雙黃連凍干粉作用6h后，再加用頭孢哌酮-舒巴坦鈉，可達到最佳的協(xié)同抑菌效果，此時FIC分別達到0.312和0.375，這表明中西藥聯(lián)合使用對產ESBLs的肺炎克雷伯菌有明顯的協(xié)同抑菌作用，可以使不敏感的細菌轉化為敏感菌，抗菌效果更加顯著，其機理可能與清開靈、雙黃連具有抑制超廣譜β-內酰胺酶的活性和表達，降低細菌耐藥性，同時與清除耐藥菌R質粒有關，從而使得細菌在中藥制劑發(fā)揮藥效作用后出現(xiàn)某種變異，導致其致病力減弱。

鑒于本研究為在體外進行的抗菌活性實驗，體內運用時的安全性和療效性尚待深入考察和確證，而隨著對中藥有效成分和抗菌機制的深入研究，同時伴隨研究手段和技術方法的不斷更新，開發(fā)研究與抗生素聯(lián)用的高效抗菌中藥已經顯示出巨大的應用前景，因而本研究為臨床治療耐藥菌和開發(fā)新的抗耐藥菌藥物提供了理論依據(jù)和治療策略與方向。

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Antibacterial effect of Qingkailing injection，Shuanghuanglian powder-injection combined with cefoperazone-sulbactam sodium on ESBLs-producing Klebsiella pneumonia

LIANG Hua1，PENG Xiaobao2，YANG Junping1，YANG Jianan1，ZHOU Aiming3.
1.Department of Clinical Laboratory，the Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330006，China；2.Xinyu Hospital of Traditional Chinese Medicine，Xinyu Jiangxi 336500，China；3.Department of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330006，China.

ObjectiveTo investigate the antibacterial activity of Chinese herbal in extended spectium β-lactamases(ESBLs)-producing Klebsiella pneumonia.MethodsESBLs positive Klebsiella pneumonia were collected from clinic samples for establishing the drug-resistance model.The sterile test tubes were divided into different test groups according to different Chinese herbals and impact time and the inoculation bacteria liquid was 5×105cfu/ml.The medical liquid of Qingkailing injection，Shuanghuanglian powder-injection and cefoperazone-sulbactam sodium were prepared and added into tubes with test bacteria liquid by two-foll diluted.After cultivated at 35℃for 24 hours，the lowest concentration would be minimum inhibitory concentration(MIC)by macroscopic observation.ResultsThe MIC of Qingkailing injection，Shuanghuanglian powder-injection and cefoperazone-sulbactam sodium were respectively 31.25ml/L，7.5g/L and 117mg/L.The MIC of Qingkailing and cefoperazone-sulbactam sodium respectively dropped by 93.76%and 75%when Qingkailing was combined with cefoperazone-sulbactam sodium；when Shuanghuanglian was combined with cefoperazone-sulbactam sodium，the MIC of Shuanghuanglian dropped by 75%and that of cefoperazone-sulbactam sodium dropped by 87.52%.ConclusionThe test proves that Qingkailing injection and Shuanghuanglian powder-injection have inhibitory effect on ESBLs-producing Klebsiella pneumonia.When they are combined with cefoperazone-sulbactam sodium，they will have significant synergisms respectively and the sensitivity of antibiotics to drug-resistance bacteria can be improved，especially after Chinese herbal played a role for 6 hours.

Qingkailing injection；Shuanghuanglian powder-injection；Drug-resistance Klebsiella pneumonia；Bacteria inhibitory effect

R446.5，Q939.92

A

1674-1129(2016)06-0723-05

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.06.009

2016-08-05；

2016-11-16)

江西省衛(wèi)生計生委中醫(yī)藥科研課題（2014A060）

梁華，男，1975年12月出生，醫(yī)學碩士，主管技師，研究方向：臨床免疫和分子診斷。