袁 梅，譚適娟，孫建光

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水稻內(nèi)生固氮菌分離鑒定、生物特性及其對(duì)稻苗鎘吸收的影響

袁 梅1，譚適娟2，孫建光1

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081；2湖南省郴州桂陽縣農(nóng)業(yè)局，湖南郴州 424400）

【目的】分離鑒定湖南水稻內(nèi)生固氮菌，研究水稻內(nèi)生固氮菌的系統(tǒng)發(fā)育，分析測定分離菌株的生物學(xué)特性，探討接種水稻內(nèi)生固氮菌對(duì)稻苗鎘（Cd）吸收的影響?！痉椒ā勘砻鏈缇局仓陿悠泛蟛捎玫偷囵B(yǎng)法分離水稻內(nèi)生細(xì)菌，采用PCR擴(kuò)增、測序檢測菌株基因確認(rèn)分離物是固氮菌，通過16S rRNA基因序列測定、比對(duì)初步鑒定菌株，分析菌株系統(tǒng)發(fā)育，通過溫室盆栽試驗(yàn)探討接種水稻內(nèi)生固氮菌對(duì)稻苗Cd吸收的影響?！窘Y(jié)果】從8個(gè)湖南水稻植株樣品中分離到19株內(nèi)生固氮菌，這些菌株在系統(tǒng)發(fā)育地位上屬于4屬13種。分離到的19株內(nèi)生固氮菌中有大約1/3的菌株產(chǎn)生蛋白酶和纖維素酶的能力較強(qiáng)，在48℃生長良好，在產(chǎn)孢液體培養(yǎng)基上生長良好(OD＞1.0)，在固體產(chǎn)孢培養(yǎng)基上產(chǎn)孢率高(60%—90%)，產(chǎn)堿能力也相對(duì)較強(qiáng)(pH 8.5—9.0)。有1/6的內(nèi)生固氮菌（3個(gè)菌株）分別對(duì)立枯絲核菌、禾谷鐮孢、擬枝孢鐮孢具有拮抗性，抑菌率為42%—55%。有大約2/3的菌株對(duì)抗生素相對(duì)比較敏感，對(duì)殺菌劑耐性強(qiáng)。測定的4個(gè)代表菌株對(duì)檢測過的78種碳源中的7種利用較好，它們是乳酸鈉、蔗糖、葡萄糖、甘油、蘋果酸、丙氨酸、葡萄糖醛酰胺。試驗(yàn)的19株內(nèi)生固氮菌中有6個(gè)菌株促進(jìn)水稻苗期Cd吸收，與對(duì)照相比植株Cd含量增加6.41%—38.45%；其他13個(gè)菌株抑制水稻苗期Cd吸收，與對(duì)照相比植株Cd含量減少2.06%—34.46%。【結(jié)論】從湖南水稻分離到19株內(nèi)生固氮菌，系統(tǒng)發(fā)育地位屬于、、、4屬13種。部分菌株產(chǎn)堿能力強(qiáng)，產(chǎn)孢率高，可在48℃高溫下生長，產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶，拮抗立枯絲核菌、禾谷鐮孢、擬枝孢鐮孢，具有良好應(yīng)用前景。接種水稻內(nèi)生固氮菌可以顯著影響水稻苗期Cd吸收，提示采用微生物方法阻控稻田Cd污染是一個(gè)非常值得研究、探討的途徑。

水稻；內(nèi)生固氮菌；生物特性；Cd

0 引言

【研究意義】水稻植株體內(nèi)棲息著大量內(nèi)生菌，對(duì)于植株健康生長起著重要作用[1]。內(nèi)生固氮菌是植物內(nèi)生菌的一個(gè)主要類群，不僅有固氮作用，還能促進(jìn)植物生長，提高植物抗病、抗逆[2]。礦山開采、不潔肥料等原因造成了稻田Cd污染，影響食品安全和生態(tài)安全[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌能夠提高水稻幼苗對(duì)Cd脅迫的抗性[5]，探索內(nèi)生固氮菌對(duì)稻苗Cd吸收的影響，對(duì)于防控稻田Cd污染具有積極意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】水稻是內(nèi)生固氮菌研究相對(duì)較多的作物，許多年前人們就已經(jīng)建立了有效的水稻內(nèi)生固氮菌分離方法，并且測得水稻內(nèi)生固氮菌的數(shù)量在105—108cfu/g DW[6]。近年來，水稻內(nèi)生菌成為研究熱點(diǎn)，水稻內(nèi)生固氮菌的分離鑒定工作得到加強(qiáng)，新的水稻內(nèi)生固氮菌也不斷被發(fā)現(xiàn)[7-8]，接種固氮菌對(duì)于水稻氮素營養(yǎng)改善等具有生產(chǎn)實(shí)際意義的研究結(jié)果得到證實(shí)[9]。目前，對(duì)水稻內(nèi)生固氮菌進(jìn)行批量分離鑒定和較為系統(tǒng)的生物特性研究較少，也未見到內(nèi)生固氮菌對(duì)水稻植株Cd吸收的報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】從Cd污染較重的地區(qū)湖南郴州桂陽縣采集水稻植株樣品，批量分離、鑒定內(nèi)生固氮菌，分析菌株間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，系統(tǒng)研究菌株產(chǎn)堿、產(chǎn)孢、高溫生長，產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶，拮抗病原真菌，對(duì)抗生素、殺菌劑耐性，碳源發(fā)酵利用等與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用密切的生物特性，探索菌株對(duì)水稻苗期生長及植株Cd吸收的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探討水稻內(nèi)生固氮菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、生物特性及其對(duì)水稻苗期Cd吸收的影響。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2014年1月至2015年12月在北京和湖南省郴州桂陽縣完成。

1.1 樣品、試劑、培養(yǎng)基

1.1.1 樣品、試劑 2014年9月17日從湖南省郴州桂陽縣水稻田采集到水稻植株樣品8份，水稻為當(dāng)?shù)仄贩N明珠絲苗，處于近成熟期。采樣方法為選擇不同水稻田塊的健壯植株帶根土整穴拔起，每個(gè)田塊采集2份，裝入塑料袋帶回實(shí)驗(yàn)室保存在4℃，盡快進(jìn)行菌株分離。

病原真菌靶標(biāo)菌株立枯絲核菌（）ACCC36246、禾谷鐮孢（）ACCC36249、擬枝孢鐮孢（）ACCC37402由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所鄧暉提供。

試驗(yàn)所用試劑購自北京化學(xué)試劑公司和Sigma公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 分離固氮菌多碳源低氮培養(yǎng)基（CCM）[10]：溶液Ⅰ：KH2PO40.2 g，NaCl 0.1 g，K2HPO40.8 g，Na2FeEDTA 28 mg，鉬酸鈉25 mg，酵母浸膏100 mg，甘露醇5 g，蔗糖5 g，乳酸鈉0.5 mL，蒸餾水900 mL。溶液Ⅱ：MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.06 g，蒸餾水100 mL。將溶液Ⅰ、Ⅱ分別滅菌，冷卻至50℃左右混合，加入生物素（5 μg·L-1）和維生素（10 μg·L-1）各0.5 mL。分離固氮菌無氮培養(yǎng)基[11]：蔗糖10 g，NaCl 0.12 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，CaCO31 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蒸餾水1 L，pH 7.2。LB培養(yǎng)基：酵母膏5 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（液體）：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。產(chǎn)孢液體培養(yǎng)基：(NH4)2SO42 g，NaCl 1 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 1 g，MnSO40.2 g，淀粉10 g，CaCO31 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。產(chǎn)孢固體培養(yǎng)基：麥麩1 kg，豆粉400 g（預(yù)先混合），牛肉膏200 g，可溶淀粉10 g，酵母粉3 g，蔗糖20 g，磷酸二氫鉀20 g，尿素3 g（用400 mL蒸餾水溶解后加入），MnSO42 g（用100 mL蒸餾水單獨(dú)溶解后加入），蒸餾水2.5 L，pH 7.2。測定蛋白酶脫脂牛奶培養(yǎng)基：脫脂奶粉5 g溶于50 mL蒸餾水，瓊脂1.5 g溶于50 mL蒸餾水，兩者分別滅菌。待冷至45—50℃時(shí)，兩液混勻倒平板。測定纖維素酶CMC培養(yǎng)基：(NH4)2SO42 g，MgSO40.5 g，KH2PO4l g，NaCl 0.5 g，CMC-Na 10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，自然pH。耐藥性檢測培養(yǎng)基：蔗糖10 g，NaCl 0.12 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，CaCO31 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，酵母粉0.5 g，蒸餾水1 L，pH 7.2。

1.2 水稻內(nèi)生固氮菌分離

采用上述多碳源低氮培養(yǎng)基和無氮培養(yǎng)基對(duì)采自湖南郴州桂陽縣的水稻植株樣品進(jìn)行了內(nèi)生固氮菌分離，方法參考文獻(xiàn)[12]。

1.3 菌株16S rRNA基因序列測定與初步鑒定

固氮菌分離物的16S rRNA基因擴(kuò)增方法參考文獻(xiàn)[13]，序列測定委托北京博邁德生物技術(shù)公司完成，基于16S rRNA基因序列的初步鑒定采用EzTaxon和NCBI數(shù)據(jù)庫在線比對(duì)完成。

1.4 菌株基因檢測與序列測定

方法參考文獻(xiàn)[14]，序列測定委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.5 水稻內(nèi)生固氮菌系統(tǒng)發(fā)育分析

在上述16S rRNA基因序列測定和基因檢測的基礎(chǔ)上，采用Mega軟件分析水稻內(nèi)生固氮菌的系統(tǒng)發(fā)育[15]。

1.6 菌株產(chǎn)堿、產(chǎn)孢、高溫生長測定

采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基測定菌株產(chǎn)堿和高溫生長能力。方法如下：首先在LB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)活化備測菌株，然后將備測菌株接種在盛有5 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的試管中，每種培養(yǎng)基3次重復(fù)（設(shè)置不接種空白對(duì)照），然后分別放置在28和48℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。48 h后觀察記錄菌株生長情況，同時(shí)用精確試紙測定培養(yǎng)液pH。

采用液體和固體2種產(chǎn)孢培養(yǎng)基測定菌株產(chǎn)生芽孢的能力。液體培養(yǎng)測定方法：用LB平板培養(yǎng)基培養(yǎng)活化備測菌株，然后將備測菌株接種在盛有5 mL產(chǎn)孢液體培養(yǎng)基的試管中，3次重復(fù)（設(shè)置不接種空白對(duì)照），28℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)。6 d后鏡檢觀察菌體形態(tài)和芽孢形成情況，記錄視野中芽孢比例。固體培養(yǎng)測定方法：首先用LB平板培養(yǎng)基培養(yǎng)活化備測菌株，然后接種在50 mL LB液體培養(yǎng)基中28℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)24 h制成種子液。將配制好的產(chǎn)孢固體培養(yǎng)基放入布袋，濕熱滅菌后趁熱加入預(yù)先干熱滅菌的500 mL燒杯中，裝量300 mL，雙層紗布封口，冷至室溫后接種50 mL上述種子液，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。72 h后檢測芽孢形成：稱取固體培養(yǎng)物50 g放入勻漿機(jī)中，加水250 mL，勻漿2 min，吸取100 μL菌液，涂片，染色，鏡檢觀察菌體形態(tài)和芽孢形成情況，記錄視野中芽孢比例。

1.7 菌株產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶測定

定性測定了菌株產(chǎn)生蛋白酶和纖維素酶的能力。測定菌株產(chǎn)生蛋白酶的方法：用LB平板培養(yǎng)基培養(yǎng)活化備測菌株，然后將備測菌株接種在脫脂牛奶培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)3 d后，觀察、記錄菌落周圍透明圈大小，判斷菌株產(chǎn)蛋白酶能力。測定菌株產(chǎn)生纖維素酶的方法：用LB平板培養(yǎng)基培養(yǎng)活化備測菌株，然后將備測菌株接種在CMC培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)3 d后，在長出菌落的培養(yǎng)基上覆蓋濃度4 mg·mL-1的剛果紅溶液，1 h后傾去，加入濃度l mol·L-1的NaCl溶液，1 h后傾去，加入5%的醋酸。此時(shí)，產(chǎn)生纖維素酶的菌落周圍出現(xiàn)透明圈。觀察、記錄菌落周圍透明圈大小，判斷菌株產(chǎn)生纖維素酶能力。

1.8 菌株拮抗病原真菌

采用兩點(diǎn)對(duì)峙法測定了分離菌株對(duì)立枯絲核菌ACCC36246、禾谷鐮孢ACCC36249、擬枝孢鐮孢ACCC37402這3株病原真菌的拮抗特性，方法參考文獻(xiàn)[16]。抑制率（%）=（對(duì)照半徑r0-對(duì)峙培養(yǎng)病原真菌菌落半徑r1）／對(duì)照半徑r0×100。

1.9 菌株對(duì)抗生素、殺菌劑耐性

用平板培養(yǎng)法測定了分離菌株對(duì)抗生素、殺菌劑的耐性。測試的抗生素和殺菌劑有氨芐青霉素、噻孢霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素、硫酸新霉素、青霉素G鈉鹽、硫酸鏈霉素、鹽酸四環(huán)素，戊唑醇、敵克松、甲霜靈、咯菌腈、惡霜靈、福美雙等。測試方法為：將抗生素和殺菌劑配成母液，加入到滅菌后正處于冷卻階段（50℃左右）的耐藥性檢測培養(yǎng)基中，使抗生素終濃度為0.25 g·L-1（殺菌劑終濃度1.0 g·L-1），充分混勻，倒于滅菌平皿中制成檢測平板。用LB平板培養(yǎng)基培養(yǎng)活化備測菌株，然后接種在50 mL LB液體培養(yǎng)基中28℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)24 h制成種子液。用無菌水調(diào)節(jié)種子液濃度為OD600=1.0，接種20 μL至耐藥性檢測平板，28℃培養(yǎng)4 d，記錄菌株生長情況。

1.10 菌株對(duì)碳源發(fā)酵利用測定

采用BIOLOG試劑盒（美國Biolog公司，儀器型號(hào)：GENⅢ）測定了分離菌株對(duì)碳源的發(fā)酵利用，測定碳源共計(jì)78種，方法參照BIOLOG實(shí)驗(yàn)手冊(cè)。

1.11 菌株對(duì)水稻苗期生長及植株Cd吸收的影響

試驗(yàn)于2015年4月15日至7月7日在溫室完成。供試菌株為上述19株水稻內(nèi)生固氮菌，試驗(yàn)土壤取自湖南省郴州桂陽縣，含Cd約6 mg·kg-1。水稻品種為湖南省郴州桂陽縣當(dāng)?shù)仄贩N明珠絲苗2號(hào)。育秧盤為4×8孔，面積0.125 m2，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所。步驟：將土壤風(fēng)干，磨碎，過2 mm篩，按照1﹕10加入生物有機(jī)肥（市售），同時(shí)按照每平方米育秧盤加入185 g水稻育秧調(diào)理劑（調(diào)理劑組成：磷酸一銨65 g，過磷酸鈣100 g，硫酸銨422 g，硫酸鉀40 g，硫酸鋅7 g，填料366 g），混勻裝盤，每盤裝土3.3 kg。挑選飽滿種子，浸種5 d，每穴播種20粒種子。出苗后，在2葉期接種固氮菌，每穴接種OD600=1.0的固氮菌培養(yǎng)液1 mL，設(shè)置不接菌處理為陰性對(duì)照，每個(gè)處理8次重復(fù)。日常管理按常規(guī)進(jìn)行。2個(gè)月后收獲，測定稻苗根長、株高、鮮重等生長性狀，同時(shí)將樣品送普尼測試中心測定Cd含量。采用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 水稻內(nèi)生固氮菌分離、檢測及基于16S rRNA基因序列的初步鑒定

采用多碳源低氮培養(yǎng)基和無氮培養(yǎng)基從8個(gè)水稻植株樣品的根、莖、葉共分離到內(nèi)生固氮菌19株，全部菌株檢測到了固氮基因，經(jīng)過16S rRNA基因序列分析比對(duì)確定了菌株的分類地位。新分離菌株的編號(hào)、來源及最大相似性模式種如表1所示。

表1 新分離水稻內(nèi)生固氮菌及其最大相似性模式種

2.2 新分離水稻內(nèi)生固氮菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果顯示，從湖南水稻植株分離到的19株內(nèi)生固氮菌與已知模式種的最大相似性均在99%以上（sd194為98.83%），說明新分離內(nèi)生固氮菌的科學(xué)分類地位比較明確。按照16S rRNA基因序列相似性，19株水稻內(nèi)生固氮菌在系統(tǒng)發(fā)育地位上屬于4屬13種，分別為。它們的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系如圖1所示。

圖1 新分離19株水稻內(nèi)生固氮菌系統(tǒng)發(fā)育樹（與參比模式種比較）

2.3 菌株產(chǎn)堿、產(chǎn)孢、高溫生長性能

分離到的19株水稻內(nèi)生固氮菌在細(xì)菌常規(guī)培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨上生長良好，細(xì)胞密度均在OD 1.0以上，多數(shù)菌株具有產(chǎn)堿能力，培養(yǎng)液最終pH在7.0—9.0。高溫生長試驗(yàn)結(jié)果顯示sd010、sd032、sd037、sd039、sd232、sd372 6株菌能夠在48℃生長，細(xì)胞密度達(dá)到OD 1.0以上，而且這些菌株的產(chǎn)堿能力相對(duì)強(qiáng)于其他菌株。產(chǎn)孢試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株在產(chǎn)孢液體培養(yǎng)基上產(chǎn)孢較少，多數(shù)菌株的芽孢形成率不足10%；而在產(chǎn)孢固體培養(yǎng)基是生長良好，菌數(shù)密度達(dá)到2.0×109cfu/g以上，多數(shù)菌株的芽孢形成率達(dá)到了60%—90%（表2）。

2.4 菌株產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶性能及其對(duì)病原真菌的拮抗

蛋白酶和纖維素酶測定結(jié)果顯示，菌株sd032、sd037、sd039、sd250、sd372、sd373具有較好的產(chǎn)酶能力，其他菌株產(chǎn)酶能力較弱，或者不產(chǎn)生。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，菌株產(chǎn)生蛋白酶和纖維素酶二者之間存在一致性（表2）?？共≡婢囼?yàn)顯示，菌株sd037、sd039同時(shí)對(duì)3株靶標(biāo)病原真菌具有拮抗作用，抑菌率為42%—55%，sd010對(duì)ACCC37402、sd373對(duì)ACCC36249分別具有拮抗性，其他菌株不具有拮抗病原真菌的能力。菌株拮抗病原真菌的能力和菌株產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶的能力二者之間存在明顯的一致性（表2）。

表2 新分離菌株的生物特性測定

a描述菌株液體培養(yǎng)生長情況?！埃北硎揪簼舛龋糘D 0.3，“＋”表示菌液濃度OD 0.3—0.6，“＋＋”表示菌液濃度OD 0.6—1.2，“＋＋＋”表示菌液濃度＞OD 1.2aBacterial growth in liquid medium, “-” meant bacterial liquid＜OD 0.3, “+” meant bacterial liquid between OD 0.3 and 0.6, “++” meant bacterial liquid between OD 0.6 and 1.2, “+++” meant bacterial liquid ＞OD 1.2；b描述菌株固體培養(yǎng)生長情況。“＋＋”表示細(xì)菌濃度2.0×109—3.0×109cfu/g，“＋＋＋”表示細(xì)菌濃度＞3.0×109cfu/gbBacterial growth in solid medium, “++” meant bacterial density between 2.0×109and 3.0×109cfu/g, “+++” meant bacterial density ＞3.0×109cfu/g；c透明圈法定性描述菌株產(chǎn)酶情況?！埃北硎就该魅挘? mm，“＋”表示透明圈帶寬 1—3 mm，“＋＋”表示透明圈帶寬 3—6 mm，“＋＋＋”表示透明圈帶寬＞6 mmcQualitative description of protease and cellulose, “-” meant transparent ring bandwidth ＜1 mm, “+” meant transparent ring bandwidth between 1 and 3 mm, “++” meant transparent ring bandwidth between 3 and 6 mm, “+++” meant transparent ring bandwidth ＞6 mm

2.5 菌株對(duì)抗生素、殺菌劑的耐性

檢測了18株新分離菌株對(duì)8種抗生素和6種殺菌劑的耐藥性，結(jié)果顯示多數(shù)菌株對(duì)氨芐青霉素、噻孢霉素、青霉素G鈉鹽、鹽酸四環(huán)素、甲霜靈、咯菌腈、惡霜靈具有不同程度的耐性，對(duì)氯霉素、硫酸卡那霉素、硫酸新霉素、敵克松、福美雙則相對(duì)比較敏感。從單個(gè)菌株的耐藥性來看，sd032、sd039、sd086、sd372、sd373的耐藥性相對(duì)較強(qiáng)，這也正是那些產(chǎn)堿、產(chǎn)酶、產(chǎn)孢、高溫生長能力較強(qiáng)的菌株（表3）。

表3 新分離菌株對(duì)抗生素、殺菌劑的耐性

“－”表示未形成菌落No colony formation；“＋”表示初步形成菌落Initial formation of colony；“＋＋”表示形成典型菌落Typical formation of colony；“＋＋＋”表示形成旺盛生長菌落Formation of actively growing colony；“n”表示未測定No test

2.6 菌株對(duì)碳源的發(fā)酵利用

選取了4菌株sd037、sd106、sd194、sd372 為代表，測定了新分離水稻內(nèi)生固氮菌對(duì)78種碳源的發(fā)酵利用。整體來看菌株對(duì)碳源的利用種類不多。乳酸鈉、蔗糖、葡萄糖、甘油、蘋果酸、丙氨酸、葡萄糖醛酰胺是菌株利用較多的碳源，其他碳源則較少被利用（表4）。

表4 新分離菌株對(duì)碳源的發(fā)酵利用

“－”表示不利用No utilization；“＋”表示利用Utilization；“±”表示少量利用Slightly utilization

2.7 菌株對(duì)水稻苗期生長及植株Cd含量的影響

從根長來看，菌株sd385顯著促進(jìn)根生長，而菌株sd039、sd237、sd372則表現(xiàn)出對(duì)根生長的抑制作用。從株高來看，接種分離菌株后稻苗普遍低于對(duì)照，5個(gè)處理達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著水平。從植株鮮重來看，接種分離菌株后稻苗生物量普遍高于對(duì)照處理，5個(gè)處理sd086、sd232、sd308、sd385、sd400均顯著高于對(duì)照，說明接種水稻內(nèi)生固氮菌可以顯著提高稻苗生物量（表5）。菌株sd385使稻苗根系顯著伸長，生物量顯著增加，株高增加，值得進(jìn)一步研究。

有6個(gè)菌株促進(jìn)水稻苗期Cd吸收，與對(duì)照相比植株Cd含量增加6.41%—38.45%。其他13個(gè)菌株抑制水稻苗期Cd吸收，與對(duì)照相比植株Cd含量減少2.06%—34.46%（表5）。

表5 接種水稻內(nèi)生固氮菌對(duì)水稻苗期生長及植株Cd吸收的影響

“*”表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異達(dá)到0.05顯著水平Significant differences at 5% level

3 討論

學(xué)術(shù)上較嚴(yán)格的植物內(nèi)生菌（endophytic bactcria）概念是指從經(jīng)過表面消毒的植物組織器官或植物體內(nèi)分離提取出來的對(duì)植物本身有益無害的細(xì)菌[17]。現(xiàn)在這個(gè)概念有了一些擴(kuò)大，通常認(rèn)為植物內(nèi)生菌泛指生活史或某個(gè)生命階段生活在健康植物體內(nèi)，不引起宿主植物外在病癥的細(xì)菌、真菌或放線菌[18]，但不包括在植物體內(nèi)定殖，引起寄生植物病害的致病菌，也不包括菌根真菌[19]。

水稻內(nèi)生固氮菌是指從水稻體內(nèi)分離、并且檢測到固氮基因（）或者檢測到固氮酶活性的細(xì)菌。從文獻(xiàn)資料來看，目前關(guān)于水稻內(nèi)生菌的研究報(bào)道較多[1,20-23]，水稻內(nèi)生菌固氮菌的研究報(bào)道相對(duì)少一些。關(guān)于內(nèi)生固氮菌的研究大多集中在高效菌株分離鑒定與促生特性研究[8,24-26]，分離到的菌株有等。關(guān)于水稻內(nèi)生固氮菌系統(tǒng)發(fā)育的研究報(bào)道是分離鑒定了25株水稻內(nèi)生固氮菌，這些菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位分別屬于芽孢桿菌（）、伯克霍爾德氏菌（）、腸桿菌（）、黃桿菌（）、草螺菌（）、克雷伯氏菌（）、類芽孢桿菌（）、泛菌（）、根瘤菌（），共計(jì)9屬16種[15]。本文分離鑒定了19株水稻內(nèi)生固氮菌，在系統(tǒng)發(fā)育地位上分別屬于芽孢桿菌（）短桿菌（）（）類芽孢桿菌（），其中短桿菌（）和（）是未曾報(bào)道過的水稻內(nèi)生固氮菌屬種，同時(shí)豐富了內(nèi)生固氮菌的芽孢桿菌新類群。

菌株的生物學(xué)特性，特別是與環(huán)境適應(yīng)性和微生物肥料生產(chǎn)應(yīng)用相關(guān)的特性，是菌株在自然界生存、在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮作用的基礎(chǔ)。本文檢測了分離菌株的產(chǎn)堿、產(chǎn)孢、高溫生長、產(chǎn)蛋白酶、產(chǎn)纖維素酶等特性。菌株的產(chǎn)堿能力與菌株對(duì)土壤重金屬Cd的鈍化有關(guān)，原理是菌株產(chǎn)堿引起土壤pH升高，減少了Cd在土壤溶液中的溶解性，從而減少植株對(duì)Cd的吸收，本試驗(yàn)結(jié)果支持這一觀點(diǎn)。對(duì)19個(gè)菌株產(chǎn)堿能力測定的結(jié)果顯示，其中4個(gè)菌株sd010、sd039、sd232、sd373的發(fā)酵液終pH為8.5—9.0，它們對(duì)應(yīng)的稻苗Cd含量增減百分比分別為-8.59%、-14.03%、-22.37%、-15.11%，全部是減少稻苗Cd含量。菌株sd106、sd194、sd237發(fā)酵液終pH 7.0，沒有顯示出產(chǎn)堿性能，對(duì)應(yīng)的稻苗Cd含量增減百分比為分別為-34.46%、-29.99%、-31.44%?？紤]到土壤環(huán)境和實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)環(huán)境的巨大差異，筆者認(rèn)為這個(gè)試驗(yàn)結(jié)果還是顯示了菌株的產(chǎn)堿能力與減少稻苗Cd含量存在相關(guān)性，是一個(gè)值得深入研究的現(xiàn)象。

芽孢（spore）是指某些細(xì)菌在一定的環(huán)境條件下，在菌體內(nèi)部形成一個(gè)圓形或卵圓形小體，是細(xì)菌的休眠方式，稱為內(nèi)芽孢（endospore），簡稱芽孢。菌株的產(chǎn)孢能力強(qiáng)，對(duì)不良環(huán)境的耐受能力也強(qiáng)。菌株的高溫生長能力反映了菌株對(duì)較高溫度的適應(yīng)性，這一性狀對(duì)于微生物肥料的生產(chǎn)應(yīng)用很重要，比如菌劑的工廠化生產(chǎn)和堆肥發(fā)酵等就涉及到50℃甚至更高的溫度。菌株產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶的能力反映了菌株對(duì)蛋白質(zhì)和纖維素類物質(zhì)的分解代謝能力，也是菌株生存競爭能力的重要指標(biāo)。試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)一個(gè)有趣的現(xiàn)象，菌株sd032、sd037、sd039、sd372、sd373產(chǎn)生蛋白酶和纖維素酶的能力較強(qiáng)，在48℃的生長能力也較強(qiáng)，在產(chǎn)孢液體培養(yǎng)基上生長好，在固體產(chǎn)孢培養(yǎng)基上產(chǎn)孢率高，產(chǎn)堿能力也相對(duì)較強(qiáng)，似乎顯示出一種強(qiáng)者恒強(qiáng)的特性。

病害是水稻生產(chǎn)中的一大問題，多年來主要依靠抗病育種和農(nóng)藥防治。生物防治開辟了一條預(yù)防水稻病害的新途徑。因此，水稻病害的生物防治一直是水稻內(nèi)生菌研究的熱點(diǎn)之一[27-30]。仔細(xì)分析就會(huì)發(fā)現(xiàn)，水稻內(nèi)生菌研究報(bào)道中的細(xì)菌有很多就是固氮菌，只是研究者沒有研究菌株的生物固氮特性，或者說沒有從水稻內(nèi)生固氮菌的角度進(jìn)行研究和分析討論，比如在Mano發(fā)表的一篇水稻內(nèi)生細(xì)菌綜述中所列舉的很多細(xì)菌屬種就是作者分離、鑒定過的固氮菌[1,13,15,31]。事實(shí)上，生物固氮特性只是固氮菌的基本特性，很多固氮菌都有提高植物抗病、抗逆等多種特性[12,16,31]，這使得內(nèi)生固氮菌研究更有意義。本文以3株病原真菌立枯絲核菌ACCC36246、禾谷鐮孢ACCC36249、擬枝孢鐮孢ACCC37402作為靶標(biāo)，測試分離到的19株水稻內(nèi)生固氮菌的拮抗性能，結(jié)果3株內(nèi)生固氮菌對(duì)立枯絲核菌具有抗性，3株內(nèi)生固氮菌對(duì)禾谷鐮孢菌具有抗性，3株內(nèi)生固氮菌對(duì)擬枝孢鐮孢菌具有抗性。說明在自然生長的水稻體內(nèi)有大約1/6的內(nèi)生固氮菌對(duì)真菌病害具有天然的抗性。同時(shí)，這個(gè)結(jié)果也提示研究者，這些抗病菌株具有很大的潛能，如果把這些功能菌株做成菌劑接種水稻秧苗，可能對(duì)預(yù)防水稻病害起到很好的作用。

抗生素和殺菌劑有共同點(diǎn)，也有不同點(diǎn)。共同點(diǎn)在于它們都是用于殺滅病原微生物，不同點(diǎn)在于抗生素主要用于人、畜等動(dòng)物，殺菌劑主要用于農(nóng)業(yè)種植、養(yǎng)殖如農(nóng)田、養(yǎng)殖場。研究菌株對(duì)抗生素和殺菌劑耐性的意義也是不同的。菌株對(duì)抗生素的耐性越強(qiáng)，菌株就越是難以被控制，傳播耐藥性的機(jī)率就越大，環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)也就越大。所以，筆者在篩選功能菌株時(shí)希望菌株的耐藥性小，最好是抗生素敏感菌株，這樣在使用時(shí)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)小，便于控制菌株傳播。而對(duì)于殺菌劑的耐性則希望篩選到耐藥性較強(qiáng)的菌株。原因是水稻種植過程中病害嚴(yán)重，特別是在中國北方寒地水稻早春育秧過程中苗床發(fā)病率很高，水稻生產(chǎn)離不開殺菌劑。目前能做的就是將化學(xué)殺菌劑與生物防治（抗病功能菌劑）措施配合使用，逐漸減少化學(xué)殺菌劑的用量。要做到與化學(xué)殺菌劑配合使用，就需要功能菌株具有較強(qiáng)的殺菌劑耐性。本文檢測了18株新分離菌株對(duì)8種抗生素和6種殺菌劑的耐藥性，發(fā)現(xiàn)了一些對(duì)抗生素敏感，對(duì)殺菌劑耐性強(qiáng)的菌株，這對(duì)于基礎(chǔ)數(shù)據(jù)積累和應(yīng)用技術(shù)開發(fā)都有積極意義。

細(xì)菌對(duì)不同碳源的發(fā)酵利用能力是菌株的基本特性，具有種屬特點(diǎn)，因此BIOLOG測定常用于菌株鑒定。本文進(jìn)行分離菌株的BIOLOG測定，不僅是積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，更多地希望了解菌株對(duì)多種碳源的發(fā)酵利用能力。因?yàn)檫@些數(shù)據(jù)作為基礎(chǔ)研究，有助于了解水稻內(nèi)生固氮菌的碳源利用特點(diǎn)和菌株鑒定等；作為應(yīng)用研究，有助于篩選功能菌株，以及設(shè)計(jì)工廠化菌劑生產(chǎn)配方等。本文測定了菌株對(duì)多種碳源的發(fā)酵利用，結(jié)果顯示4個(gè)代表菌株對(duì)78種碳源的利用種類較少，這也許正是水稻內(nèi)生固氮菌的特異之處，需要將來擴(kuò)大菌株數(shù)量繼續(xù)研究。

將進(jìn)入土壤的重金屬元素剝離土壤非常困難，科學(xué)工作者發(fā)明了物理、化學(xué)、生物、工程等多種方法來阻控土壤Cd污染[32]。比較徹底的修復(fù)方法是植物修復(fù)法[33]，通過種植Cd高積累植物把土壤中的Cd剝離出來[34-35]。另一種研究較多的方法是原位修復(fù)法[36]，通過大量施用生物炭等有機(jī)物料[37]，或者海泡石、黏土等礦物類物料[38]，改變土壤理化性狀，阻止Cd進(jìn)入稻米。

采用植物內(nèi)生菌修復(fù)重金屬污染土壤是近年來的一個(gè)新的研究熱點(diǎn)[39]，植物-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)展示出良好的應(yīng)用前景[40-41]。耐Cd微球菌sp. TISTR2221顯著促進(jìn)玉米對(duì)Cd的吸收積累，使試驗(yàn)土壤中Cd含量大大降低[42]。田間試驗(yàn)表明，接種羅爾斯頓菌sp. TISTR 2219和節(jié)桿菌sp. TISTR 2220的丁香（）移栽2個(gè)月后體內(nèi)Cd積累量與不接種對(duì)照相比增加了20%—40%[43]。國內(nèi)學(xué)者的大量研究工作也驗(yàn)證了微生物在植物-微生物聯(lián)合修復(fù)土壤Cd污染中的巨大作用[44-47]。本試驗(yàn)結(jié)果也顯示出接種水稻內(nèi)生固氮菌可以顯著影響水稻苗期Cd吸收，19株內(nèi)生固氮菌中有1/3菌株促進(jìn)水稻苗期Cd吸收，2/3菌株抑制水稻苗期Cd吸收。

4 結(jié)論

從湖南郴州桂陽農(nóng)田水稻上分離到19株內(nèi)生固氮菌，菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位屬于4屬13種。部分菌株產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶能力強(qiáng)，48℃生長良好，產(chǎn)孢率高（60%—90%），產(chǎn)堿（pH 8.5—9.0），對(duì)立枯絲核菌、禾谷鐮孢、擬枝孢鐮孢具有拮抗性，對(duì)抗生素相敏感，對(duì)殺菌劑耐性強(qiáng)，具有良好應(yīng)用前景。試驗(yàn)的19株內(nèi)生固氮菌中有13個(gè)菌株抑制水稻苗期Cd吸收，與對(duì)照相比植株Cd含量減少2.06%—34.46%，提示采用微生物方法阻控稻田Cd污染是一個(gè)非常值得研究、探討的途徑。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Isolation and Biological Properties of Endophytic Diazotrophs from Rice and Their influences on Rice seedling Cd Accumulation

YUAN Mei1, TAN Shi-juan2, SUN Jian-guang1

(1Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Microbial Resources, Ministry of Agriculture, Beijing 100081;2Guiyang Agricultural Bureau, Chenzhou 424400, Hunan)

【Objective】The objective of this study is to isolate, identify and analyze phylogenetics of endophytic diazotrophs from rice planted in Hunan province, test the biological characteristics of the isolates, and to explore the influences of diazotroph inoculation on rice seedlings Cd accumulation. 【Method】Surface sterilization and low nitrogen medium were used to isolate endophytic diazotrophs.detection was conducted based on PCR amplification to confirm the isolates as nitrogen-fixing bacteria. 16S rRNA was amplified with PCR, blasted in EzTaxon after sequencing, and analyzed with Clustalx-MEGA to make phylogenetic tree. Greenhouse trials were conducted to investigate the influence of diazotroph inoculation on rice seedling Cd accumulation. 【Result】Nineteen endophytic diazotrophs were isolated from root, stem and leaf of 8 rice samples. These 19 strains phylogenetically belong to4genus 13 species of,,,,,,,,,.,,,. Biological tests showed that about 1/3 of the 19 strains produce protease and cellulose, grow well at 48℃, form spores well with percentage 60%-90%, produce alkali with final pH 8.5-9.0. About 1/6 of the 19 strains are antagonistic against plant pathogenicACCC36246,ACCC36249 andACCC37402 with rate of 42%-55%. About 2/3 of the 19 strains showed sensitive to antibiotics and resistant to fungicide. Four representative strains of the 19 could utilize 7 of the 78 carbon sources, sodium lactate, sucrose, dextrose, glycerol, malic acid, alanine and glucuronic acid amide. Greenhouse trials showed that 6 of the 19 strains promoted rice seedling Cd absorption with increase of 6.41%-38.45%, and other 13 strains decreased rice seedling Cd absorption with 2.06%-34.46% compared with control.【Conclusion】Nineteen endophytic diazotrophs were isolated from rice planted in Hunan. These 19 strains phylogenetically belong to 4 genus 13 species of,,and. Partial strains produce protease and cellulose, grow well at 48℃, form spores well, antagonistic against plant pathogenic,andhave good prospects of application. Inoculation of diazotroph can significantly affect rice seedling Cd absorption. The results suggest that application of microbial method to control paddy Cd is a very worthwhile pathway.

rice; endophytic diazotrophs; biological property; Cd

2016-04-13；接受日期：2016-04-25

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201203045）

袁梅，E-mail：yuanmei1010@163.com。通信作者孫建光，Tel：010-82108701；E-mail：jgsun@caas.ac.cn