童 鑫，張瑞芬，鄧媛元，肖 娟，劉 磊，張 雁，魏振承，張名位

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米糠酚類物質(zhì)的大孔樹脂分離純化工藝

童 鑫1,2，張瑞芬1，鄧媛元1，肖 娟1，劉 磊1，張 雁1，魏振承1，張名位1

（1廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部功能食品重點實驗室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣州 510610；2華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣州 510642）

【目的】建立米糠中酚類物質(zhì)的大孔樹脂分離純化工藝，比較米糠提取物純化前后總酚、總黃酮含量及抗氧化能力，為米糠的深加工利用提供參考?！痉椒ā勘容^9種不同類型大孔吸附樹脂（HPD-100、HPD-200A、HPD-300、HPD-700、D101、HPD-722、AB-8、ADS17和HPD-826）對米糠提取物中總酚的靜態(tài)吸附和解吸性能，篩選出對脫脂米糠酚類物質(zhì)純化效果最佳的大孔吸附樹脂類型；通過考察其靜態(tài)吸附動力學曲線，比較不同上樣液濃度、上樣流速和上樣體積下的動態(tài)吸附曲線以及采用不同濃度乙醇洗脫的解吸效果，建立米糠多酚的大孔吸附樹脂吸附和解吸工藝條件；比較HPD-300型大孔吸附樹脂純化前后總酚、總黃酮含量，采用高效液相色譜法結(jié)合應用酚類標準品分析米糠提取物經(jīng)大孔吸附樹脂純化前后其各單體酚類物質(zhì)種類與含量，并通過氧自由基吸收能力（oxygen radical absorption capacity，ORAC）和細胞抗氧化分析法（cellular antioxidant activity，CAA）比較其純化前后的抗氧化活性?！窘Y(jié)果】9種類型大孔吸附樹脂對脫脂米糠提取物酚類物質(zhì)均有一定的吸附能力，其中HPD-300型大孔吸附樹脂對脫脂米糠總酚靜態(tài)吸附和解吸效果明顯優(yōu)于其他類型樹脂，其飽和吸附量為9.04 mg GAE·g-1，解吸率為82.62%，同時米糠總酚靜態(tài)吸附在6 h時達到飽和值。HPD-300型大孔吸附樹脂最佳吸附和解吸工藝條件為：米糠酚類提取液上樣濃度為1.0 mg GAE·mL-1，上樣流速為3.0 BV·h-1，上樣體積為3.5 BV，洗脫劑為70%乙醇溶液，洗脫流速為3.0 BV·h-1。經(jīng)HPD-300型大孔吸附樹脂純化后，米糠酚類提取物的總酚和總黃酮含量分別從純化前的88.07 μg GAE·mg-1和30.04 μg CE·mg-1提高到320.72 μg GAE·mg-1和133.67 μg CE·mg-1，分別提高了2.6和3.4倍。經(jīng)高效液相色譜分析，米糠酚類提取物經(jīng)HPD-300型大孔吸附樹脂純化后，其中的沒食子酸、原兒茶酸、香草酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、香草醛、對香豆酸和阿魏酸等10種酚類單體組成未見明顯變化和損失，且上述酚類單體在提取物中的含量較純化前分別提高0.4—2.4倍。純化后提取物的ORAC和CAA值分別為3 248.21 μmol TE·g-1和95.24 μmol QE·g-1，較純化前的1 327.51 μmol TE·g-1和29.19 μmolQE·g-1，分別提高了1.4和2.2倍。【結(jié)論】HPD-300型大孔吸附樹脂適合米糠酚類物質(zhì)的分離純化，經(jīng)其純化后的米糠提取物中總酚、總黃酮含量及抗氧化活性提高1—3倍，且不會造成單體酚的明顯損失。

米糠；酚類物質(zhì)；大孔樹脂；純化；細胞抗氧化；氧自由基吸收能力

0 引言

【研究意義】隨著營養(yǎng)知識的普及和人們健康意識的增強，全谷物膳食越來越受到人們的重視。流行病學調(diào)查結(jié)果顯示：增加膳食中全谷物的比例有利于高脂血癥等許多慢性疾病的防治[1]。全谷物是指除去外殼等不可食用部分后的完整、碾碎、破碎或壓片的穎果，包括淀粉質(zhì)胚乳、胚芽與麩皮（糠層）。與精谷物相比，全谷物因為保留了其糠層而含有更多的維生素、膳食纖維等營養(yǎng)成分，同時其酚類物質(zhì)等非營養(yǎng)素植物活性物質(zhì)含量也遠高于精谷物。大量研究表明植物多酚具有抗氧化、抗病毒、抗癌、免疫、護肝和保護心血管等生物活性[2-3]。項目組研究發(fā)現(xiàn)，占全谷物糙米重量約10%的米糠層含有整粒糙米中超過50%的酚類物質(zhì)[4]。另有研究表明全谷物不同部位的酚類物質(zhì)組成及其抗氧化活性不同，米糠層的抗氧化活性大于胚乳部分[5]。因此，探明米糠中酚類物質(zhì)組成、含量及其生物活性對于揭示全谷物膳食的健康效應，指導米糠的綜合加工利用和引導稻米加工產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前已有關(guān)于米糠酚類物質(zhì)的相關(guān)研究，JUNG等[6]測得脫脂米糠中總酚含量為41.65 mg GAE·100g-1DW，通過高效液相色譜法從米糠提取物中檢測到阿魏酸、芥子酸、苯甲酸、香豆酸等酚類物質(zhì)，其中阿魏酸含量最高。SUKHONTHA等[7]在脫脂米糠水提物中檢測到原兒茶酸、香草酸、香豆酸、阿魏酸和芥子酸等酚類物質(zhì)。體內(nèi)外試驗證實米糠中酚類物質(zhì)具有抗氧化[8]、抗炎[9]、抗癌[10]等活性。盡管已經(jīng)有學者對米糠中酚類物質(zhì)組成、含量及其生物活性開展了研究，但目前關(guān)于米糠酚類物質(zhì)生物活性研究采用的試驗材料多為米糠經(jīng)水或乙醇等溶劑浸提后得到的粗提物，含有較多的粗蛋白、可溶性糖類等雜質(zhì)，對其酚類物質(zhì)含量及其活性的測定結(jié)果都會造成干擾。為探明米糠中酚類物質(zhì)組成，也有學者利用硅膠柱、聚酰胺柱等柱層析方法對橄欖酚類提取物進行分離純化[11]，但這些方法是以分離制備到單個化合物為目標，不適用于以去除雜質(zhì)同時保留提取物中各酚類成分為目標的分離純化。目前常用的酚類物質(zhì)純化方法有大孔樹脂吸附純化、硅膠柱層析法、聚酰胺層析法、膜分離法、高效液相色譜半制備色譜分離法、高速逆流色譜法等方法，其中大孔樹脂吸附純化具有吸附容量大，物理化學穩(wěn)定性高，富集效果好，解吸條件溫和，再生處理方便和成本低等的優(yōu)點。不同極性大孔樹脂對酚類物質(zhì)的分離效果比較已有研究[12-13]?！颈狙芯壳腥朦c】不同來源的酚類物質(zhì)因其所含多酚的種類及結(jié)構(gòu)不同，適于分離純化的大孔樹脂類型及其純化工藝條件會存在明顯差別。研究表明米糠中的酚類物質(zhì)組成以酚酸為主，與蘋果等的多酚以黃酮類為主有明顯的不同[14-15]。目前關(guān)于蘋果、茶葉等來源的多酚的大孔樹脂分離純化工藝已有大量的研究報道，但關(guān)于米糠酚類物質(zhì)分離純化的研究未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以脫脂米糠丙酮/水提取物為材料，通過比較9種不同極性大孔吸附樹脂對米糠酚類物質(zhì)的吸附和解吸特性，篩選出對米糠酚類物質(zhì)具有良好純化效果的樹脂類型，并優(yōu)化其純化工藝參數(shù)，旨在為建立米糠酚類物質(zhì)分離純化工藝提供技術(shù)支撐，指導稻米加工副產(chǎn)物的綜合開發(fā)利用。

1 材料與方法

試驗于2015年3—8月在廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部功能食品重點實驗室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室進行。

1.1 試驗材料與主要儀器

1.1.1 原料 供試米糠品種為天優(yōu)998水稻米糠層部位，由廣州荔泉食品有限公司提供，將新鮮制備的米糠采用CO2超臨界萃取萃取技術(shù)進行脫脂處理，得到脫脂米糠后（脫脂后米糠油脂含量為0.1%），參照文獻報道方法制備其酚類物質(zhì)提取物[16]。

1.1.2 大孔樹脂 HPD-100、HPD-200A、HPD-300、HPD-700、D101、HPD-722、AB-8、ADS17、HPD-826購自滄州寶恩吸附材料科技有限公司；黑壁透明底96孔板購自美國Corning公司。

1.1.3 試劑 沒食子酸、原兒茶酸、香草酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、香草醛、對香豆酸、阿魏酸、福林酚試劑、Trolox、ABAP、DCFH-DA、熒光素二鈉鹽和二水合槲皮素購于Sigma Aldrich公司；HepG2細胞購自中國科學院上海生科院細胞資源中心；DMEM培養(yǎng)基購于Thermo Fisher Scientific公司；胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 儀器 IKA T25高速均質(zhì)機，德國IKA公司；

EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，京東理化器械株式會社；FDU-2100冷凍干燥機，東京理化器械株式會社；TD6冷凍離心機，長沙湘智離心機儀器有限公司；HZQ-QX智能型全溫振蕩器，哈爾濱東聯(lián)電子開發(fā)有限公司；Vortex Genie 2多用途渦旋混合器，美國Scientific Industries公司；UV-2450紫外可見分光光度計，日本島津公司；Infinite M200pro 酶標儀，TECAN公司；Agilent1260高效液相色譜儀-Agilent 1260 series DAD檢測器，美國Agilent公司；HERAcell 240i CO2培養(yǎng)箱，Thermo Scientific公司；ULT-2586-4-V超低溫冰箱，Thermo Scientific公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 米糠酚類提取物的制備 精確稱取脫脂米糠10.00 g，加入50 mL 4℃預冷的80%丙酮溶液，冰浴條件下10 000 r/min均質(zhì)10 min，均質(zhì)液在4℃下5 000 r/min離心10 min后，收集上清液。向沉淀中再加50 mL預冷的80%丙酮溶液重復上述過程一次，合并兩次上清液；于45℃下真空旋轉(zhuǎn)濃縮得米糠酚類提取液，冷凍干燥得粉末狀提取物，用水溶解米糠酚類提取物至所需濃度，備用。

1.2.2 樹脂預處理 9種大孔樹脂分別用無水乙醇浸泡24 h，待樹脂充分溶脹后，用無水乙醇淋洗，直至洗出液加適量水無白色渾濁現(xiàn)象為止，再用蒸餾水洗至無乙醇味，備用。

1.2.3 不同極性大孔樹脂靜態(tài)吸附量及解吸率試驗 稱取經(jīng)預處理的濕樹脂HPD-100、HPD-200A、HPD-300、HPD-700、HPD-722、HPD-826、AB-8、ADS17和D101各1.00 g，分別加入100 mL具塞三角瓶中，量取50 mL總酚含量調(diào)整至0.2 mg GAE·mL-1的米糠酚類提取液于各三角瓶，室溫下振蕩24 h，取上清液測定總酚含量，將樹脂濾出并用去離子水清洗3次，用濾紙吸干表面水分，轉(zhuǎn)入100 mL具塞三角瓶中，加入50 mL 80%乙醇，室溫下振蕩解吸12 h，取上清液測定總酚含量，按照下式分別計算吸附量和解吸率。

式中：Q為吸附量（mg·g-1）；C0為起始濃度（mg·mL-1）；C1為平衡濃度（mg·mL-1）；V1為吸附溶液體積（mL）；W為樹脂重量（g）；D為解吸率（%）；C2為解吸后溶液中總酚含量（mg·mL-1）；V2為解吸溶液體積（mL）。

1.2.4 大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學曲線 稱取1.00 g

經(jīng)預處理的濕樹脂，置于100 mL具塞三角瓶中，加入上述米糠酚類提取液50 mL，放入搖床室溫下靜置，每隔30 min震蕩2 min。分別在0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0 h時吸取上清液0.5 mL測定總酚含量，繪制大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學曲線。

1.2.5 大孔樹脂的動態(tài)吸附和解吸

1.2.5.1 上樣流速的確定 將預處理過的大孔樹脂濕法裝柱（柱高200 mm，內(nèi)徑6 mm），上樣濃度和上樣體積分別固定在1.5 mg GAE·mL-1和6.5 BV。室溫條件下，依次用3種不同的流速上樣（1.5、3.0和4.5 BV·h-1）處理大孔樹脂，每流出0.5 BV流出液，收集并測定總酚濃度。其中流出液總酚濃度達到進樣濃度的1/10即為泄漏點，此時為吸附終點，根據(jù)泄漏點出現(xiàn)快慢及吸附量確定最佳上樣流速。

1.2.5.2 上樣濃度的確定 將預處理過的大孔樹脂濕法裝柱，取6.5 BV不同濃度樣液（0.5、1.0、1.5和2.0 mg GAE·mL-1），室溫條件下，分別在3.0 BV·h-1的上樣流速下通過樹脂柱，每流出0.5 BV流出液，收集并測定總酚濃度。根據(jù)泄漏點出現(xiàn)快慢及吸附量確定最佳上樣濃度。

1.2.5.3 上樣體積的確定 將預處理過的大孔樹脂濕法裝柱，上樣濃度和上樣流速分別固定在1.5 mg GAE·mL-1和3.0 BV·h-1，室溫條件下，取不同體積的樣液通過樹脂柱，每流出0.5 BV流出液，收集并測定總酚濃度。根據(jù)泄漏點出現(xiàn)快慢確定最佳上樣體積。

1.2.5.4 洗脫液濃度的確定 將預處理過的大孔樹脂濕法裝柱，上樣濃度、上樣流速和上樣體積分別固定在1.5 mg GAE·mL-1、3.0 BV·h-1和3.5 BV，室溫條件下，將樣液通過大孔樹脂，待吸附平衡后（6 h），用去離子水洗脫，去除水溶性蛋白、還原糖和多糖等雜質(zhì)，再用不同濃度（50%、60%、70%、80%、90%）的乙醇溶液作為洗脫劑在相同流速下進行洗脫，洗脫液體積均為5 BV，收集全部洗脫液，測定洗脫液中總酚濃度，計算解吸率。

1.2.6 脫脂米糠純化前后總酚及總黃酮含量及其抗氧化能力測定 樣品預處理：按照優(yōu)化后的HPD-300大孔樹脂純化工藝參數(shù)純化后得到的米糠酚類洗脫液，經(jīng)45℃真空旋蒸濃縮至無乙醇，冷凍干燥得粉末狀提取物，取適量溶于甲醇中待進一步檢測。

總酚含量測定：總酚含量的測定參照SINGLETON等[17]的方法略有改動：向試管中分別加入125 μL標準品或待測樣品溶液，再加入0.5 mL超純水和125 μL福林酚試劑。室溫下避光靜置6 min后加入1.25 mL m﹕v為7%的 Na2CO3溶液和1 mL超純水，振蕩混勻，室溫下避光反應90 min，于760 nm下測定其吸光度。以沒食子酸為標準品，總酚含量以每克米糠酚類提取物粉末中所含沒食子酸當量（mg gallic acid equivalents·g-1）表示，單位為mg GAE·g-1。

總黃酮含量測定：總黃酮含量的測定參照JIA等[18]的方法略有改動：向試管中分別加入300 μL標準品或待測樣品溶液，再加入1.5 mL超純水和90 μL m﹕v為5%的NaNO2溶液，振蕩混勻，避光靜置6 min后加入180 μL m﹕v為10%的AlCl3·6H2O溶液，避光反應5 min，再加入0.6 mL 1 mol·L-1的NaOH溶液，然后加入330 μL超純水，于510 nm下測定其吸光度。以兒茶素為標準品，總黃酮含量以每克脫脂米糠提取物粉末中所含兒茶素當量（mg catechin equivalents·g-1）表示，單位為mg CE·g-1。

1.2.7 米糠酚類提取物純化前后單體酚組成及含量分析 將大孔樹脂純化前、后的米糠酚類提取物采用高效液相色譜法分析其單體酚組成及含量。具體液相色譜條件參考ZHANG等的方法略有改動[19]。色譜柱：Zorbox SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL·min-1。流動相：100%乙腈（A）和0.4%冰乙酸（B）。按照以下梯度洗脫：0—40 min，5%—25% A；40—45 min，25%—35% A，總運行時間45 min。采用DAD檢測器，檢測波長280 nm。樣品色譜峰保留時間與標準品保留時間比較，判定單體酚種類，根據(jù)峰面積計算單體酚含量，結(jié)果以μg·mg-1米糠提取物計（μg·mg-1）。

1.2.8 米糠酚類提取物純化前后總酚及總黃酮含量及其抗氧化活性測定 氧自由基清除能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）測定[20]：將米糠酚類提取物用pH 7.4、濃度為75 mmol·L-1的磷酸緩沖液稀釋至不同濃度。向96孔板每孔中分別加入20 μL提取物溶液或Trolox標準品溶液或空白對照，再向每孔加入200 μL預先在37℃孵育過的0.96 μmol·L-1熒光素，此96孔板在37℃條件下孵育20 min。孵育完后，除F孔外，每孔分別加入20 μL用25℃磷酸緩沖液配制的119 mmol·L-1ABAP溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用），F(xiàn)孔中加入20 μL磷酸緩沖液。激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長520 nm條件下測定各孔熒光值，共35個循環(huán)，每個循環(huán)4.5 min。米糠酚類提取物的ORAC值用Trolox當量（μmol Trolox equivalents·g-1）表示，單位為μmol TE·g-1。

細胞抗氧化活性（cellular antioxidant activity，CAA）測定[21]：將HepG2細胞（生長對數(shù)期）轉(zhuǎn)入含有10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，將細胞密度調(diào)整至6×105·mL-1。向96孔細胞培養(yǎng)板中加入100 μL細胞懸液，培養(yǎng)24 h后吸出培養(yǎng)液。再向各孔加入100 μL DMEM培養(yǎng)基（含有25 μmol·L-1DCFH-DA和不同濃度槲皮素標準品或米糠酚類提取物），37℃下孵育1 h。孵育完后，除空白對照孔以外，再向各孔加入含有600 μmol·L-1ABAP的PBS 100 μL，空白對照孔加入100 μL 2ABAP的PBS。在37℃下讀取該96孔板各孔的熒光值，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長520 nm下測定各孔熒光值，共12個循環(huán)，每個循環(huán)5 min。米糠酚類提取物的CAA值用槲皮素當量（μmol Quercetin equivalents·g-1）表示，單位為μmol QE·g-1。

1.3 結(jié)果統(tǒng)計分析

實驗重復3次，結(jié)果用均值±標準差表示，不同極性大孔樹脂靜態(tài)吸附量及解吸率實驗結(jié)果采用SPSS 13.0進行單因素方差分析以及SNK檢驗。純化前后酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性比較采用獨立樣本檢驗，＜0.05時差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同大孔樹脂的靜態(tài)吸附與解吸能力

不同極性的9種大孔樹脂在相同條件下，經(jīng)24 h靜態(tài)吸附后對米糠多酚提取物總酚的吸附量和解吸率如圖1和2所示。結(jié)果表明，HPD-300大孔樹脂的吸附量最高（9.59 mg GAE·g-1），其次是HPD-100（8.84 mg GAE·g-1），兩者間差異顯著（＜0.05）。HPD-200A、HPD-700、HPD-722、D101和AB-8五種樹脂對米糠多酚的吸附效果相當，以ADS-17的吸附效果最差。HPD-100、HPD-200A、HPD-300、HPD-700和HPD-722 的解吸率相當，均在80％以上（＞0.05），高于受試的其他幾種大孔樹脂。綜合考慮大孔樹脂對米糠提取物中總酚的吸附量和解吸率結(jié)果，選取吸附和解吸性能均最好的大孔樹脂HPD-300進行吸附動力學研究。

不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同 Different small letters indicate significant difference (P＜0.05). The same as below

圖2 不同極性大孔樹脂對米糠酚類提取物的靜態(tài)解吸率比較

2.2 HPD-300型大孔樹脂的吸附動力學

HPD-300大孔樹脂吸附米糠酚類物質(zhì)動力學結(jié)果見圖3。靜態(tài)吸附起始階段HPD-300大孔樹脂對米糠總酚的吸附量快速上升，屬于快速平衡型。隨著時間的延長，吸附曲線逐漸變得平緩，樹脂對米糠多酚的吸附量變化緩慢，HPD-300大孔樹脂吸附脫脂米糠總酚的量在6 h后達到吸附平衡。

圖3 HPD-300樹脂吸附米糠酚類物質(zhì)的動力學曲線

2.3 上樣流速

米糠酚類提取物上樣流速對HPD-300大孔樹脂吸附性能的影響見圖4。上樣流速為1.5、3.0和 4.5 BV·h-1時，泄漏點分別在上樣體積為6.0、3.5和2.0 BV附近出現(xiàn)。在上樣流速為1.5、3.0和4.5 BV·h-1時，HPD-300大孔吸附樹脂對米糠酚類提取物總酚的吸附量分別是168、113和81 mg GAE。當上樣流速為1.5 BV·h-1時，泄漏點盡管最晚出現(xiàn)，但上樣時間較長，工作效率低。上樣流速為4.5 BV·h-1時，雖然較快達到泄露點，但大孔樹脂對總酚的吸附量較低，可能是因為上樣流速過快，導致樣液與樹脂表面接觸時間過短，酚類物質(zhì)來不及擴散到樹脂的內(nèi)表面充分吸附，從而降低吸附率。當上樣速度為3.0 BV·h-1時，泄漏點出現(xiàn)相對較早，同時樹脂吸附量較高。綜合考慮純化效率和成本，選擇3.0 BV·h-1為最適宜上樣流速。

圖4 上樣流速對HPD-300樹脂吸附性能的影響

2.4 上樣濃度

米糠酚類提取物上樣濃度對HPD-300大孔樹脂吸附性能的影響見圖5。米糠多酚提取物樣品濃度為2 mg GAE·mL-1時，上樣體積在2 BV時即開始泄漏，泄露點出現(xiàn)太早，樣品處理量少，且在此濃度下樣液黏度較大，且含有沉淀物，容易對樹脂造成堵塞，降低其吸附性能；樣品濃度為0.5 mg GAE·mL-1時，在上樣體積達5.5 BV時才達到泄漏點，此時上樣時間過長，不適于實際應用；當樣品濃度為1.5 mg GAE·mL-1和1.0 mg GAE·mL-1時，泄漏點均在3.5 BV附近出現(xiàn)。樣品濃度為1.0、1.5和2.0 mg GAE·mL-1時，樹脂吸附量分別為141、113和85 mg GAE。樣品濃度為1.0 mg GAE·mL-1時，HPD-300大孔樹脂對米糠酚類物質(zhì)的吸附量最大，因此，將米糠酚類物質(zhì)的上樣濃度確定為1.0 mg GAE·mL-1。

圖5 上樣濃度對HPD-300樹脂吸附性能的影響

2.5 上樣體積

米糠酚類提取物上樣體積對HPD-300樹脂吸附性能的影響見圖6。隨著上樣體積的增加，流出液中總酚濃度隨之增加，在3.5 BV時，流出液中總酚濃度為150 μg GAE·mL-1，達到泄漏點，上樣量繼續(xù)增加，流出液中總酚含量繼續(xù)升高，因此選擇上樣量為3.5 BV。

圖6 上樣體積對HPD-300樹脂吸附性能的影響

2.6 洗脫液的濃度

洗脫液乙醇體積分數(shù)對HPD-300大孔樹脂吸附的米糠酚類物質(zhì)的解析性能見圖7。HPD-300大孔樹脂的解吸性能隨著洗脫液乙醇濃度的增加呈先上升后降低的趨勢，當洗脫液乙醇體積分數(shù)為50%時，解吸率最低，為70.8%；隨著洗脫液乙醇體積分數(shù)的提高，在70%時，解吸率達到最大，為86.41%；當乙醇體積分數(shù)提高到80%和90%時，解吸率有所下降，分別為80.24%和77.35%。因此，選擇70%乙醇為洗脫溶劑。

圖7 不同乙醇濃度洗脫液對HPD-300樹脂吸附的米糠酚類物質(zhì)解吸率的影響

2.7 純化前后米糠提取物中單體酚類的組成與含量

大孔樹脂HPD-300純化前后的米糠酚類提取物HPLC譜見圖8。由圖可見，米糠酚類提取物純化前在2—5 min有較多雜峰，純化后雜峰有所減少，且后面主要的酚類物質(zhì)均被很好地保留，說明HPD-300大孔樹脂適用于米糠多酚的分離純化。從脫脂米糠中共檢測到10種單體酚類物質(zhì)，經(jīng)樹脂純化前后的含量見表1。米糠酚類提取物中含量最高的酚類物質(zhì)是阿魏酸、沒食子酸、對香豆酸。經(jīng)HPD-300大孔樹脂處理后，酚類物質(zhì)有所損失，是由于在上樣后洗脫除雜過程中，少部分酚類物質(zhì)被洗脫下來而損失掉，同時在解析過程中洗脫液對吸附到樹脂上的米糠酚類物質(zhì)的解析能力無法達到100%，會有少量酚類物質(zhì)吸附在樹脂上造成純化過程中的損失。經(jīng)過HPD-300大孔樹脂吸附脫脂米糠中單體酚構(gòu)成譜并未發(fā)生明顯改變，由表1可以看出，各單體酚組分含量均有明顯增加。綜上所述，HPD-300樹脂能較好地分離純化脫脂米糠提取物中酚類物質(zhì)。

A：純化前；B：純化后 A: Before purification; B: After purification。1：沒食子酸 Gallic acid；2：原兒茶酸Protocatechuic acid；3：香草酸Vanillic acid；4：對羥基苯甲酸4-Hydroxybenzoic acid；5：咖啡酸Caffeic acid；6：丁香酸Syringic acid；7：表兒茶素Epicatechin；8：香草醛Vanillin；9：對香豆酸p-coumaric acid；10：阿魏酸Ferulic acid

表1 HPD-300大孔樹脂純化前后米糠酚類提取物中單體酚種類及含量比較

2.8 純化前后米糠提取物總酚、總黃酮含量及抗氧化能力

米糠酚類提取物經(jīng)大孔樹脂純化前后的總酚、總黃酮含量及抗氧化能力見表2。純化后米糠酚類提取物中總酚和總黃酮含量分別為320.72 μg GAE·mg-1和133.67 μg CE·mg-1，較純化前的88.07 μg GAE·mg-1和30.04 μg CE·mg-1分別提高了2.6和3.4倍。純化前的脫脂米糠酚類提取物CAA和ORAC值分別為29.19 μmol QE·g-1和1 327.51 μmol TE·g-1，而純化后的CAA和ORAC值分別為95.24 μmol QE·g-1和3248.21μmol TE·g-1，較純化前分別提高了2.2和1.4倍。

表2 HPD-300大孔樹脂純化前后米糠酚類提取物總酚總黃酮含量和抗氧化能力比較

3 討論

3.1 大孔樹脂極性對米糠酚類物質(zhì)吸附性能的影響

大孔樹脂是一種包含網(wǎng)狀孔穴結(jié)構(gòu)、不含交換基團的高分子吸附材料，由于其較多的網(wǎng)狀孔穴結(jié)構(gòu)、較大的顆粒比表面積以及一定的極性基團，因而具有較大的吸附能力。有機化合物根據(jù)其分子體積的大小及吸附力的強弱，可吸附在一定規(guī)格的大孔吸附樹脂上，采取適當?shù)娜軇┫疵摽蛇_到分離的目的[22]。不同極性和含不同官能團的樹脂對各類化合物的吸附能力不同，因此，對于分離純化植物中的有效成分，選擇適合的樹脂型號非常重要。已有大量文獻報道不同植物來源的酚類物質(zhì)的分離純化適用不同大孔樹脂類型。凌慶枝等[23]比較了7種不同極性的大孔吸附樹脂（AB-8、D-101、HPD-450 、HPD-500、HPD-600、HPD-750、NKA-9）對蘆根總酚酸的分離純化作用，結(jié)果顯示HPD-500型大孔樹脂對蘆根總酚酸成分具有較好的吸附和解吸性能，精制純化后，蘆根提取物中總酚酸含量較純化前提高了10倍，說明HPD-500型大孔樹脂對酚酸類化合物的富集具有高選擇性。李文蘭等[24]比較了4種大孔吸附樹脂（AB-8、D-101、X-5和NKA-9）對川穹中阿魏酸及總酚酸的分離純化效果，發(fā)現(xiàn)D-101型大孔樹脂對川穹中阿魏酸及總酚酸具有較好的吸附效果。馮進等[25]通過比較8種大孔樹脂（AB-8、D-101、DM-130、HPD-100、HPD-400、HPD-400A、HPD-750和HPD-826）對藍莓葉多酚的靜態(tài)吸附與解吸效果，發(fā)現(xiàn)HPD-400大孔樹脂對富含咖啡酰奎寧酸與槲皮素甙的藍莓葉多酚的吸附解吸效果最好。非極性和弱極性的大孔吸附樹脂對于極性溶劑（水）提取物中的芳香族化合物具有較好的吸附性能[26]。由高效液相色譜分析結(jié)果可以看出，米糠提取物中所含酚類物質(zhì)是一類水溶性的具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的芳香族化合物，因而非極性（HPD-100、HPD-300、HPD-700和D101）及弱極性（HPD-722和AB-8）的大孔吸附樹脂對米糠多酚的吸附量均較好，其中HPD-300樹脂的比表面積最大（800—870 m2·g-1），孔徑最?。?0—55A°），更有利于小分子物質(zhì)的吸附，因而表現(xiàn)出較好的吸附性能。

3.2 大孔樹脂吸附和解吸性能對米糠酚類物質(zhì)吸附性能的影響

大孔樹脂的分離效果不僅與樹脂極性相關(guān)，上樣及洗脫條件也會影響樹脂的吸附性能。目前已有大量關(guān)于上樣流速、上樣濃度等因素影響大孔樹脂吸附性能的研究報道。楊芙蓮等[27]比較了不同上樣濃度（0.16、0.24、0.32、0.40和0.48 mg·mL-1）及上樣流速（1.0、2.0和3.0 mL·min-1）對AB-8大孔樹脂吸附甜蕎麥殼黃酮性能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樹脂的吸附率隨上樣濃度的增大而減小，隨上樣流速增大則泄漏率呈增大趨勢，綜合考慮吸附率，確定最佳吸附工藝條件為吸附液濃度0.24 mg·mL-1、吸附流速2.0 mg·mL-1。王雅等[28]采用動態(tài)吸附分離法，研究沙棗多酚提取物不同上樣濃度（0.25、0.5、1.0、1.5和2.0 mg·mL-1）和上樣流速（0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mL·min-1）下NKA-9大孔樹脂的泄漏曲線，發(fā)現(xiàn)上樣濃度為1.0 mg·mL-1，上樣流速為1.0 mL·min-1時樹脂對沙棗多酚的吸附性能較好。以上研究結(jié)果均說明，在高濃度樣品和較高上樣速度時，盡管上樣時間縮短，但泄漏點出現(xiàn)較早，樹脂對總酚的吸附量較低。其原因可能是上樣濃度過高導致過多的多酚分子停留在樹脂表面，阻礙其他酚類物質(zhì)進入樹脂內(nèi)部，使得酚類物質(zhì)無法在樹脂內(nèi)擴散吸附，從而降低樹脂的吸附率；當較高上樣流速時，酚類物質(zhì)和樹脂接觸時間很短，酚類物質(zhì)尚未被吸附到樹脂的內(nèi)表面就被流出，使得樹脂吸附率下降。而在過低的樣品濃度和較慢的上樣流速時，泄漏點雖然出現(xiàn)較晚但作業(yè)周期延長，不利于實際生產(chǎn)應用。中等樣品濃度和上樣流速增加了酚類物質(zhì)與樹脂的接觸，有利于提高樹脂對酚類物質(zhì)的吸附量，延遲泄漏點出現(xiàn)時間。本研究與以上文獻報道一致，中等樣品濃度和上樣流速更有利于米糠提取物酚類物質(zhì)的分離純化。

上樣體積也是影響樹脂吸附性能的重要因素。當上樣體積過大時樹脂容易發(fā)生吸附過飽和，酚類物質(zhì)無法再擴散到樹脂內(nèi)部進行吸附，且上樣體積過大，樹脂柱上部容易發(fā)生多層吸附，或是樹脂孔隙深處吸附的樣液溶質(zhì)分子過多，二者結(jié)合作用力增強，樹脂對溶質(zhì)分子的吸附量超過了其飽和吸附量，發(fā)生樹脂局部中毒現(xiàn)象，造成大孔樹脂再生困難，影響樹脂的重復利用。本研究顯示，上樣體積為3.5 BV時，流出液中總酚濃度達到泄漏點，樹脂吸附飽和。

乙醇水溶液是大孔樹脂分離純化過程中常使用的洗脫溶液，不同的乙醇濃度對樹脂解吸活性成分的解吸效果明顯不同。吳彩娥等[29]研究青錢柳葉總黃酮大孔樹脂純化工藝，比較3種不同濃度乙醇洗脫液（50%、70%、90%）對AB-8樹脂解吸性能的影響，發(fā)現(xiàn)樹脂的解吸率隨洗脫液濃度的增加呈先上升后下降的趨勢，70%的乙醇洗脫率最佳。冀德富等[30]比較了5種不同濃度乙醇洗脫液（5%、30%、50%、70%、90%）對HPD-100大孔樹脂吸附的葉下珠總多酚的解吸效果，發(fā)現(xiàn)50%乙醇洗脫所得固形物中總酚含量最高?？梢姡驑渲愋秃图兓宇愇镔|(zhì)的不同，適宜的洗脫液濃度會有差別。本研究結(jié)果顯示，70%乙醇對米糠多酚有較好的洗脫效果，一方面可能是由于米糠中的多酚多為水溶性物質(zhì)，其解吸需要一定的含水量，當乙醇濃度過高時，洗脫劑中含水量較少，米糠酚類物質(zhì)難以溶出，導致解吸率較低；另一方面，當乙醇體積分數(shù)過低時，因解吸溶劑極性過大而不利于多酚物質(zhì)的洗脫。

3.3 大孔樹脂吸附對米糠酚類物質(zhì)的組成及抗氧化活性的影響

米糠中含有的酚類物質(zhì)組成較為復雜，本研究從大孔樹脂純化前的米糠酚類提取物中檢測到?jīng)]食子酸、阿魏酸、兒茶素、表兒茶素、綠原酸等10種單體酚類成分。為探明經(jīng)大孔樹脂純化后上述不同種類的酚類物質(zhì)含量變化，對純化后的酚類提取物進行HPLC分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過大孔樹脂吸附后脫脂米糠多酚不會造成峰丟失，即單體酚組成未發(fā)生改變，各單體酚含量均有明顯增加。因此，HPD-300型大孔樹脂適于分離純化脫脂米糠多酚。純化后的米糠酚類提取物總酚和總黃酮含量明顯提高，因此其抗氧化活性也較純化前明顯增強。通過ORAC方法和更接近生理環(huán)境的細胞抗氧化分析方法進行測定，發(fā)現(xiàn)純化后的米糠酚類提取物細胞抗氧化活性較純化前提高了3.2倍，ORAC抗氧化活性提高了2.4倍，表明經(jīng)大孔樹脂純化也明顯提高了米糠酚類提取物的生物活性。

4 結(jié)論

通過靜態(tài)吸附和解吸試驗篩選出適用于脫脂米糠多酚分離純化的大孔吸附樹脂為HPD-300，其分離純化米糠酚類提取物的最佳工藝條件為：米糠酚類提取物上樣濃度為1.0 mg GAE·mL-1，上樣流速為3.0 BV·h-1，上樣體積為3.5 BV，70%乙醇溶液作為洗脫劑，洗脫流速為3.0 BV·h-1。純化后的脫脂米糠多酚提取物總酚和總黃酮含量較純化前分別提高了2.6和3.4倍，氧自由基吸收能力和細胞抗氧化活性分別提高了1.4和2.2倍，且不會造成其10種主要單體酚組成變化，其含量較純化前提高0.4—2.4倍。

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（責任編輯 趙伶俐）

Separation and Purification of Polyphenols in Rice Bran by Macroporous Resins

TONG Xin1,2, ZHANG Rui-fen1, DENG Yuan-yuan1, XIAO Juan1, LIU Lei1, ZHANG Yan1, WEI Zhen-cheng1, ZHANG Ming-wei1

(1Sericultural & Agri-food Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Functional Foods, Ministry of Agriculture/Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing, Guangzhou 510610;2College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642)

【Objective】The objective of this study is to screen a resin with a good adsorption and desorption performance to rice bran polyphenols (RBP) and optimize the purification technique, to compare the total phenols, total flavonoids content and antioxidant activity before and after purification, thus providing a theoretical basis for the deep processing and utilization of rice bran.【Method】The behavior of static adsorption and desorption, dynamic adsorption and desorption of 9 macroporous resins (HPD-100, HPD-200A, HPD-300, HPD-700, D101, HPD-722, AB-8, ADS17, and HPD-826) with different polarities to RBP was determined. Kinetic characteristics of static adsorption of the preferred resin were analyzed. The purification technique of macroporous resin to RBP was developed through the dynamic adsorption and desorption curves under different loading and elution conditions, including phenolic concentrations in loading samples, sampling rates, sampling volumes and ethanol concentrations in eluent. The phenolic profiles in RBP before and after resin purification were analyzed by HPLC analysis. Their total phenolic and flavonoid contents, oxygen radical absorption capacity (ORAC) and cellular antioxidant activity (CAA) were also estimated. 【Result】HPD-300 exhibited the best capability of adsorption and desorption to RBP among the 9 selected macroporous resins. The saturated absorption quantity of HPD-300 resin to RBP was 9.04 mg GAE·g-1, and the desorption rate was 82.62%. It took 6 h for HPD-300 resin to reach absorption equilibrium. The optimized purification parameters were as follows: the phenolic concentration of loading sample is 1 mg GAE·mL-1, sampling rate is 3.0 BV·h-1, sampling volume is 3.5 BV, eluent is 70% ethanol, flow velocity is 3.0 B V·h-1. After HPD-300 resin purification, the total phenolic content increased by 2.6 times from 88.07 μg GAE·mg-1to 320.72 μg GAE·mg-1, and the total flavonoids content increased by 3.4 times from 30.04 μg CE·mg-1to 133.67 μg CE·mg-1. Ten phenolic compounds were identified from rice bran phenolic extract, which were gallic acid, protocatechuic acid, vanillic acid,-hydroxy benzoic acid, caffeic acid, clove acid, epicatechin, catechins, vanillic aldehyde,-coumaric acid and ferulic acid by HPLC analysis. The phenolic profiles of the extract were not changed after HPD-300 resin purification, but the concentrations of 10 phenolic compounds increased by 0.4-2.4 times. The ORAC and CAA antioxidant activity of the extract changed from 1 327.51 μmol TE·g-1and 29.19 μmol QE·g-1before purification to 3 248.21 μmol TE·g-1and 95.24 μmol QE·g-1after purification, and increased by 1.4 and 2.2 times, respectively.【Conclusion】The total phenolic and flavonoid contents and antioxidant activity increased by 1-3 times after HPD-300 resin purification. The individual phenolic compounds in the extract were not lost significantly during purification. Therefore, HPD-300 macroporous resin was suitable to purify rice bran phenolic extract.

rice bran; phenolics; macroporous resin; purification; CAA; ORAC

2016-03-09；接受日期：2016-07-12

國家自然科學基金（31501478）、廣東省自然科學基金團隊項目（2016A030312001）、廣東省科技計劃項目（2015A020209072，2016B070701012）

童鑫，E-mail：tongxin322@126.com。通信作者張名位，E-mail：mwzhh@vip.tom.com