韓 穎，石彥忠，孟憲梅，張 亮，姜加良

（1.吉林工商學院生物工程學院，吉林長春130507； 2.糧油食品深加工吉林省高校重點實驗室，吉林長春130507）

改善玉米酒精濃醪發(fā)酵工藝條件的研究

韓 穎1，2，石彥忠1，孟憲梅1，2，張 亮1，姜加良1

（1.吉林工商學院生物工程學院，吉林長春130507； 2.糧油食品深加工吉林省高校重點實驗室，吉林長春130507）

利用脫胚玉米米查為原料，摸索采用濕法加酶磨漿、多酶協(xié)同糖化發(fā)酵等技術手段，優(yōu)化玉米濃醪發(fā)酵工藝。實驗結果表明，采用濕法加酶粉碎液化與干法粉碎加酶液化相比，醪液黏度降低了12.6%，液化時間明顯縮短。在單因素實驗的基礎上，對多酶協(xié)同糖化過程中添加的酸性蛋白酶、木聚糖酶添加量和酵母接種量利用正交實驗方法進行優(yōu)化，濃醪發(fā)酵酒精濃度達到14.2%vol。本研究為后續(xù)發(fā)酵條件的繼續(xù)優(yōu)化及中試放大實驗打下了基礎。

濃醪發(fā)酵； 濕法加酶粉碎； 多酶協(xié)同糖化

近年來，酒精發(fā)酵工業(yè)更多將焦點放在如何提高生產效益，降低生產成本[1-3]。酒精濃醪發(fā)酵一般是指酒精濃度大于12%vol的發(fā)酵生產。相比常規(guī)酒精發(fā)酵技術，生產過程中加水量少，因此對于下游生產能源節(jié)約的作用是顯而易見的。通過高濃度醪液的制備，水的消耗大約可以減少40%，水的用量從13.3 t（常規(guī)發(fā)酵料水比1∶3）減少到5.5 t（濃醪發(fā)酵條件下）。在能源利用上80%的能源消耗于下游生產過程，蒸餾工段中消耗的熱能占總操作成本的30%。濃醪發(fā)酵工藝因其水用量低蒸餾和醪液蒸發(fā)成本明顯降低。據報道，濃醪發(fā)酵條件下，當最終的酒精濃度從12%vol上升至18%vol時，能源可節(jié)約大概4%。此外，耐酸性細菌不能生存在增加的滲透壓條件下，雜菌污染的風險也能降至最低，因此也節(jié)約了抗生素成本。由此酒精濃醪發(fā)酵工藝的優(yōu)勢是顯而易見的[4-5]。

然而，酒精濃醪發(fā)酵時，高底物濃度和高酒精含量會限制酵母菌的生長繁殖，對酒精發(fā)酵產生強烈的抑制作用，另外濃醪酒精發(fā)酵需要處理300 g/L以上的原料，隨著料水比的降低，醪液的黏度迅速增高，使醪液在攪拌、輸送和加熱冷卻工序的運行都變得十分困難。酒精生產中要求醪液均勻，在原料分子周圍有足夠的水參與反應，醪液黏度增高會使得液化和糊化反應不徹底和不均勻，這也是大多數(shù)工廠放棄濃醪發(fā)酵這一技術革新的原因之一[6-8]。

本研究擬利用濕法加酶粉碎、多酶協(xié)同糖化等方法，消除或降低影響玉米酒精濃醪發(fā)酵的負面影響因素，提高酒精度。實驗的研究為玉米原料濃醪發(fā)酵酒精提供科學依據[9-13]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：脫胚玉米米查，實驗室自制。

實驗材料：耐高溫α-淀粉酶(酶活力2×104U/m L)，諾維信中國生物技術有限公司；糖化酶(酶活力1×105U/m L)，諾維信中國生物技術有限公司；酸性木聚糖酶（酶活力50000U/g），蘇柯漢生物工程有限公司；酒用酸性蛋白酶GC106(酶活力1000 SAP/g)，杰能科（中國）生物工程有限公司；耐高溫活性干酵母，安琪酵母股份有限公司。

儀器設備：NDJ-9S數(shù)顯黏度計，上海精密科學儀器有限公司；電子天平（ALC-2100.2型），北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；pH計（PHS-3C型），上海雷磁儀器廠；數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋，上海躍進醫(yī)療器械總廠；標準篩，杭州三思儀器有限公司；顯微鏡，OLYMPUSCX40。

1.2 工藝流程

本研究采用工藝如下：

1.2.1 脫胚玉米浸泡預處理

玉米米查按照一定比例加入水溶液，配制成絕對干物濃度為32%的玉米醪液（料水比為1∶2.1），加入NaCO3調節(jié)pH值至6.0～6.5，在60℃條件下浸泡。

1.2.2 玉米濕法加酶粉碎液化糖化

將浸泡后的玉米米查醪液，加入耐高溫α-淀粉酶（20U/g原料），送入粉碎機濕法粉碎。粉碎后的漿料屬于粗粉碎，尚含有小顆粒（直徑為2～3mm）。之后進行二次粉碎磨細重復處理。之后將所得漿料置于恒溫水浴中90℃液化至終點。液化終點用碘液顯色呈棕黃色確定。所得液體用100目尼龍濾布過濾2次，所得濾液即為液化液。同時干法粉碎玉米米查至40目，加酶液化做對照實驗。然后測定升溫至90℃后的液化時間、液化液得率、黏度及顆粒分布指標。每個處理重復3次。

液化液降溫至60℃，加入糖化酶、酸性蛋白酶、木聚糖酶，再經均質化（邊均質邊糖化）處理1次，60℃條件下處理60m in，糖化然后冷卻到35℃，準備發(fā)酵。

1.2.3 酒精發(fā)酵

將糖化液按照一定比例添加其他營養(yǎng)添加劑送入發(fā)酵罐中。接入活化后酵母進行酒精發(fā)酵。本研究設計在發(fā)酵過程中采用4種控制方法在恒溫水浴鍋中進行溫度梯度控制(控制方法見表1)發(fā)酵結束采樣測定醪液在標準條件下的酒精含量及酵母細胞數(shù)。

表1 酒精濃醪發(fā)酵溫度控制方法

1.3 測試方法

1.3.1 玉米米查吸水率測定

將浸泡后玉米米查倒在濾紙上輕輕擦拭。等玉米粒表面水分完全吸干后稱重，計算其吸水率。

式中，B為吸水后玉米粒重，g；A為吸水前玉米粒干重，g。

1.3.2 黏度測定

用NDJ-9S數(shù)顯式黏度計的二號轉子，用60 r/min的轉速測定。

1.3.3 液化液得率測定[13]

1.3.4 酒精度測定[3]

采用酒精計法測定蒸餾液中酒精度。

1.3.5 酵母細胞數(shù)測定

OLYMPUSCX40顯微鏡下觀察，血球計數(shù)板計數(shù)[3]。

2 結果與討論

2.1 濕法加酶粉碎液化

2.1.1 玉米米查浸泡吸水率對液化醪液黏度的影響

玉米淀粉的糊化溫度在70～80℃，此時醪液的黏度值最高。本實驗將不同吸水率的玉米米查通過濕法加酶粉碎液化，檢測了溫度升到70～80℃間醪液的黏度值，以及粉碎后漿料顆粒直徑的分布，實驗結果見圖1和表2。

圖1 玉米米查吸水率對液化醪液黏度的影響

由圖1和表2可知，隨著玉米米查吸水率的提高，濕法加酶粉碎后的醪液黏度呈現(xiàn)下降趨勢。玉米米查吸水后細胞充分膨脹，有利于加強濕法粉碎的效果，增加了醪液中小顆粒的比例，也加速了α-淀粉酶對淀粉的水解，使醪液的黏度下降。當玉米米查吸水率達到45%以上時，醪液升溫后的黏度最低，此時粉碎后的醪液中顆粒直徑分布合理，濃度適宜，通過α-淀粉酶的水解有效抑制了醪液黏度的上升。當吸水率繼續(xù)增加時，醪液的黏度卻隨之上升，根據此時顆粒直徑大小的分布分析，可能是料液中小顆粒直徑分布過多，使得黏度上升過快。根據實驗結果，后續(xù)實驗均采用吸水率在45%的玉米米查進行濕法加酶粉碎。

表2 粉碎漿料中顆粒直徑分布

2.1.2 濕法加酶液化與干法粉碎液化效果比較（表3）

表3 液化結果比較

由表3可知，濕法加酶粉碎液化的液化時間同干法粉碎加酶液化相比，縮短了20%；液化液得率增加了12%；液化液黏度下降了12.6%。說明濕法加酶粉碎液化工藝能顯著改善玉米淀粉的液化效果，并縮短了液化時間。

2.2 多酶協(xié)同糖化發(fā)酵對酒精發(fā)酵的影響

2.2.1 酸性蛋白酶的添加對酒精發(fā)酵的影響（圖2）

圖2 酸性蛋白酶對酒精發(fā)酵的影響

常規(guī)濃度酒精發(fā)酵酸性蛋白酶添加量通常在10～16U/g，而根據文獻資料，發(fā)酵醪液中可同化氮源的添加有助于增加酵母的酒精耐受力和酒精生產能力，因此本實驗糖化醪中酸性蛋白酶的添加量設計高于常規(guī)量，采用30℃恒溫酒精發(fā)酵。由圖2可知，與空白對照組比較，酸性蛋白酶的添加使得醪液發(fā)酵終點的酒精含量明顯提高。添加量在40U/g時，發(fā)酵醪中酒精含量趨于平緩，達到12.0%vol。實驗結果說明，添加適量的酸性蛋白酶會對原料中所含的蛋白質起到水解作用,破壞玉米顆粒間質細胞壁的結構,使得原來緊密包裹的蛋白質和淀粉分開，有利于不溶性淀粉顆粒的釋放，幫助糖化酶對淀粉的水解，從而提高原料的出酒率；另一方面,在蛋白酶的水解作用下增加了醪液中氨氮含量，可同化氮源對于酵母生長和繁殖具有重要作用，它影響了酵母的酒精耐受力和酒精生產能力，促進酵母菌的生長繁殖與酒精代謝。

2.2.2 木聚糖酶對酒精發(fā)酵的影響（圖3）

圖3 木聚糖酶對酒精發(fā)酵的影響

木聚糖酶可以分解原料細胞壁以及β-葡聚糖，降低釀造中物料的黏度，促進有效物質的釋放，以及降低原料的非淀粉多糖，促進營養(yǎng)物質的吸收利用。在實驗2.2.1的基礎上（酸性蛋白酶添加量40U/g），在糖化醪液中添加木聚糖酶30℃恒溫發(fā)酵。由圖3可見，與對照組比較，木聚糖酶的添加使得醪液發(fā)酵終點的酒精含量明顯提高。添加量在200U/g時，發(fā)酵醪中酒精含量變化不再明顯趨于平緩，此時的酒精含量達到13.6%vol。實驗結果表明，將木聚糖酶作用于淀粉質原料，可以破壞原料細胞結構，促進淀粉、蛋白質等有效成分的溶出，加速其他酶（主要是糖化酶）的作用，從而提高原料出酒率。

2.3 溫度控制對酒精發(fā)酵的影響（圖4）

圖4 不同溫度控制對酒精度的影響

由圖4可知，低溫發(fā)酵25℃雖然有利于發(fā)酵后期酒精的生產，但前期產酒較慢，發(fā)酵周期偏長。濃醪發(fā)酵溫度32℃時，前期酒精的生產速率較高，但酵母代謝過于活躍、衰老早，酒精的產物抑制也較嚴重。恒溫30℃條件下發(fā)酵終點的酒精濃度為13.2%vol，高于25℃和32℃。溫度梯度控制條件下，發(fā)酵終點時酒精濃度達到13.5%vol，超過恒溫30℃條件下的酒精濃度，此時酵母細胞數(shù)達到1.8×108個/m L。因此溫度梯度控制是實現(xiàn)高強度超高酒精發(fā)酵的重要途徑。

2.4 正交實驗優(yōu)化發(fā)酵工藝條件

在單因素實驗的基礎上，以酸性蛋白酶添加量和木聚糖酶添加量、接種量為因素，設計3因素3水平正交實驗，研究多酶協(xié)同糖化發(fā)酵對酒精度的影響，設計正交實驗見表4。

表4 L9(33)多酶同步糖化發(fā)酵正交實驗表

表5 多酶同步糖化發(fā)酵正交實驗結果

對表5的正交實驗結果進行極差分析可以看出：3個因素影響順序為酸性蛋白酶＞木聚糖酶＞接種量。糖化發(fā)酵最優(yōu)條件為A2B3C3。即酸性蛋白酶添加量45 U/g，木聚糖酶添加量220 U/g，接種量15%。正交實驗中不含A2B3C3的實驗，驗證實驗表明酒精度達到14.2%vol，與理論相符。

3 結論

濃醪發(fā)酵帶來高濃度醪液的黏度問題已經成為困擾酒精企業(yè)的難題。高黏度導致生產過程中物料處理困難，阻礙固液分離，使得淀粉不能完全水解成可發(fā)酵糖，從而導致發(fā)酵效率低下。本實驗通過糖化前加入酶制劑磨漿預處理，結果表明，液化得率明顯增高，能夠取得可以接受的黏度，有效地避免了高黏度累積現(xiàn)象。

采用多酶協(xié)同糖化發(fā)酵促進酵母發(fā)酵，降低了高濃度底物對酵母發(fā)酵的抑制作用，取得了比較滿意的成果。

實驗結果表明，通過以上工藝的改進，在絕對干物濃度為32%的玉米醪液（料水比為1∶2.1）中，濃醪發(fā)酵酒精濃度達到14.2%vol。

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Im proving the Processof High-Gravity Fermentation of Corn Ethanol

HAN Ying1,2,SHIYanzhong1,MENG Xianmei1,2，ZHANG Liang1and JIANG Jialiang1
(1.Schoolof Biological Engineering,Jilin Businessand Technology College,Changchun,Jilin 130507; 2.Jilin Key Laboratory of Grain and Oil Processing,Changchun,Jilin 130507,China)

Usingmaize w ithout germ as raw material,we explored the optim ization of high-gravity fermentation of corn ethanol by grinding wetmashw ith enzyme and usingmulti-enzyme collaborative saccharification/fermentation.The results showed that,compared w ith liquefying and grinding drymash w ith enzyme,themethod of liquefying and grinding wetmash w ith enzyme could reduce the viscosity of themash by 12.6%,and significantly shorten the liquefaction time.On the basis of single factor experiments,we optim ized the adding level of acid protease,xylanase and yeast through orthogonal experiments.The optimizedmethod could produce alcoholw ith concentration of 14.2%vol.This study has laid foundation for subsequentoptimization of fermentation conditionsand pilotscale tests.(Trans.by HUANG Xiaoli)

high-gravity fermentation;grinding wetmashw ith enzyme;multi-enzyme collaborative saccharification

TS262.3；TS261.4

A

1001-9286（2016）12-0065-04

10.13746/j.njkj.2016344

吉林省教育廳科研資助項目（吉教科合字[2013]第501號）；糧油食品深加工吉林省高校重點實驗室開放資金項目，編號：[2012011]；吉林省酒精集團橫向課題：酒精生產中雜醇油提取與分離純化研究2012。

2016-11-21

韓穎(1971-)，女，吉林省長春市人，副教授，博士研究生，研究方向：玉米發(fā)酵工程。

孟憲梅，E-mail：mengxianmei@jlbtc.edu.cn。