吳建峰，孫 瑩，季 方，唐群勇，許桂林

（江蘇今世緣酒業(yè)股份有限公司，江蘇漣水223411）

濃香型721型曲培養(yǎng)周期內(nèi)風味成分變化的分析研究

吳建峰，孫 瑩，季 方，唐群勇，許桂林

（江蘇今世緣酒業(yè)股份有限公司，江蘇漣水223411）

大曲是白酒釀造的糖化發(fā)酵劑，更是香味物質(zhì)的前驅(qū)體，與原酒的質(zhì)量和產(chǎn)量密切相關(guān)。以頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法跟蹤分析濃香型721曲（曲皮和曲心）在培養(yǎng)階段的風味物質(zhì)成分的動態(tài)變化，包括醇類、酸類、酯類、含氮類、醛酮類、含硫類、呋喃類。樣品分析結(jié)果表明，多數(shù)揮發(fā)性風味成分在發(fā)酵第1天就會迅速增長，后期經(jīng)過轉(zhuǎn)化或分解，含量有所下降，20 d后趨于穩(wěn)定；含氮化合物前期主要是各種氨基酸，2～3 d后吡嗪、吡啶類開始迅速增長，20 d后趨于穩(wěn)定；種類和含量最高的是酯類化合物，最少的是含硫化合物；大曲發(fā)酵前中期可檢測風味化合物豐富，曲皮的風味成分種類高于曲心，曲心的風味物質(zhì)含量總體高于曲皮。

頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法； 721型曲； 培養(yǎng)階段； 風味成分

中國白酒發(fā)酵屬于典型的自然發(fā)酵過程,其特點是在開放的生產(chǎn)環(huán)境中,眾多不同微生物共同參與發(fā)酵，相互作用，最終形成了具有獨特風格的產(chǎn)物白酒?！扒司浦恰?，大曲既是釀酒原料，又是白酒釀造過程中生物催化劑和微生物的來源之一，對白酒的風格和品質(zhì)起著至關(guān)重要的作用[1-3]。721型大曲是用小麥佐以大麥、豌豆經(jīng)粉碎，潤水后，壓制成曲坯，置于曲房中，通過環(huán)境自然接種，依據(jù)不同的生長狀態(tài)調(diào)節(jié)曲房的濕度和溫度，微生物菌群經(jīng)過30 d左右的繁衍交替生長成新曲，隨后適當存放則轉(zhuǎn)換為成品曲[4-5]。近年來，多數(shù)學(xué)者開始關(guān)注大曲的風味成分。2007年，范文來等[6]應(yīng)用GC-MS分析醬香型大曲的風味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)醬香型大曲中含有較多的芳香族化合物和吡嗪類化合物。2011年，張春林課題組采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法分析瀘州老窖中高溫大曲的揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)曲中含量較高的是醇類、酯類和酮類化合物，另外還含有吡嗪類化合物[7]。2015年，明紅梅團隊對大曲中揮發(fā)性香味物質(zhì)進行定性和半定量測定，并結(jié)合主成分分析法對檢測信息進行處理和分析，為進一步量化評價大曲香氣及完善大曲質(zhì)量評價體系提供了參考[8]。

目前已有多篇關(guān)于成品曲風味物質(zhì)成分及其含量的報道，為大曲的合理分級及配備使用提供依據(jù)。而關(guān)于大曲培養(yǎng)過程的研究較少，本課題組欲采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)跟蹤分析721型大曲培養(yǎng)全過程的風味物質(zhì)成分及其含量變化，結(jié)合大曲發(fā)酵過程中的微生物群落演替規(guī)律和理化指標變化規(guī)律初步闡述大曲風味物質(zhì)產(chǎn)生及影響機制。

1 材料與方法

1.1 材料

大曲取樣：從曲房不同方位分別取數(shù)塊曲，取其皮（曲塊表面0～2 cm）和心（5～10 cm)分別進行粉碎，混合均勻，堆成圓錐形，分成4等分，留1份作為待測樣[9]。取樣時間為1 d、3 d、6 d、9 d、13 d、16 d、20 d、25 d和29 d。

耗材及試劑：2-辛醇購自中國物質(zhì)標準網(wǎng)，正戊烷購自Sigma公司，氯化鈉（AR級）購自國藥公司。

儀器：美國LECO公司的全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC×GC-TOFMS）；數(shù)顯恒溫磁力加熱攪拌器購自匡貝實業(yè)上海有限公司；超聲波清洗器購于上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大曲樣品前處理方法

稱取5 g絕干曲用50m L水溶解，攪拌10m in，超聲波30min（功率70W），然后在-4℃下以4500 r/m in離心10min，得到上層清液，備用。

1.2.2 頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法

在15m L頂空瓶中加入5 m L 0.10 g/m L大曲浸提液、2 g NaCl、0.020m L1mg/L 2-辛醇內(nèi)標溶液，插入50/ 30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，50℃預(yù)熱平衡7m in，萃取吸附45min，GC解吸5m in(250℃)，用于GC-MS分析。樣品通過DB-Wax毛細管柱(30m×0.25mm)進行分離。進樣口溫度250℃，載氣He，流速1.5m L/m in。不分流進樣。升溫程序：50℃(保持2min)；以6℃/m in升溫至240℃(保持10m in)。MS條件：電子電離，采集電壓：1500 V，電子能量：70 eV，離子源溫度：200℃，質(zhì)量范圍：30～500 u。未知化合物的質(zhì)譜通過與NIST譜庫進行比對，只有當正反匹配對達到800才予以確認。

2 結(jié)果與討論

2.1 大曲風味成分提取與檢測方法的選取

經(jīng)查閱文獻，常見的風味成分檢測分析的前處理方法主要采取有機溶劑萃取法[10]、液液萃取法[11]、頂空固相微萃取法等[12-14]。有機溶劑萃取法：稱取5 g絕干曲用50m L水溶解，攪拌30m in，取上層清液20m L，與20m L乙醚混勻，靜置2 h，用吸管吸取5m L上層溶液置于-4℃冰箱里冷凍，待分析。液液萃取法：稱取5 g絕干曲用50m L水或12%乙醇水溶液溶解，攪拌30m in，離心，取上層清液置于-4℃冰箱里冷凍，待分析。頂空固相微萃取法：取1 g絕干曲、5m L 0.5 g絕干曲水溶液或5m L 0.1 g/m L曲的浸提液置于頂空玻璃瓶中，于50℃水浴鍋中，用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭萃取45m in，隨后采用氣相色譜-質(zhì)譜儀分析。實驗結(jié)果表明：有機溶劑萃取法取得的待分析物質(zhì)成分單一，峰少，且其峰面積和只有371288，遠遠不能夠說明大曲的風味物質(zhì)成分；12%乙醇水溶液萃取效果不完全，經(jīng)過NIST譜庫匹對和分析，僅有40種物質(zhì)；而絕干曲、絕干曲水溶液或絕干曲浸提液的固相微萃取法可以取得200余種分析物，經(jīng)過NIST譜庫匹對，有150余種可知風味物質(zhì)成分。且絕干曲浸提液的固相微萃取法地相對標準偏差為3.03%，多次能夠再現(xiàn)，相對較全面地分析了大曲風味物質(zhì)成分，故后期本課題組采用絕干曲浸提液的固相微萃取法。

2.2 大曲培養(yǎng)周期內(nèi)風味成分及其含量的分析研究

大曲從0 d開始入房發(fā)酵，第3天倒?jié){，第5天1層平翻，第8天1層高加2層高，第11天小并房（4層高），第14天翻大火，第19天4層高加5層，第22天5層高加6層高，其得到的成品曲共檢測到揮發(fā)性風味成分有158種，其中包括醇類19種、酯類15種、醛酮26種、酸類14種、含氮類化合物29種、呋喃類5種，含硫化合物3種及其他40多種，發(fā)酵過程的揮發(fā)性風味物質(zhì)含量變化情況分別見圖1—圖7。

圖1 發(fā)酵周期內(nèi)醇類化合物的含量變化

大曲培養(yǎng)周期中生成主要的醇類物質(zhì)有乙醇、苯甲醇、苯乙醇、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、己醇、1-辛烯-3-醇等，一般從發(fā)酵的第1天開始增加，到發(fā)酵的第9天達到最大值，隨后含量下降明顯，15 d后又再次上升后趨于穩(wěn)定，尤其是苯乙醇。且醇類物質(zhì)種類在發(fā)酵前中期比較豐富，被微生物利用代謝，后期多數(shù)不能夠檢測。這些物質(zhì)一般呈現(xiàn)為水果和花香類氣味，可能是大曲香味的重要呈香物質(zhì)。初期入房大曲的溫度適宜，微生物尤其是酵母和霉菌開始大量生長繁殖，進行糖代謝、氨基酸代謝，活動豐富，產(chǎn)生大量醇類物質(zhì)，隨后隨著曲房溫度升高，多數(shù)不耐熱微生物死亡，且醇類和酸類形成酯，醇類含量大量下降；發(fā)酵后期細菌代謝旺盛，代謝產(chǎn)生苯乙醇、苯甲醇等揮發(fā)性物質(zhì)。

圖2 發(fā)酵周期內(nèi)酸類化合物的含量變化

大曲發(fā)酵培養(yǎng)期中檢測到的主要酸類物質(zhì)有乙酸、2-甲基丙酸、3-甲基丙酸、己酸等，曲皮的酸種類多于曲心，但曲心的酸含量高于曲皮。酸是白酒中的協(xié)調(diào)成分，具有多種功能，可以使酒體陳釀老熟，增長酒的味感在口腔中持久的程度。酸類物質(zhì)從發(fā)酵的第1天開始增加，到發(fā)酵的第5天達到最大值，隨后其含量下降明顯，15 d后又再次上升后，趨于穩(wěn)定。培養(yǎng)初始時，微生物代謝產(chǎn)生的醇類被氧化產(chǎn)生酸，且產(chǎn)酸菌代謝活動活躍，乙酸、己酸大量生長，能夠明顯聞到發(fā)酵曲的酸味，尤其是曲心。溫度升高，多數(shù)產(chǎn)酸菌不耐高溫而死亡，且酸和醇形成酯導(dǎo)致酸含量下降。

圖3 發(fā)酵周期內(nèi)酯類化合物的含量變化

大曲中檢測到的酯類物質(zhì)主要有乙酯類和己酯類，如乙酸乙酯、丙酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯等。酯類化合物呈現(xiàn)出花香和水果似香味，能通過醇類和脂肪酸的酯化反應(yīng)生成，也可以由微生物發(fā)酵過程中的乙酰輔酶A途徑生成。一般來說大曲中的酯類合成前期可能與乙酰輔酶A途徑有關(guān)，而后期與酯化反應(yīng)有關(guān)[15]。培養(yǎng)前期，微生物如假絲酵母活動產(chǎn)生酯化酶，促使酸和醇合成酯；培養(yǎng)中期，隨著溫度的升高，酵母、霉菌死亡，酶活力減弱，酯合成減少；后期溫度下降酵母復(fù)蘇，醇類和酸類化合物增加，合成的酯類化合物增加。

圖4 發(fā)酵周期內(nèi)醛酮類化合物的含量變化

醛酮類化合物主要有乙醛、苯乙醛、己醛、苯丙酮、丙酮、2,3-丁二酮等。醛酮類能使酒的香氣飄逸，在發(fā)酵過程中，原料中的蛋白質(zhì)和多糖類物質(zhì)被分解成氨基酸和小分子的還原糖，微生物利用糖和氨基酸代謝產(chǎn)生醛酮等中間體，且氨基酸和還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)生醛酮類化合物中間體成分[16]，在發(fā)酵的第20天就達到最大值，隨后趨于穩(wěn)定。

圖5 發(fā)酵周期內(nèi)含硫化合物的含量變化

含硫化合物有甲硫醇、3-甲硫基丙醇、三甲基二硫醚、甲硫基乙酸乙酯、2-氯乙基硫化苯等，具有強烈的放香作用，甲硫醇整個培養(yǎng)周期內(nèi)都有，其可由細菌或酵母代謝原料中的蛋白質(zhì)蛋氨酸產(chǎn)生，在第15天左右達到最大，隨后趨于穩(wěn)定，在整個發(fā)酵周期內(nèi)含量相對較低。

圖6 發(fā)酵周期內(nèi)含氮化合物的含量變化

含氮化合物前期主要是氨基酸，后期主要是吡嗪類、吡啶類、吡唑類化合物。培養(yǎng)初期，微生物將原料中的蛋白質(zhì)代謝成各種小分子氨基酸，在細菌的作用下迅速生成吡嗪、吡啶、吡唑等化合物，且培養(yǎng)中微生物如芽孢桿菌代謝一些酶，促進醛酮類和氨基酸物質(zhì)的美拉德反應(yīng)，第15天含量達到最大值，隨后開始下降，20 d接近一個穩(wěn)定的水平。

圖7 發(fā)酵周期內(nèi)呋喃類化合物的含量變化

呋喃類化合物主要是糠醛、糠醇、糠酮等，多數(shù)原料自身就有。培養(yǎng)前期糠醛含量增加，在第15天之后迅速減少。整個培養(yǎng)過程中，呋喃類化合物在第9天和第16天左右有增長點，隨后趨于穩(wěn)定。在發(fā)酵過程中有微生物代謝產(chǎn)生糠醛、糠酮，高溫進行分解，含量減少。且糠醛可以被微生物利用生成糠醇[17]。

3 結(jié)論

應(yīng)用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜儀跟蹤分析了春季721型大曲培養(yǎng)周期內(nèi)的風味成分的動態(tài)變化，包括醇類、酸類、醛酮類、酯類、含氮類、含硫類、呋喃類化合物，其在大曲生成過程中經(jīng)歷了一個先升高后降低的過程。醇類、酸類、醛酮類、酯類從發(fā)酵的第1天開始快速生長，20 d后趨于穩(wěn)定。培養(yǎng)初期生成各種氨基酸，導(dǎo)致含氮類化合物快速增長，隨后與還原糖作用生成吡嗪類、吡啶類等物質(zhì)，豐富了大曲的香味成分。種類和含量最多的是酯類，最少的是含硫類化合物。后期將結(jié)合本課題結(jié)果與以原料培養(yǎng)的主要微生物的代謝風味成分進行比較，研究大曲中揮發(fā)性風味物質(zhì)變化的內(nèi)在本質(zhì)和大曲香味類型的聯(lián)系。

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Changeof Flavoring Com ponentsof Nongxiang 721Daqu in the Culture Stage

WU Jianfeng,SUN Ying,JIFang,TANG Qunyong and XU Guilin
(Jinshiyuan Distillery Co.Ltd.,Lianshui,Jiangsu 223411,China)

Daqu is the saccharifying&fermenting agent in Baijiu production,and the precursor of flavoring components.It is closely related to the quality and the yield of base liquor.The dynam ic changes in flavoring components of Nongxiang 721 Daqu including alcohols,acids,esters,nitrogen-containing compounds,aldehydesand ketones,sulfur-containing compoundsand furans in the culture stagewere tracked and analyzed by headspace solid-phasem icroextraction-gas chromatography-mass spectrometry.The results showed that,most volatile flavoring compounds increased rapidly in the 1st day of the fermentation,then decreased through transformation or decomposition and became stable after 20 d of the fermentation.Themajority of nitrogen-containing compoundswere all kindsof amino acids atearlier stage.2～3 d later,pyrazines and pyridines began to increase and keptstable after 20 d.Esterswere prom inent in variety and contentand sulfur-containing compoundswere the least compounds.Rich flavoring components could be detected in former fermenting stage,w ith the varieties of flavoring components in the skin of Duqu higher than that in the core of Duqu,and the contentof flavoring components in the core of Duqu higher than that in the skin of Duqu.

headspace solid-phasem icroextraction-gas chromatography-mass spectrometry;721Daqu;culture stage;flavoring components

TS262.3；TS261.1；TS261.7

A

1001-9286（2016）12-0043-04

10.13746/j.njkj.2016068

2016-03-02

吳建峰（1966-），男，江蘇南通人，江蘇今世緣酒業(yè)股份有限公司副總經(jīng)理，研究員級高級工程師，國家白酒評酒專家，全國五一勞動獎?wù)芦@得者，發(fā)表論文數(shù)篇。

許桂林（1988-），女，安徽合肥人，碩士，發(fā)表SCI論文數(shù)篇，E-mail：youniguilin@sina.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-11-21；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161121.1648.008.htm l。