楊 瀟，李 娜，鄭伶俐，饒日川，薛 燕

(合肥師范學(xué)院 化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院,安徽 合肥 230061)

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鈍擬蟹守螺外殼可溶性有機(jī)基質(zhì)的分離與表征

楊 瀟，李 娜，鄭伶俐，饒日川，薛 燕

(合肥師范學(xué)院 化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院,安徽 合肥 230061)

鈍擬蟹守螺的外殼為文石型碳酸鈣和有機(jī)基質(zhì)組成的硬組織。有機(jī)基質(zhì)在外殼的形成中有著重要的地位。在本研究中，我們從鈍擬蟹守螺外殼中分離、純化、并部分表征了可溶性有機(jī)基質(zhì)蛋白質(zhì)(SOM)。SOM主要由蛋白質(zhì)和多糖組成。凝膠電泳研究發(fā)現(xiàn)有四條主要條帶分子量大于30kDa。研究發(fā)現(xiàn)SOM確實(shí)影響了碳酸鈣的生物體外結(jié)晶。

生物礦化；晶體生長(zhǎng)；晶型；有機(jī)基質(zhì)

1 引言

生物礦物質(zhì)是由無(wú)機(jī)化合物和生物大分子如蛋白質(zhì)成分組成的硬組織。在許多有機(jī)組織中都存在生物礦物質(zhì)，它的功能包括機(jī)體結(jié)構(gòu)的支撐，保護(hù)機(jī)體不受外敵的入侵，感知磁力和重力，以及礦物質(zhì)的儲(chǔ)存[1]。此外，生物礦物質(zhì)形成于受控的條件下，常常有著與其無(wú)機(jī)條件下形成的同類型礦物質(zhì)極為不同的性質(zhì)，如形狀、大小、結(jié)晶度、同位素和微量元素組成等[2]。在已知的生物礦物質(zhì)中，含鈣礦物占了50%，它們以含鈣的碳酸鹽、磷酸鹽、草酸鹽、硫酸鹽、和其它礦物質(zhì)形式存在[3]。因?yàn)榈V物相的形成需要在由蛋白質(zhì)和其它大分子組成的復(fù)合混合物的存在下才能進(jìn)行，人們已經(jīng)進(jìn)行了一些嘗試來(lái)純化和表征活性蛋白質(zhì)以期了解生物礦化的機(jī)理。常見(jiàn)的生物礦物，如牙齒[4]、骨骼[5]和外殼[6-38]，都是化學(xué)家和材料科學(xué)家非常感興趣的研究對(duì)象。

軟體動(dòng)物分泌形成的外殼是在活性組織外完成自組裝過(guò)程的一個(gè)突出的例子。當(dāng)軟體動(dòng)物建造自己的外殼時(shí)，其外膜鈣化的上皮組織排出礦物離子，主要是鈣和重碳酸鹽。另外，上皮組織分泌出胞外基質(zhì)，即可溶性有機(jī)基質(zhì)(SOM)，SOM由蛋白質(zhì)、糖蛋白、蛋白多糖和多糖組成[39]。這一混合物被釋放到外皮層的外部空間，這是由上皮組織、生長(zhǎng)中的外殼以及堅(jiān)韌的角質(zhì)層所界定的微小體積[40]。在這個(gè)過(guò)飽和空間里，被釋放的大分子與重碳酸鹽和鈣相互作用生成生物晶粒，這些生物晶粒以一種有序的方式自動(dòng)聚集。最終產(chǎn)物就是密集組成的有機(jī)礦物組件—外殼，其中95%以上的重量是礦物質(zhì)層[3]。由于外殼蛋白質(zhì)在生物礦化過(guò)程中發(fā)揮著控制的作用，它們可以用來(lái)合成仿生材料[41-43]。但是，多年來(lái)，關(guān)于軟體動(dòng)物的外殼蛋白質(zhì)的原始結(jié)構(gòu)的分辨和識(shí)別受到阻礙，這主要是由于其多分散性、多陰離子的性質(zhì)以及它們經(jīng)轉(zhuǎn)錄后的修飾[40,42]。盡管有著以上困難和阻礙，人們對(duì)軟體動(dòng)物的外殼蛋白質(zhì)的研究在近幾年有了重大的進(jìn)步。目前，科學(xué)家已經(jīng)表征了18種蛋白質(zhì)，并且，其中的大多數(shù)所對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本已被識(shí)別。

就目前我們所知，現(xiàn)在還沒(méi)有對(duì)鈍擬蟹守螺外殼的研究。本研究擬對(duì)存在于鈍擬蟹守螺(俗稱海錐，英文ObtuseCreeper，學(xué)名CerithideaObtusa[44])外殼中的基質(zhì)蛋白質(zhì)進(jìn)行提取、純化、并部分表征，同時(shí)還計(jì)劃進(jìn)行生物體外礦化作用的研究。通過(guò)本研究，我們希望能夠獲取鈍擬蟹守螺外殼的形態(tài)，獲取對(duì)提取得到的可溶性有機(jī)基質(zhì)(以下簡(jiǎn)稱SOM)的組成的初步了解，同時(shí)能夠了解SOM在碳酸鈣的生物礦化過(guò)程中起的作用。

2 材料與方法

外殼材料：從新鮮的軟體動(dòng)物鈍擬蟹守螺得到的外殼。

外殼的制備：含有新鮮的軟體動(dòng)物的外殼首先在次氯酸漂白水溶液(5%)中漂白24小時(shí)，洗去其中軟體活體。之后風(fēng)干外殼約4小時(shí)，再用研缽和杵將其磨成細(xì)粉末。

有機(jī)基質(zhì)的提?。涸?℃的持續(xù)攪拌下，每隔20分鐘向40克外殼粉末中加入20ml30%(v/v)的乙酸共14次，使外殼粉末脫鈣。得到的漿狀物用通用32HettichZentrigugen離心機(jī)以4500rpm離心分離30分鐘，用以分離上清液(可溶物)和不溶部分?？扇懿糠钟贸兯?Milliporewater)在4℃下透析1天使其完全脫鹽。將完全脫鹽的溶液凍干，得到SOM用于之后的研究。

SOM中主要基質(zhì)成分的純化：將SOM(約20mg)溶于1ml0.1%的三氟乙酸中，并用RP-HPLC進(jìn)行純化。用工作站(PerkinElmerPerSeptiveBiosystems)的JupiterC18反相柱(5μg,250×10mm)來(lái)對(duì)SOM進(jìn)行分離。色譜柱用0.1%的三氟乙酸平衡，并用乙腈水溶液(80%乙腈)做線性梯度進(jìn)行洗脫。將之前得到的微型濃縮樣品注射入色譜柱中，并以2ml/分鐘的速度洗脫。在215nm,254nm,280nm檢測(cè)到洗脫得到的蛋白質(zhì)。

根據(jù)Laemmli方法[45]在非還原條件下在4-20%的聚丙烯酰胺膠上(Bio-Rad)進(jìn)行了凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。蛋白質(zhì)用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

晶體生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)：將兩種實(shí)驗(yàn)方法用于晶體生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。一種方法是在玻璃蓋玻片上培養(yǎng)碳酸鈣晶體，將蓋玻片置于裝有氯化鈣溶液的細(xì)胞培養(yǎng)皿(Nunc)(4×6)中。具體方法是在電子微量天平(WiggenHauser)上準(zhǔn)確稱量低壓凍干的SOM，將其溶解于10mM氯化鈣溶液中最終得到0-1000μgSOM/ml的溶液濃度。將1ml的上述溶液置于裝有蓋玻片的培養(yǎng)皿的小凹槽中，之后整個(gè)裝置用鋁箔紙蓋住，并在其上戳幾個(gè)小孔。將上述裝置放入一個(gè)完全密封的干燥器中，在干燥器中放入碳酸銨，碳酸銨的分解釋放出氣體，并緩慢擴(kuò)散，使得晶體得以生長(zhǎng)。24小時(shí)后，將蓋玻片從培養(yǎng)皿的結(jié)晶凹槽中小心取出，用超純水(Milliporewater)輕輕洗滌，并在室溫下風(fēng)干，用于后續(xù)的分析。

晶體生長(zhǎng)還采用了另一種方法。用磨碎的外殼粉末和超純水(Milliporewater)得到懸浮液(2g/L)，將純化的二氧化碳通入經(jīng)攪拌的懸浮液中90分鐘，得到過(guò)飽和的碳酸氫鈣溶液。懸浮液用一次性使用的0.2μm過(guò)濾器(Minisart)過(guò)濾，然后將二氧化碳通過(guò)過(guò)濾后的清液30分鐘，以確保溶液中的二氧化碳過(guò)飽和。將1ml過(guò)飽和的碳酸氫鈣溶液置于每個(gè)22×22mm的蓋玻片上，用于生長(zhǎng)碳酸鈣晶體。將多個(gè)蓋玻片置于90mm的皮氏培養(yǎng)皿(PetriDish)中。整個(gè)裝置用鋁箔紙蓋住，并在其上戳幾個(gè)小孔。分別在1，2，4，6，14和24小時(shí)后將蓋玻片從沉降介質(zhì)中取出，用超純水輕輕洗滌，并在室溫下風(fēng)干。

形態(tài)研究與表征：鈍擬蟹守螺的外殼采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜設(shè)備ThermoJarrelAshDuoAxisPlasma進(jìn)行元素分析。制備樣品原液前，用濃硝酸溶解約1mg樣品30分鐘。稀釋鈣和鎂的原液至標(biāo)準(zhǔn)溶液的要求范圍，并將其用于儀器的校準(zhǔn)。外殼粉末的X射線衍射實(shí)驗(yàn)使用D5005SiemensX射線衍射儀，銅靶輻射在40kV和40mA下進(jìn)行。將外殼粉末置于塑料載物架上進(jìn)行衍射實(shí)驗(yàn)研究。使用PhilipsXL-30和JEOLJSM6700掃描電鏡獲取掃描電鏡圖像。外殼粉末、提取的SOM和生成的晶體使用BioRadFTS165FT-IR分光光度計(jì)在4000-400cm-1下進(jìn)行表征。

3 結(jié)果與討論

鈍擬蟹守螺外殼的形態(tài)研究和表征：元素分析結(jié)果表明外殼的珍珠層和棱柱層中的主要礦物成分都是鈣(表1)。與其它外殼相似的是，鈍擬蟹守螺的外殼含有鎂，鎂在外殼的形成中經(jīng)證實(shí)有著重要的作用[46]。與珍珠層相比，整個(gè)外殼中礦物質(zhì)含量較高，說(shuō)明棱柱層中礦物質(zhì)含量比珍珠層中礦物質(zhì)含量要高。這可能是由于，在珍珠層中，軟體動(dòng)物在殼內(nèi)分泌出較多含量的有機(jī)成分，用于幫助外殼晶體的形成生長(zhǎng)。棱柱層中較高的礦物質(zhì)含量在增加外殼硬度上發(fā)揮著作用，從而保護(hù)軟體動(dòng)物免予暴露于外界環(huán)境中。

表1 鈍擬蟹守螺外殼的元素組成

為判定鈍擬蟹守螺的外殼的晶型，采用紅外光譜對(duì)外殼粉末進(jìn)行分析(圖1)。

圖1 鈍擬蟹守螺外殼粉末的紅外光譜

858.6cm-1，1504.3cm-1和1440.8cm-1，以及712.4cm-1和 699.6cm-1分別與文石的v2,v3和v4模式相對(duì)應(yīng)。方解石v3模式所對(duì)應(yīng)的1420-1435cm-1區(qū)間的典型特征峰并沒(méi)有在紅外光譜中出現(xiàn)。為了對(duì)外殼的晶型有更進(jìn)一步的了解，還進(jìn)行了X射線的衍射分析(見(jiàn)圖2)。圖2顯示了譜圖在2θ-45.96○有清晰的峰，這正是文石晶型的特征峰[51]。而未發(fā)現(xiàn)方解石的典型特征峰。因此，得出結(jié)論鈍擬蟹守螺外殼中的鈣是以文石晶型存在的。這與目前研究的大多數(shù)軟體動(dòng)物的外殼不同，這些軟體動(dòng)物的外殼中碳酸鈣的晶型為方解石[35]。

圖2 鈍擬蟹守螺外殼粉末的X射線衍射圖

SOM的提取和表征：產(chǎn)率由凍干酸性可溶基質(zhì)的稱重獲得。酸溶基質(zhì)的平均產(chǎn)率(兩次制備的平均值)是4.37mg/g外殼。

采用紅外光譜分析用以研究提取的SOM的化學(xué)組成(見(jiàn)圖3和圖4)。在紅外譜圖中，3600-3000cm-1的區(qū)域內(nèi)可以觀察到蛋白質(zhì)和多糖所含有的NH和OH的伸縮轉(zhuǎn)動(dòng)峰。在3000-2815cm-1區(qū)間內(nèi)，沒(méi)有觀察到明顯的亞甲基的伸縮轉(zhuǎn)動(dòng)峰，說(shuō)明有機(jī)基質(zhì)中不含脂的脂肪族碳?xì)滏?。在紅外譜圖中，發(fā)現(xiàn)有蛋白質(zhì)和多肽的特征峰酰胺I和酰胺II，關(guān)于這兩個(gè)峰在1800-1400cm-1區(qū)域的特征值曾有文獻(xiàn)進(jìn)行過(guò)詳細(xì)的研究[47]。酰胺I是蛋白質(zhì)最強(qiáng)的峰帶，并因此被用于與蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)成分系統(tǒng)關(guān)聯(lián)[48]。在1720-1600cm-1和1580-1500cm-1之間的顯著吸收峰分別對(duì)應(yīng)于酰胺I的羰基伸縮振動(dòng)和蛋白質(zhì)中酰胺II的NH彎曲振動(dòng)[48]。曾有研究指出酰胺I的α螺旋結(jié)構(gòu)峰值位置在約1650cm-1。這里酰胺在1610cm-1的吸收峰說(shuō)明SOM的組成中可能不含有α螺旋構(gòu)象。在1719和1450cm-1處可以觀察到強(qiáng)的羧酸鹽吸收峰?？梢源_定的是只有精氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、酪氨酸、組氨酸和苯基丙氨酸在1800-1400cm-1有著強(qiáng)吸收峰[50]。鈍擬蟹守螺的SOM顯示出7個(gè)高強(qiáng)度的峰帶。在1719和1562cm-1的峰一般認(rèn)為是天冬氨酸,而在1670和1610cm-1的峰對(duì)應(yīng)谷氨酸。而對(duì)應(yīng)于天門冬氨酸的峰(1622和1678cm-1)并未出現(xiàn)在上述譜圖中。在1200-880cm-1的范圍內(nèi)，可以觀察到多糖組分的多個(gè)指紋吸收峰和C-O的彎曲振動(dòng)峰。因此，譜圖顯示鈍擬蟹守螺的SOM主要由蛋白質(zhì)和多糖組成。

圖3 從鈍擬蟹守螺外殼中提取的可溶性有機(jī)基質(zhì)的紅外譜圖

圖4 鈍擬蟹守螺外殼中提取的SOM的詳細(xì)紅外譜圖((A)顯示了酰胺I、酰胺II和含糖區(qū)域，(B)顯示了酰胺I和II的區(qū)域)

酸溶性有機(jī)基質(zhì)(SOM)含有幾種不同蛋白質(zhì)，用SDS-PAGE凝膠電泳法分析，可以觀察到4個(gè)用考馬斯亮藍(lán)深度染色的條帶(見(jiàn)圖5)。凝膠電泳的第一個(gè)部分還有一個(gè)約30kD(根據(jù)多肽的分子量標(biāo)準(zhǔn))的條帶。出乎意料的是，另外兩個(gè)主帶和一個(gè)較弱的條帶含有大于30kD的成分，說(shuō)明SOM含有分子質(zhì)量很大的組分。

圖5 鈍擬蟹守螺的SOM的SDS-PAGE凝膠顯示出SOM具有較大的分子量

將SOM進(jìn)一步在JupiterC18柱上用RP-HPLC純化。圖6顯示了幾個(gè)洗脫組分(以a,b,c和d標(biāo)示)的色譜圖，說(shuō)明了SOM中含有一個(gè)主要的蛋白質(zhì)，幾個(gè)組分的強(qiáng)度與凝膠電泳中的染色強(qiáng)度一致。

晶體生長(zhǎng)的研究：為了解SOM在鈍擬蟹守螺外殼鈣化中的作用，進(jìn)行了碳酸鈣晶體生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。碳酸鈣晶體在不同濃度的SOM下進(jìn)行培養(yǎng)。圖7顯示了SOM對(duì)于碳酸鈣體外結(jié)晶的影響。在沒(méi)有SOM存在的空白試驗(yàn)中(圖7A)，觀察到有菱形的方解石晶體。當(dāng)提高SOM濃度至50μg/ml，菱形的方解石晶體呈現(xiàn)螺旋位錯(cuò)，即出現(xiàn)在{104}晶面上帶有圓形凹陷的“漏斗形”晶體。在這一濃度，菱形的方解石晶體形成，且其形狀和大小并未發(fā)生明顯變化。其凹陷的形成可能是由于蛋白質(zhì)與生長(zhǎng)中的方解石晶體的晶體面相互作用而引起的。另外，可以清晰的看到一個(gè)新的球形相，后經(jīng)辨認(rèn)是文石。當(dāng)濃度提高到100μg/ml，更多的球形文石出現(xiàn)，而方解石晶體的形態(tài)保持不變。但是，當(dāng)SOM濃度繼續(xù)增加至>250μg/ml時(shí)，文石相消失，同時(shí)方解石晶體開始聚集。這可能是由于SOM的聚集。一旦SOM聚集，它就不能再誘導(dǎo)碳酸鈣沉降生成文石。

圖6 可溶性外殼蛋白質(zhì)的RP-HPLC分離(洗脫峰對(duì)應(yīng)含有的不同蛋白質(zhì))

圖7 碳酸鈣的體外結(jié)晶：A.沒(méi)有SOM；B.SOM的濃度為50μg/ml；C.SOM的濃度為100μg/ml；D.SOM的濃度為250μg/ml；E.SOM的濃度為500μg/ml；F.SOM的濃度為1000μg/ml

為了確定球形結(jié)構(gòu)的晶型，采用了紅外光譜對(duì)于體外生長(zhǎng)的晶體進(jìn)行了分析。圖8中顯示了碳酸鈣晶體的v2和v4的峰圖。正如在紅外光譜中所看到的，v2的振動(dòng)峰首先出現(xiàn)在873-875cm-1區(qū)間，這與方解石的v2峰帶相對(duì)應(yīng)。隨著SOM的濃度增加，峰逐漸從874cm-1變成854-857cm-1的小區(qū)間，這正是文石的碳酸根變形峰區(qū)間。文石的v2峰的強(qiáng)度在SOM濃度達(dá)到100μg/ml時(shí)達(dá)到最大，之后隨著SOM的濃度增加逐漸減小。當(dāng)SOM濃度達(dá)到1000μg/ml時(shí)，方解石的v2特征峰強(qiáng)度明顯增加，而文石的v2特征峰消失。類似的，在SOM濃度為50μg/ml和100μg/ml時(shí)，v4峰表明了文石的形成，因?yàn)樵摲逶?99.6cm-1處分裂。這與文石v4峰的簡(jiǎn)并相對(duì)應(yīng)。而這個(gè)雙峰在SOM濃度繼續(xù)增加時(shí)消失，說(shuō)明文石在高濃度的SOM下消失。因此，SOM在低濃度下，也許對(duì)于晶體生長(zhǎng)的晶型控制起到了作用。一旦SOM濃度超過(guò)優(yōu)化點(diǎn)，SOM的濃度增加只會(huì)引起晶體數(shù)量的增加，而對(duì)于碳酸鈣晶體的晶型則沒(méi)有影響。這些紅外光譜結(jié)果與掃描電鏡分析的觀察和結(jié)論相吻合。

基于以上結(jié)果，在此提出晶體生長(zhǎng)的機(jī)理如下：因?yàn)榉浇馐窃谧匀唤缰凶罘€(wěn)定的晶型，在一般室溫環(huán)境即一個(gè)大氣壓和合適的溫度下，方解石會(huì)在沒(méi)有SOM的條件下生成。當(dāng)SOM濃度增加時(shí)，SOM可能提供了文石的成核中心，同時(shí)增強(qiáng)了已經(jīng)形成的文石的穩(wěn)定性，從而引起文石數(shù)量的增加。但是，當(dāng)SOM的濃度超過(guò)了某一特定值，并且繼續(xù)增加時(shí)，就可能產(chǎn)生蛋白質(zhì)的聚集，這就抑制了成核中心與碳酸鈣之間的交互作用。結(jié)果，文石消失，而高濃度的SOM促進(jìn)了晶體的生長(zhǎng)，使得方解石迅速增加。

圖8 不同SOM濃度下，碳酸鈣晶體體外生長(zhǎng)24小時(shí)后晶格振動(dòng)頻率范圍內(nèi)的紅外光譜：SOM濃度a)0(對(duì)照組)；b)50μg/ml；c)100 μg/ml；d)250μg/ml；e)500μg/ml；f)1000μg/ml

根據(jù)另一種晶體生長(zhǎng)方法，為了了解碳酸鈣隨時(shí)間變化的形成過(guò)程，晶體生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)分別在1小時(shí)，2小時(shí)，4小時(shí)，6小時(shí)，14小時(shí)和24小時(shí)下進(jìn)行觀察。

圖9 外殼晶體生長(zhǎng)的紅外光譜a)1小時(shí)； b)2小時(shí)；c)4小時(shí)；d)6小時(shí)；e)14小時(shí)；f)24小時(shí)

如前所述，已經(jīng)知道，v2和v4是方解石的振動(dòng)特征峰。根據(jù)外殼晶體在不同時(shí)間段下生長(zhǎng)的紅外光譜(圖9)，在正常環(huán)境條件下，產(chǎn)生的是方解石而不是文石。這有可能是由于SOM的濃度較低，同時(shí)也說(shuō)明除了SOM，礦化過(guò)程還有可能有其它因素，比如pH值，微環(huán)境和軟體動(dòng)物本身的存在，對(duì)于晶體晶型有著很大的影響。另外，由于特征峰的強(qiáng)度在14小時(shí)達(dá)到最大值，因此14小時(shí)可能是結(jié)晶的最佳生長(zhǎng)時(shí)間。當(dāng)然，由于研究時(shí)間有限，沒(méi)有對(duì)生成晶體的形態(tài)進(jìn)行相關(guān)研究。

4 結(jié)論

在本研究中，鈍擬蟹守螺外殼中的SOM得到了分離、純化，并使用凝膠電泳，高效液相色譜和紅外光譜對(duì)其進(jìn)行了部分表征。同時(shí)，還進(jìn)行了生物礦化實(shí)驗(yàn)，并研究分析了在SOM影響下碳酸鈣結(jié)晶的特點(diǎn)。晶體的性狀用掃描電鏡，結(jié)合紅外光譜進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其包含兩種碳酸鈣晶型，文石和方解石。體外晶體生長(zhǎng)研究發(fā)現(xiàn)，SOM對(duì)于碳酸鈣晶體的不同晶型形成具有影響。

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2016-06-15

合肥師范學(xué)院校級(jí)項(xiàng)目(項(xiàng)目號(hào)：2015QN11)

楊瀟(1983-)，女，合肥師范學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院教師，主要從事化工專業(yè)教學(xué)工作。

G

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1674-2273(2016)06-0041-06