楊心剛

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RP-HPLC同時測定大花紅景天中3種活性成分的含量

楊心剛

目的 用RP-HPLC-ELSD同時測定大花紅景天中紅景天苷、大花紅天素、紫丁香苷的含量。方法 采用Phenomenex C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，流動相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫，柱溫30℃，流速1.0 mL/min，霧化溫度36℃，漂移管溫度 60 ℃，增益10。結(jié)果 紅景天苷、大花紅天素、紫丁香苷在73.59～1471.8 ng、81.52～1630.4 ng、78.73～1574.6 ng范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。平均回收率(%)分別為98.65、99.33、99.67。結(jié)論 該方法靈敏、準(zhǔn)確，分離效果較好，無干擾，可作為完善大花紅景天質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評價提供依據(jù)，為臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

大花紅景天；紅景天苷；紫丁香苷；大花紅天素

大花紅景天為景天科植物大花紅景天Rhodiolacrenulata(Hook.f.et Thoms.)H.Ohba的干燥根和根莖[1]。大花紅景天具有抗衰老、抗輻射、抗氧化性溶血等活性，其主要成分為紅景天苷、酪醇、大花紅天素、多酚類及多糖類等[2～4]。大花紅景天的功效較廣，具有清肺止咳、抗腦缺氧、抗疲勞、活血止血、化淤消腫等作用[5，6]，并隨著技術(shù)的發(fā)展，大花紅景天已經(jīng)開發(fā)成藥物或保健品，目前市場上含大花紅景天的藥品或保健品多達(dá)80個[7]。大花紅景天開發(fā)的力度較大，但對其全面的質(zhì)量控制還不夠完善。另外，目前對大花紅景天中的紅景天苷、大花紅天素、紫丁香苷3種成分同時測定的報道較少。因此，本文探討用RP-HPLC-ELSD同時測定大花紅景天中紅景天苷、大花紅天素、紫丁香苷的含量，旨在完善大花紅景天的綜合質(zhì)量評價方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，Alltech 3300蒸發(fā)光散射檢測器；KQ-100型超聲清洗器(昆明市超聲儀器有限公司)；Sartorius BP211D分析天平(德國賽多利斯)；紅景天苷對照品(批號：110818-201206)、紫丁香苷對照品(批號：100185-200505)供HPLC含量測定用，均由中國藥品生物制品檢定所提供；大花紅天素對照品(批號：140801，純度98.9%，自制)。甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純；水為超純水；大花紅景天藥材購自西藏自治區(qū)不同地區(qū)，經(jīng)鑒定為大花紅景天。

2 方法與結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性試驗 Phenomenex C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，流動相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0～10min，8% A；10～25min，8%～21% A，25.1min，8% A；25.1～30 min，8% A)，柱溫30℃，流速1.0 mL/min，載氣為氮氣，體積流量 2.0 L/min，霧化溫度36℃，漂移管溫度 60 ℃，增益10。理論塔板數(shù)按紅景天苷峰計算不低于2000，見圖1。

1. 紅景天苷 2. 大花紅天素 3. 紫丁香苷圖1 混合對照品溶液

2.2 對照品溶液的制備 取各對照品適量，精密稱定，分別置5mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得單個對照品儲備液，濃度分別為1.4718 mg.mL-1、1.6304 mg.mL-1、1.5746 mg.mL-1。精密量取各對照品溶液適量置于量瓶中，甲醇稀釋并定容，制成混合對照品溶液，濃度分別為：紅景天苷73.59 μg.mL-1、大花紅天素81.52μg.mL-1、紫丁香苷78.73μg.mL-1，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末0.1 g，置于具塞錐形瓶中，精密量取甲醇20mL，精密稱定，超聲處理30 min，放冷，精密稱定，用甲醇補足重量，搖勻，用0.45μm濾膜過濾，即得。

2.4 線性關(guān)系實驗 精密吸取上述混合對照品溶液1、5、10、15、20μL，注入色譜儀，以進(jìn)樣量的對數(shù)為自變量，色譜峰面積的對數(shù)為因變量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，見表1。

表1 線性回歸性分析

2.5 儀器精密度 精密吸取混合對照品溶液10μL，以各峰面積的對數(shù)分別計算，紅景天苷、大花紅天素、紫丁香苷的RSD分別為1.43%、1.63%、1.72%(n=5)。

2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取新制備的同一供試品溶液(編號1樣品)，于0、2、4、8、10、12h進(jìn)樣10μL進(jìn)行含量測定，峰面積RSD分別為1.66%、1.93%、1.42%。

2.7 方法重復(fù)性 取同一批樣品(編號1樣品)，共6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣體積10μL，以對數(shù)外標(biāo)兩點法計算含量，紅景天苷、大花紅天素、紫丁香苷的含量分別為13.56 mg.g-1、8.24 mg.g-1、7.37 mg.g-1，RSD分別為1.66%、1.75%、1.99%。

2.8 方法回收率 取已經(jīng)測定含量的樣品(編號1樣品)9份，每份約0.05 g，精密稱定，按照供試品測定的紅景天苷、大花紅天素、紫丁香苷和草質(zhì)素苷含量，以其一半的100%比例精密加入單個儲備對照品溶液，再按照2.2項下方法制備供試品溶液，并按色譜條件測定樣品，紅景天苷、大花紅天素、紫丁香苷的回收率分別為98.65%(RSD=1.95%)、99.33%(RSD=1.72%)、99.67%(RSD=2.28%)。

2.9 樣品含量測定 取所收集的9個不同來源藥材，按照上述色譜條件下進(jìn)樣測定，以對數(shù)外標(biāo)兩點法計算含量見表2。

表2 西藏不同產(chǎn)地樣品測定結(jié)果 (n=3，mg.g-1)

3 討論

大花紅景天主治氣虛體弱、病后畏寒、氣短乏力、肺熱咳嗽、咯血、白帶腹瀉、跌打損傷等[8，9]。目前，大花紅景天應(yīng)用較廣，在中藥制劑、化妝品、食品、保健品等方面被開發(fā)利用，但大花紅景天藥材受地域影響較大，其質(zhì)量差異也較大，相關(guān)大花紅景天質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)有待完善[10]。其質(zhì)量的優(yōu)劣直接關(guān)系著大花紅景天的臨床應(yīng)用效果，也關(guān)系著大花紅景天的合理應(yīng)用。因此，對于如何定性、定量地控制大花紅景天的質(zhì)量的研究意義重大，必須制定有效、安全、可控的大花紅景天的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

本實驗，對比了水、40%甲醇、80%甲醇、甲醇、40%乙醇、80%乙醇、乙醇提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇提取溶劑能有效成分提取較完全，故選取甲醇作為提取溶劑；對比了不同超聲提取時間：10min、20min、30min、40min、50min，結(jié)果顯示，超聲提取30min就能夠提取完全，故選用超聲提取30 min；對比乙腈-水、甲醇-水、乙腈-甲醇-水等流動性系統(tǒng)，結(jié)果顯示乙腈-水系統(tǒng)分離效果俱佳，各峰的對稱因子均在0.95～1.05之間，確定乙腈-水系統(tǒng)作為流動相。大多數(shù)文獻(xiàn)報道[11]，利用梯度洗脫，梯度比例變化較大，且變化步驟較多。而本文梯度洗脫變化比例簡單，克服了梯度過于復(fù)雜，難以操作，避免梯度復(fù)雜而導(dǎo)致重復(fù)性較低和基線不穩(wěn)等現(xiàn)象出現(xiàn)，最終造成的是樣品組分含量難以得到保證。而本文中各峰均能達(dá)到基線分離，能較好定性和定量，系統(tǒng)適用性較好。本文采用蒸發(fā)光散射檢測器作為檢測器，有文獻(xiàn)報道采用紫外檢測器對大花紅景天中有效成分的含量測定[12]，但紫外檢測器對不同成分的檢測，一般需要不同的檢測波長，對于多成分的含量測定，檢測時間就比較長，操作過程費時。

在對西藏不同產(chǎn)地大花紅景天的含量考察中，大花紅景天中的紅景天苷含量在5.94 mg.g-1～21.83 mg.g-1，高低相差近4倍，大花紅天素含量在5.28 mg.g-1～26.73 mg.g-1，高低相差5倍，紫丁香苷含量在7.37 mg.g-1～30.15 mg.g-1，高低相差近4倍，各成分差異較大，這可能與產(chǎn)地的氣候、水土等環(huán)境因素有關(guān)，也有可能與大花紅景天的加工、貯藏過程有關(guān)。

綜上所述，本文建立了RP-HPLC-ELSD同時測定大花紅景天中紅景天苷、大花紅天素、紫丁香苷3種成分含量的方法，該方法靈敏、準(zhǔn)確，分離效果較好，無干擾，可作為完善大花紅景天質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評價提供依據(jù)。

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