婁瑩瑩 李佃貴 王彥剛 張 紈 孫潤雪 霍耐月

(河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050017)

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肝復(fù)健方對大鼠免疫性肝纖維化的干預(yù)作用及機(jī)制

婁瑩瑩 李佃貴 王彥剛 張 紈 孫潤雪 霍耐月

(河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050017)

目的 觀察以“濁毒”立論的肝復(fù)健方抗大鼠肝纖維化(HF)的作用及機(jī)制。方法 SD大鼠腹腔注射豬血清 0.5 ml，2次/w，連續(xù)8 w制備HF模型，每天灌胃分別給予不同劑量的肝復(fù)健方和秋水仙堿治療至12 w末。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，觀察肝組織病理改變，放射免疫分析法檢測血清透明質(zhì)酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、瘦素(Leptin)水平，RT-PCR法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 所有給藥組肝臟損傷程度均較模型組減輕，肝復(fù)健方高劑量組肝臟結(jié)構(gòu)改善最為明顯。與模型組比較，肝復(fù)健方各給藥組血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ、Leptin水平明顯降低(P<0.05),與對照組比較，模型組及各藥物組MMP-1表達(dá)明顯減弱；經(jīng)肝復(fù)健方治療后大鼠肝臟MMP-1表達(dá)均比模型組增強(qiáng)。結(jié)論 肝復(fù)健方能降低血清Leptin水平，增強(qiáng)MMP-1的表達(dá)，減輕免疫性HF大鼠的肝細(xì)胞損傷，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的代謝，從而阻止或逆轉(zhuǎn)HF。

肝復(fù)健方；免疫性肝纖維化；血清標(biāo)志物；瘦素；基質(zhì)金屬蛋白酶-1

肝病是我國常見多發(fā)病，嚴(yán)重影響患者生存率及生活質(zhì)量。肝纖維化(HF)是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段，但尚屬于可逆階段，故HF的防治、逆轉(zhuǎn)成為阻斷這一惡性發(fā)展鏈的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。以“濁毒”立論的肝復(fù)健方是李佃貴教授治療HF的有效經(jīng)驗(yàn)方，臨床證實(shí)療效確切，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討該方抗HF作用及深層機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級SD大鼠60只，雄性，體重(200±20)g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號 1105033)。

1.2 藥品 肝復(fù)健方由茵陳、田基黃、絞股藍(lán)、白花蛇舌草、虎杖、黃連、黃柏、鱉甲、山甲珠、三棱、紅景天、丹參、當(dāng)歸、白芍等組成，生藥購自河北省中醫(yī)院中藥房。河北省中醫(yī)院煎藥房煎煮，滅菌分裝，4℃保存。無菌未滅活豬血清(購于北京燕生政博生物科技有限責(zé)任公司)；

1.3 試劑與儀器 透明質(zhì)酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、瘦素(Leptin)放免試劑盒，購自北京中山生物技術(shù)有限公司。Trizol(美國Invitrogen公司)；DEPC(美國Sigma公司)； PCR擴(kuò)增儀(美國PE公司)；電泳儀及電泳槽(北京六一儀器廠)等；

1.4 方法

1.4.1 免疫性HF模型制備 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，造模采用腹腔注射豬血清法，2次/w，豬血清0.5 ml/只，周一、周五上午9點(diǎn)，共8 w。

1.4.2 分組及給藥 大鼠隨機(jī)分為6組：即正常對照組、模型組、秋水仙堿組、肝復(fù)健方低、中、高劑量組，每組10只。正常對照組、模型組給予生理鹽水灌胃；肝復(fù)健方低、中、高劑量組分別給予含生藥1.4、2.8、4.2 g/ml水煎劑灌胃；秋水仙堿組給予秋水仙堿0.154 g·kg-1·d-1灌胃至12 w末。

1.4.3 指標(biāo)觀察

1.4.3.1 肝組織病理學(xué)觀察 常規(guī)制備肝組織切片，HE和Masson染色，觀察肝組織病理學(xué)改變。

1.4.3.2 血液相關(guān)生化指標(biāo)檢測 放射免疫分析法檢測血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平，各組大鼠干預(yù)后血清Leptin水平。方法參照試劑盒說明操作。

1.4.3.3 RT-PCR半定量檢測肝組織基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1 mRNA的表達(dá) 引物序列依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)，由北京塞百盛基因技術(shù)有限公司合成。擴(kuò)增的MMP-1 基因序列上游引物:5'-CCCATCCAGCCAACAGGT-3'，下游引物：5'-CTTCTGCTGTTAATCTAG -3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為457 bp；GAPDH上游引物：5'-CCTTCATTGACCTCAACTAC-3',下游引物：5'-GGAAGGCCATGCCAGTGAGC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為594 bp。PCR反應(yīng)條件： 94℃變性3 min；然后94℃40 s，55℃50 s，72℃90 s(30個(gè)循環(huán))；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的含GV核酸染料的瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Marker(DL2000)作為標(biāo)準(zhǔn)片段標(biāo)記，電泳后于紫外透射儀觀察，并用數(shù)碼相機(jī)照相，輸入微機(jī)應(yīng)用凝膠圖像分析軟件對目的電泳條帶進(jìn)行分析，以相應(yīng)的內(nèi)參電泳條帶作為參照，結(jié)果以兩者之積分吸光度的比值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，單因素方差分析，SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 對HF大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響 模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)可見破壞，肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞變性，部分肝細(xì)胞壞死，可見大量中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，纖維組織增生，個(gè)別動(dòng)物可見假小葉形成。秋水仙堿組與肝復(fù)健方治療各組肝臟損傷程度均較模型組輕，肝復(fù)健方高劑量組肝臟結(jié)構(gòu)改善最為明顯，秋水仙堿組與肝復(fù)健方中劑量組肝臟病變相當(dāng)，肝復(fù)健方低劑量組大鼠肝臟炎癥和纖維化程度最重。

2.2 對免疫性HF大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ、Leptin的影響 如表1、表2所示，與正常對照組相比，模型組大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CIV、Leptin水平升高(P<0.01)。與模型組相比，各藥物干預(yù)組大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ、Leptin水平下降(P<0.01)。肝復(fù)健方高劑量組水平降低最為明顯。

組別HA(ng/ml)LN(ng/ml)PCⅢ(ng/ml)CⅣ(ng/ml)正常對照組39.9010±1.675231.3973±3.012143.5753±2.34799.4868±0.8909模型組71.8248±1.84071)66.8759±1.83211)73.4265±1.97631)19.0318±1.28611)秋水仙堿組47.2102±1.58881)2)53.0735±2.67461)2)54.2876±1.40251)2)13.4126±0.96541)2)肝復(fù)健方低劑量組53.0892±1.55251)2)3)62.8055±1.95051)2)3)63.2639±2.21901)2)3)15.6840±0.99671)2)3)肝復(fù)健方中劑量組46.9040±1.53131)2)52.1196±2.34371)2)54.4389±1.89361)2)13.3490±1.00471)2)肝復(fù)健方高劑量組42.9793±1.15011)2)3)39.7432±3.16101)2)3)50.0175±2.06131)2)3)11.7406±0.90151)2)3)

與正常對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；與秋水仙堿組比較:3)P<0.05，下表同

2.3 對免疫性HF大鼠肝組織MMP-1 mRNA的表達(dá)的影響 模型組及各藥物治療組MMP- 1 mRNA的表達(dá)均較正常對照組減弱(P<0.05)。各藥物治療組與模型組比較，MMP- 1 mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)。其中，肝復(fù)健方高劑量組MMP-1 mRNA的表達(dá)顯著性增強(qiáng)，優(yōu)于其他治療組(P<0.05)，秋水仙堿組與膠復(fù)健中劑量組比較MMP-1 mRNA的表達(dá)有增強(qiáng)趨勢，但均無顯著性差異(P>0.05)。秋水仙堿組與肝復(fù)健低劑量組比較，MMP-1 mRNA的表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)。見表2、圖1。

組別Leptin(ng/ml)MMP-1/GAPDH正常對照組9.035±0.41210.5167±0.0278模型組14.878±0.63081)0.1766±0.03041)秋水仙堿組11.736±0.42161)2)0.3689±0.28561)2)肝復(fù)健方低劑量組13.305±0.42271)2)3)0.2544±0.09331)2)3)肝復(fù)健方中劑量組11.854±0.49831)2)0.3335±0.01511)2)肝復(fù)健方高劑量組10.804±0.37701)2)3)0.4112±0.01761)2)3)

M:Marker；1:正常對照組；2:模型組；3:肝復(fù)建方低劑量組；4:肝復(fù)建方中劑量組；5:肝復(fù)建方高劑量組；6:秋水仙堿組；MMP-1為457 bp，GAPDH為594 bp圖1 肝復(fù)健方對HF大鼠肝組織MMP-1 mRNA基因表達(dá)的影響

3 討 論

HF是引起肝臟功能障礙和肝硬化的病理基礎(chǔ)，是肝臟纖維組織過度沉積的過程，表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成大于降解。中醫(yī)學(xué)將HF歸屬于黃疸、脅痛、臌脹等疾病的范疇。肝復(fù)健方是李佃貴教授在濁毒理論指導(dǎo)下擬定而成，方中茵陳、田基黃化濁解毒為君藥；虎杖活血兼解熱毒利濕濁；絞股藍(lán)、白花蛇舌草清熱解毒，寒涼清瀉以降濁；黃柏、黃連苦寒燥濁，雙管齊下，共奏化濁解毒功效，共為臣藥。三棱破血行氣消積；鱉甲滋養(yǎng)肝腎，軟堅(jiān)散結(jié)；山甲珠活血散瘀、通行經(jīng)絡(luò)；白芍柔肝養(yǎng)肝血；當(dāng)歸、丹參養(yǎng)血活血；紅景天益氣活血，清熱解毒，共為佐使之用。諸藥合用，濁毒可去，氣血調(diào)暢，肝復(fù)如常。

本文結(jié)果顯示，肝復(fù)健方可改善HF大鼠肝組織病理學(xué)形態(tài)，且高劑量組療效最為明顯。HA、LN、PCⅢ、CⅣ是ECM的主要成分。研究證實(shí)，肝復(fù)健方具有一定的調(diào)節(jié)ECM代謝的作用，可能是通過減少血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ的合成，促進(jìn)ECM的降解而達(dá)到抗纖維化的作用。

各種細(xì)胞因子形成復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)影響HF的形成和轉(zhuǎn)歸〔1〕。Leptin是一個(gè)關(guān)鍵促纖維化因子，具有細(xì)胞因子的特性，通過與相應(yīng)的受體Ob-R結(jié)合發(fā)揮作用〔2〕。Ormarsdottir等〔3〕和Ruhl等〔4〕發(fā)現(xiàn)，對于慢性肝病患者，血清Leptin水平可顯著增高。對于HF大鼠，Leptin水平與HF的程度呈正比〔5〕。研究結(jié)果顯示，模型組血清HF水平升高，經(jīng)肝復(fù)健方治療后水平明顯下降，提示可能由活化的肝星狀細(xì)胞分泌Leptin增多，從而引起血清HF水平升高。肝復(fù)健方通過降低大鼠HF Leptin水平，從而減輕肝纖維化病理程度，延緩疾病進(jìn)程。另有研究發(fā)現(xiàn)HF與Leptin受體結(jié)合后，可通過JAK-STAT途徑,直接作用于(HSC)，阻礙HSC的凋亡，抑制MMP-1基因表達(dá)，促進(jìn)膠原的產(chǎn)生〔6〕。MMPs是降解ECM最主要的酶系，MMP-1是肝臟中分解Ⅰ型及Ⅲ型膠原的主要膠原酶。本研究結(jié)果表明，模型組及各藥物組MMP-1 mRNA的表達(dá)均明顯減弱，經(jīng)肝復(fù)健方治療后，秋水仙堿組和肝復(fù)健方各劑量組MMP-1 mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)。提示肝復(fù)健方阻礙HF發(fā)展，可能是通過增強(qiáng)膠原酶MMP-1的表達(dá)，提高降解活性，促進(jìn)間質(zhì)性膠原為主的ECM降解，從而減少纖維膠原沉積于細(xì)胞外。

綜上所述，基于濁毒理論的肝復(fù)健方是較為理想的抗HF中藥方，其可能通過抑制HSC合成和分泌Leptin，促進(jìn)MMP-1的表達(dá)，從而使ECM降解，阻礙HF進(jìn)程。

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〔2015-08-04修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.10206427D)

婁瑩瑩(1984-)，女，博士，主要從事消化系統(tǒng)疾病的中西醫(yī)結(jié)合研究。

R285.5

A

1005-9202(2016)23-5820-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.020