王 鵬 歷 春 王海鵬 蓋曉東

(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，吉林 吉林 132013)

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家族型帕金森病α-突觸核蛋白突變體寡聚化對(duì)神經(jīng)元毒性的影響

王 鵬 歷 春1王海鵬 蓋曉東1

(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，吉林 吉林 132013)

目的 觀察家族型帕金森病(PD)α-突觸核蛋白(α-Syn)突變體A53T和A30P聚集體對(duì)大鼠原代神經(jīng)元的神經(jīng)毒性。方法 取大鼠前腦皮質(zhì)神經(jīng)元進(jìn)行原代培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中加入體外孵育的α-Syn聚集體。培養(yǎng)14 d后，MTT法和神經(jīng)元流式細(xì)胞術(shù)觀察神經(jīng)元的細(xì)胞活力。免疫熒光染色后以激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)聚集體的分布。硫磺素S染色觀察細(xì)胞內(nèi)包涵體的形成。結(jié)果 加入α-Syn聚集體各組的原代神經(jīng)元細(xì)胞活力較對(duì)照組降低(P<0.05)，而加入突變體A53T和A30P聚集體的原代神經(jīng)元細(xì)胞活力比對(duì)照組明顯降低(P<0.01)；突變體A53T和A30P聚集體的原代神經(jīng)元細(xì)胞活力下降較野生型α-Syn聚集體顯著(P<0.05)。突變體A53T和A30P聚集體對(duì)神經(jīng)元的毒性作用，在1～14 d內(nèi)隨培養(yǎng)時(shí)間而增加(P<0.05)；在1～10 μmol/L濃度范圍內(nèi)，隨濃度的增加而毒性增加(P<0.05)。突變體A53T和A30P聚集體可以進(jìn)入原代神經(jīng)元內(nèi)，并可在細(xì)胞內(nèi)聚集而形成硫磺素S染色陽(yáng)性的斑塊。結(jié)論 家族型α-Syn突變體A53T和A30P聚集體對(duì)原代神經(jīng)元具有神經(jīng)毒性，此作用具有時(shí)間和劑量依賴關(guān)系。這一現(xiàn)象對(duì)闡明家族型PD的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

帕金森病；α-突觸核蛋白；寡聚體；原代神經(jīng)元；神經(jīng)毒性

目前研究認(rèn)為，老化、遺傳和環(huán)境因素的相互作用是帕金森病(PD)發(fā)病的主要原因，而α-突觸核蛋白(α-Syn)作為廣泛存在的PD特征性病理變化——路易體(LB)的主要成分，被認(rèn)為是引起PD發(fā)病的關(guān)鍵性蛋白。α-Syn在神經(jīng)組織中表達(dá)豐富，正常情況下主要存在于神經(jīng)元的突觸前神經(jīng)末梢，參與多巴胺代謝及突觸可塑性調(diào)控等多種功能。通過(guò)對(duì)罕見的PD家系的研究，發(fā)現(xiàn)一種編碼α-Syn基因的SNCA錯(cuò)義點(diǎn)突變(A53T、A30P、E46K、H50Q和G51D)可以直接引起家族性、早發(fā)性PD〔1，2〕。而聚集成纖維的α-Syn是LB的主要成分〔3〕。隨后，人們還發(fā)現(xiàn)SNCA的二倍體和三倍體變異也可以直接引起家族性、早發(fā)性PD，而該基因啟動(dòng)子區(qū)的某些多態(tài)性則與散發(fā)性PD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)使人們相信α-Syn的異常聚集與PD的發(fā)病具有密切關(guān)系。體外研究結(jié)果表明，突變?chǔ)?Syn比野生型α-Syn更容易發(fā)生錯(cuò)誤折疊〔4〕，然而，家族型突變體α-Syn的異常聚集體對(duì)神經(jīng)元有何種影響，是否具有比野生型α-Syn的聚集體更容易引起PD樣病變尚不明確。本研究觀察了家族型PD α-Syn突變體A53T和A30P聚集體對(duì)神經(jīng)元的毒性，對(duì)家族型PD的發(fā)病機(jī)制提供了新的佐證。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 DMEM(F-12)細(xì)胞培養(yǎng)基，購(gòu)自GIBCO公司；胎牛血清(FBS)和馬血清(HS)，購(gòu)自GIBCO公司。蛋白分子量Marker，購(gòu)自Pharmacia。BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒BCA Protein Assay Kit，購(gòu)自寶生物公司。MTT法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自Promega公司。α-Syn單克隆抗體(ab138501)，購(gòu)自Abcam公司。其他均為化學(xué)分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生24 h的Wistar大鼠40只，雌雄不限；購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK-(軍)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 重組蛋白的克隆與純化 將野生型α-Syn和家族型突變體A53T、A30P的cDNA分別插入pET(21a)，然后轉(zhuǎn)染至BL21(DE3)中，在含氨芐西林的YTA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)的基因重組型蛋白經(jīng)粗提后，經(jīng)HPLC法進(jìn)一步純化。純化后的蛋白用SDS-PAGE法鑒定，BCA法定量。

1.3.2 α-Syn聚集體的制備 終濃度100 μmol/L的野生型重組人α-Syn和家族型突變體A53T和A30P，置于PBS緩沖液中，37℃，1 000 r/min，震蕩孵育48 h。然后Western印跡法檢測(cè)鑒定。

1.3.3 原代神經(jīng)元培養(yǎng)方法 將出生24 h內(nèi)Wistar大鼠頭部埋置碎冰中約1 min，再放入75%酒精中浸泡30 s。斷頭，分離鼠腦。0.25%胰酶，在37℃下消化40 min。按2×105個(gè)/cm2接種于Φ35 mm培養(yǎng)皿中，或1×104/孔接種于膠原包被的96孔板中。

1.3.4 神經(jīng)元活力的測(cè)定 在96孔板中培養(yǎng)的原代神經(jīng)元經(jīng)樣品處理后，培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間進(jìn)行觀察。根據(jù)MTT法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒操作指南，向待測(cè)的細(xì)胞培養(yǎng)基中添加反應(yīng)液，20 μl/100 μl 培養(yǎng)基。5%CO2孵箱中，37℃，培養(yǎng)2 h。讀取490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.5 神經(jīng)細(xì)胞流式分析儀檢測(cè) 原代神經(jīng)元經(jīng)過(guò)寡聚體樣品處理14 d后，棄去培養(yǎng)基，0.25%胰酶消化；2 000 r/min，離心5 min收集細(xì)胞。預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次；用400 μl Binding Buffer懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度約為1×106cells/ml，在細(xì)胞懸浮液中加入5 μl Annexin V-FITC，混勻后于4℃避光下孵育15 min。加入10 μl PI后輕輕混勻于4℃避光孵育5 min；1 h內(nèi)以FACS Calibur流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)。

1.3.6 Western印跡法和免疫熒光法鑒定α-Syn聚集體 將待測(cè)的α-Syn孵育后樣本行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)束后轉(zhuǎn)膜、封閉。孵育一抗，抗人重組α-Syn單克隆抗體(1∶5 000)，4℃孵育過(guò)夜。洗膜后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育1 h。ECL法顯色并拍照。

原代神經(jīng)元在confocal皿中培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間后，棄去培養(yǎng)基，0.01 mol/L PBS漂洗細(xì)胞，預(yù)冷4%多聚甲醛室溫固定30 min。含3% Triton X-100的PBS處理30 min。1% BSA，室溫下封閉1 h。α-Syn單抗(1∶1 000)，4℃過(guò)夜。與相應(yīng)熒光二抗在室溫下避光反應(yīng)2 h。DAPI封片，晾干。激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.7 硫磺素S染色檢測(cè)胞內(nèi)包涵體 經(jīng)樣品處理的神經(jīng)元用4%PFA固定，TBS洗滌 5 min×3次。0.3%硫磺素S，室溫孵育8 min。50%酒精洗滌5 min×3次，TBS洗滌5 min，1次。避光、晾干，封片，熒光顯微鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件，組間比較用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)、單因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1 重組蛋白純化及寡聚體鑒定 經(jīng)Western印跡法鑒定得到純度較高的野生型α-Syn、家族型突變體A53T和A30P的單體及聚集體(圖1)。根據(jù)分子量，α-Syn聚集體可見二聚體(36 kD)、三聚體(54 kD)、五聚體(90 kD)和八聚體(144 kD)。

圖1 野生型α-Syn和A53T、A30P的Western印跡鑒定結(jié)果

2.2 家族型α-Syn突變體A53T、A30P的聚集體使原代神經(jīng)元活力下降 向原代神經(jīng)元培養(yǎng)基中添加終濃度為5 μmol/L的重組野生型α-Syn、A53T和A30P單體或寡聚體，培養(yǎng)14 d。MTT法結(jié)果顯示，加入α-Syn聚集體各組的原代神經(jīng)元細(xì)胞活力(51.32%)比對(duì)照組(96.26%)降低(P<0.05)，而加入突變體A53T和A30P聚集體的原代神經(jīng)元細(xì)胞活力(17.82%、15.67%)比對(duì)照組(92.41%、91.02%)明顯降低(P<0.01)；突變體A53T和A30P聚集體的原代神經(jīng)元細(xì)胞活力下降較野生型聚集體顯著(P<0.05)。向原代神經(jīng)元培養(yǎng)基中添加相應(yīng)α-Syn聚集體，培養(yǎng)至第1、3、5、7、14天，MTT法觀察細(xì)胞活力變化，結(jié)果顯示神經(jīng)元的細(xì)胞活力隨培養(yǎng)時(shí)間增加而降低(圖2)。向原代神經(jīng)元培養(yǎng)基分別添加終濃度為1、2、4、8、10 μmol/L的寡聚體，培養(yǎng)14 d，寡聚體組的細(xì)胞活力均隨劑量的增加而降低(圖3)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示PD組總凋亡細(xì)胞數(shù)比對(duì)照組多29.85%，比NS組多16.07%。

與對(duì)照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01;與WT-α-Syn單體組比較：3)P<0.05圖2 突變型α-Syn聚集體對(duì)神經(jīng)元活力下降的效應(yīng)具有時(shí)間依賴關(guān)系

圖3 突變型α-Syn聚集體對(duì)神經(jīng)元活力下降的效應(yīng)具有濃度依賴關(guān)系

2.3 α-Syn聚集體在原代神經(jīng)元中的分布 原代神經(jīng)元經(jīng)α-Syn單體或寡聚體處理后培養(yǎng)第14天，多聚甲醛固定，用α-Syn單抗進(jìn)行免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果顯示α-Syn單體和各寡聚體均可以進(jìn)入神經(jīng)元內(nèi)，并在胞體和胞質(zhì)均勻分布，見圖4。

2.4 α-Syn寡聚體在原代神經(jīng)元內(nèi)可形成淀粉樣變性斑塊 經(jīng)α-Syn寡聚體處理的原代神經(jīng)元培養(yǎng)14 d后，A53T和A30P組細(xì)胞內(nèi)可形成明顯硫磺素S染色陽(yáng)性的淀粉樣變性斑塊。對(duì)照組神經(jīng)元內(nèi)無(wú)陽(yáng)性染色。野生型α-Syn聚集體組神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)有較弱的硫磺素S染色，見圖5。

圖4 α-Syn聚集體在原代神經(jīng)元中的分布(標(biāo)尺=15 μm)

圖5 經(jīng)家族型α-Syn突變體聚集體處理的神經(jīng)元可形成硫磺素S染色陽(yáng)性的淀粉樣斑塊(標(biāo)尺=10 μm)

3 討 論

α-Syn的寡聚體被認(rèn)為是其毒性形式。在PD的發(fā)病機(jī)制研究中，導(dǎo)致α-Syn蛋白構(gòu)型異常并聚集的因素有很多。如基因突變型α-Syn，A30P和A53T在體外孵育較野生型α-Syn更易于形成寡聚體，A53T突變型可顯著加快纖維蛋白聚集物的形成〔5〕。α-Syn與微管蛋白也互為分子伴侶，通過(guò)促進(jìn)微管蛋白的聚合，α-Syn能夠加速微管的形成〔6〕。我們的研究證實(shí)α-Syn對(duì)原代神經(jīng)元早期的突起生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，并提高神經(jīng)元的存活率〔7〕，而家族型突變體由于與微管蛋白的伴侶關(guān)系異常失去這一作用。我們進(jìn)一步研究證實(shí)α-Syn的聚集體具有抑制神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的作用〔8〕。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示α-Syn家族型突變體A53T和A30P的聚集體可以進(jìn)入原代培養(yǎng)神經(jīng)元內(nèi)，從而產(chǎn)生神經(jīng)毒性，使神經(jīng)元活力下降。那么，A53T和A30P的聚集體神經(jīng)毒性的機(jī)制是什么？已有研究揭示，α-Syn聚集體主要通過(guò)增加脂質(zhì)雙分子層通透性，破壞突觸囊泡完整性以及細(xì)胞內(nèi)外離子的平衡〔9〕、抑制蛋白酶體降解途徑、影響細(xì)胞吞噬功能，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)等機(jī)制造成神經(jīng)元的損傷。另外，α-Syn聚集體影響胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸，研究報(bào)道在α-Syn寡聚體大鼠病理模型中，紋狀體和黑質(zhì)在神經(jīng)細(xì)胞丟失前，即有突觸傳遞和軸漿運(yùn)輸相關(guān)蛋白發(fā)生明顯變化，actin水平增加而α-微管蛋白水平降低〔10〕。我們的研究結(jié)果證實(shí)α-Syn家族型突變體A53T和A30P的聚集體在神經(jīng)元內(nèi)堆積形成硫黃素S染色陽(yáng)性的淀粉樣斑塊，其機(jī)制可能與其損傷胞內(nèi)微管系統(tǒng)，導(dǎo)致物質(zhì)運(yùn)輸紊亂有關(guān)。此研究結(jié)果為揭示α-Syn的生理功能以及在家族型PD的發(fā)病機(jī)制提供新的佐證，為預(yù)防和診斷PD提供了重要依據(jù)。

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〔2015-12-19修回〕

(編輯 徐 杰)

吉林省科技廳項(xiàng)目(20150101128JC)

1 北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室

蓋曉東(1962-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤分子病理學(xué)研究。

王 鵬(1977-)，男，博士，講師，主要從事人體解剖學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)理論研究。

R74

A

1005-9202(2016)23-5786-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.007