白 樺 張宏如 盧圣鋒 張皓然 顧一煌

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

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麥粒灸內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理對急性心肌缺血大鼠非特異性應(yīng)激的影響

白 樺 張宏如 盧圣鋒 張皓然 顧一煌

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

目的 觀察麥粒灸內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理對急性心肌缺血大鼠非特異性應(yīng)激的影響,探討麥粒灸防治急性心肌損傷的作用機(jī)制。方法 將36只SD大鼠隨機(jī)分為6組：空白對照組(K)、模型組(M)、麥粒灸1 d組(A)、麥粒灸2 d組(B)、麥粒灸3 d組(C)和麥粒灸5 d組(D)。采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支的方法制備急性心肌缺血模型。K組：不做任何處理；M組：不做任何干預(yù)，直接制備急性心肌缺血模型；麥粒灸各組灸內(nèi)關(guān)穴，1次/d，6壯/次，分別連續(xù)灸1 d、2 d、3 d、5 d，并于末次麥粒灸結(jié)束后制備急性心肌缺血模型。各組均于造模前后取血制備血清并分離心臟制備心臟切片行TTC染色。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定皮質(zhì)醇(Cort)含量，采用免疫抑制法檢測激酸肌酶同工酶(CK-MB)含量，ELISA檢測心肌肌鈣蛋白(cTnT)含量。結(jié)果 與K組相比，麥粒灸各組造模前血清Cort水平均增高(P<0.01)；M組、A組造模前血清CK-MB、cTnT升高，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，B、C、D組造模前血清CK-Mb、cTnT均升高(P<0.05)。與K組相比，各組造模后血清Cort水平均增高(P<0.01)，血清CK-MB均升高(P<0.01)，血清cTnT均升高(P<0.05)。與M組造模后相比，麥粒灸各組造模后血清Cort水平均增高(P<0.05)，A組造模后血清CK-MB、cTnT升高，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，B、C、D組造模后血清CK-MB、cTnT均升高(P<0.05)。A、B兩組心肌缺血面積比值與M組相比顯著降低(P<0.05)；E組心肌缺血面積比值與B組相比顯著升高(P<0.05)。結(jié)論 麥粒灸內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理對防治急性心肌缺血具有有效性，其機(jī)制與改變非特異性應(yīng)激反應(yīng)的程度有關(guān)。

麥粒灸；心肌缺血；應(yīng)激；心肌保護(hù)

針灸治療能夠有效地防治心血管疾病〔1，2〕，而艾灸防治冠心病的有效干預(yù)時間和機(jī)制研究卻鮮有報道。本實驗旨在研究麥粒灸內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理對急性心肌缺血大鼠是否具有保護(hù)作用，其發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制是否與改變非特異性應(yīng)激有關(guān)，并探討不同干預(yù)的時間和刺激量對應(yīng)激的影響是否具有差異性。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 采用雄性SD清潔級大鼠36只，體質(zhì)量(250±30)g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供〔SCXX(滬)2013-0016〕，所有大鼠自由飲食，晝夜規(guī)律12 h/12 h,保持(25±2)℃室溫和(50±5)%濕度，按照清潔級標(biāo)準(zhǔn)適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，實驗過程中對動物的處置符合關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見。應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將36只SD大鼠隨機(jī)分為6組：空白對照組(K)、模型組(M)、麥粒灸1 d組(A)、麥粒灸2 d組(B)、麥粒灸3 d組(C)和麥粒灸5 d組(D)，每組6只。

1.2 主要儀器與試劑 主要儀器有小動物呼吸機(jī)、臺式高速冷凍離心機(jī)、數(shù)碼相機(jī)(Nikon Lv-Tv，日本)。主要試劑有2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC,Sigma，USA)、磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.4)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)試劑盒(南京建成生物工程研究所)、心肌肌鈣蛋白(cTnT)定量檢測ELISA試劑盒(Abcam公司)、皮質(zhì)醇(Cort)定量檢測酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(Abcam公司)。

1.3 干預(yù)方法 K組：不做任何處理；M組：不做任何干預(yù)，直接制備急性心肌缺血模型；A組：麥粒灸內(nèi)關(guān)穴1次/d，6壯/次。后制備急性心肌缺血模型；B組：麥粒灸內(nèi)關(guān)穴，1次/d，6壯/次，連續(xù)2 d。然后于末次麥粒灸結(jié)束后制備急性心肌缺血模型。C、D兩組處理同B組。

1.4 標(biāo)本制備 各組造模前均行眼眶取血1.5 ml制備血清；心肌缺血24 h后行股動脈取血1.5 ml制備血清，分離心臟制備心臟切片并行TTC染色。

1.5 急性心肌缺血模型制備 根據(jù)文獻(xiàn)報道〔3〕的方法進(jìn)行心肌缺血模型的制備：用10%水合氯醛溶液0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，使其仰臥位于(37±3)℃的實驗板上，氣管插管，調(diào)呼吸機(jī)呼吸頻率為45～60次/min，潮氣量為1.0 ml/100 mg。接心電監(jiān)護(hù)儀，標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)監(jiān)測心電圖，沿著第4、5肋間打開胸腔，用6.0的絲線結(jié)扎左前降支(LAD)，寬度、深度均約2 mm。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：缺血時以肢體Ⅱ?qū)?lián)ST段弓背上抬、T波高聳以及心臟表面變蒼白或發(fā)紺顯示心肌缺血形成。

1.6 麥粒灸方法 ①穴位定位：大鼠內(nèi)關(guān)穴定位采用擬人比照法，按照《實驗針灸學(xué)》記載，前肢內(nèi)側(cè)、離腕關(guān)節(jié)約3 mm的尺橈骨縫間。②灸法操作：將艾絨做成麥粒大小的艾炷(5 mg/壯)，用麥粒灸灸內(nèi)關(guān)穴，6壯/次，1次/d，兩側(cè)穴位交替進(jìn)行。

1.7 檢測方法

1.7.1 TTC染色觀察心肌缺血面積 將分離的心臟放于1×PBS溶液中清洗干凈后，將心臟置于-20℃冰箱中冷凍20 min。待心臟冷凍固定后，將心臟置于切片器中，從心尖開始連續(xù)切1 mm的切片，一共5片。將5片心肌切片一起放入2%TTC-PBS溶液中37℃恒溫避光15 min，隨后放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h。采用數(shù)碼相機(jī)對每片心肌組織進(jìn)行拍照。采用IPWIN32分析軟件對切片進(jìn)行分析，TTC染色后梗死區(qū)為白色，未梗死區(qū)為磚紅色。以梗死區(qū)面積/心肌總面積百分比衡量心肌缺血程度。

1.7.2 大鼠血漿Cort、cTnT和CK-MB含量的測定 將采集的血液3 500 r/min離心10 min分離血清，移液槍分別吸取上清0.5 ml至Eppendorf離心管內(nèi)，-80℃冰箱凍存，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血漿cort含量，采用免疫抑制法檢測CK-MB含量，ELISA檢測cTnT含量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌缺血面積比較 A、B兩組心肌缺血面積比值(0.400±0.023、0.345±0.012)與M組相比顯著降低(0.548±0.067，P<0.05)；D組心肌缺血面積比值(0.575±0.05)與B組相比顯著升高(P<0.05)。C組心肌缺血面積比值(0.439±0.022)與M組無顯著差異(P>0.05)。見圖1。

心肌白色區(qū)域為缺血區(qū)，磚紅色區(qū)域為非缺血區(qū)圖1 各組心肌缺血面積直觀圖

2.2 麥粒灸對急性心肌缺血大鼠cTnT和CK-MB含量的影響 血清cTnT含量：造模前，B、C、D組較M組與K組均明顯升高(P<0.01，P<0.05)；C、D組較A、B組明顯升高(P<0.01)，D組較C組明顯升高(P<0.05)。造模后，與K組相比，M組明顯升高(P<0.05)，麥粒灸各組均明顯升高(P<0.01)；與M組相比，A、B、C、D組明顯升高(P<0.05，P<0.01)；與A組相比，B、C、D組明顯升高(P<0.01)；C、D組較B組明顯升高(P<0.01)；D組較C組明顯升高(P<0.01)。見表1。

組別造模前造模后K組30.74±1.5833.98±2.24M組33.31±3.6942.41±3.322)A組38.22±3.6953.28±5.841)3)B組45.12±5.591)3)66.34±7.191)3)4)C組58.50±8.361)3)4)5)82.92±5.701)3)4)5)D組67.58±9.181)3)4)5)6)94.58±7.231)3)4)5)6)

與K組比較:1)P<0.01，2)P<0.05；與M組比較:3)P<0.05；與A組比較:4)P<0.01；與B組比較:5)P<0.01；與C組比較:6)P<0.01

血清CK-MB含量：造模前，與K組相比，B、C、D組明顯升高(P<0.05，P<0.01)；B、C、D組較M組明顯升高(P<0.05，P<0.01)；C組較A組明顯升高(P<0.05)；D組較A組明顯升高(P<0.01)；D組較B、組明顯升高(P<0.01，P<0.05)。造模后，與K組相比，其余各組均明顯升高(P<0.01)；A、B、C、D組較M組均明顯升高(P<0.01)；C、D組較A、B組均明顯升高(P<0.01)；D組較C組明顯升高(P<0.01)。見表2。

2.3 麥粒灸對急性心肌缺血大鼠Cort含量的影響 造模前，與K組相比，A、B、C、D組造模前均明顯升高(P<0.01)；A、B、C、D組較M組升高(P<0.05，P<0.01)；D組較A、B組明顯升高(P<0.01，P<0.05)。造模后，與K組相比，A、B、C、D組均明顯升高(P<0.01)；B、C、D組較M組均明顯升高(P<0.01)；C、D組較A組明顯升高(P<0.01)；C、D組較B組明顯升高(P<0.05，P<0.01)；D組較C組明顯升高(P<0.01)。見表3。

組別造模前造模后K組4.95±0.225.01±0.31M組5.10±0.265.98±0.212)A組5.43±0.117.11±0.182)4)B組6.21±0.131)3)7.87±0.5382)4)C組6.78±0.332)4)5)8.85±0.722)4)6)7)D組8.02±1.472)4)5)7)10.94±0.362)4)6)7)8)

與K組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與M組比較:3)P<0.05，4)P<0.01；與A組比較:5)P<0.05，6)P<0.01；與B組比較:7)P<0.01；與C組比較:8)P<0.01；下表同

組別造模前造模后K組4.71±0.374.45±0.15M組4.52±0.186.99±0.40A組6.11±0.611)2)7.62±0.321)B組6.44±1.161)3)8.67±0.431)3)C組6.90±0.441)3)9.80±0.641)3)4)5)D組7.63±0.391)3)4)5)11.40±1.431)3)4)6)7)

3 討 論

艾灸可通過其溫通效應(yīng)發(fā)揮通調(diào)血脈、通閉止痛、通滯散結(jié)的作用。有實驗研究發(fā)現(xiàn)〔4〕艾灸具有雙向調(diào)節(jié)的作用，既可以針對血脈瘀滯的情況而使血供增加、改善血管舒縮功能、保護(hù)血管細(xì)胞，發(fā)揮通暢的作用；又可以在血脈失衡狀態(tài)的情況下，在生理范圍內(nèi)糾正其病理性亢進(jìn)或抑制的失調(diào)，發(fā)揮穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境等通調(diào)的作用?！渡窬慕?jīng)論》曰：“取艾之辛作炷，能通十二經(jīng)，入三陰，理氣血，治百病”。麥粒灸是用小如麥粒大小的艾炷在穴位上施灸的一種治療方法，可治療臨床各科慢性病與急性病，經(jīng)絡(luò)病與臟腑病等，凡寒熱虛實者皆可灸之，具有整體調(diào)節(jié)的優(yōu)勢〔5〕。許慧倩等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)，艾灸可通過促進(jìn)小鼠疲勞運動后心肌細(xì)胞中組蛋白乙?；窹300、CREB結(jié)合蛋白(CBP)的表達(dá)，減少大量運動后小鼠心肌細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮保護(hù)心臟的作用。

《靈樞·經(jīng)脈篇》載：“心主手厥陰之脈，起于胸中，出屬心包絡(luò)，是主脈所生病者、煩心、心痛?！闭f明心包經(jīng)與心臟在解剖、生理、病理等方面具有密切的聯(lián)系。而內(nèi)關(guān)穴絡(luò)屬手厥陰心包經(jīng)，為本經(jīng)絡(luò)穴，又是八脈交會穴之一，通于陰維脈，具有寬胸解郁、寧心安神、理氣止痛等功效，是治療心胸疾病的要穴，素有“心胸內(nèi)關(guān)謀”之說。研究發(fā)現(xiàn)缺血期持續(xù)電針“內(nèi)關(guān)”穴50 min可以調(diào)節(jié)心肌缺血再灌注大鼠內(nèi)皮素、心鈉素、血栓素等血管活性物質(zhì)，起到心肌保護(hù)的作用〔7〕。

應(yīng)激是指當(dāng)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)受到威脅時，機(jī)體對應(yīng)激原產(chǎn)生特異性和(或)非特異性的反應(yīng)，從而維持新的穩(wěn)態(tài)。其根據(jù)應(yīng)激源的不同可分為生理性應(yīng)激(適度應(yīng)激、良性應(yīng)激)和病理性應(yīng)激(過度應(yīng)激、不良應(yīng)激)〔8,9〕。當(dāng)冠心病發(fā)生時，會引起機(jī)體一系列的應(yīng)激反應(yīng)：心肌缺氧時會使心肌交感神經(jīng)末梢釋放兒茶酚胺，大量的兒茶酚胺通過強(qiáng)烈的收縮冠狀動脈，使心肌耗氧量增加進(jìn)而誘發(fā)心肌缺血壞死的發(fā)生；另外還會使下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)激素系統(tǒng)活性增強(qiáng)，引起全身的生理病理變化，產(chǎn)生病理性應(yīng)激。針灸預(yù)處理指預(yù)先采取針灸的方法對一些穴位進(jìn)行刺激，以提高機(jī)體的抵御與應(yīng)變的能力，并產(chǎn)生減少隨后疾病對機(jī)體組織器官損傷的作用〔10〕。有實驗研究〔11～19〕顯示針灸預(yù)處理對機(jī)體整體狀態(tài)及應(yīng)激激素、細(xì)胞凋亡等相關(guān)指標(biāo)具有良性調(diào)節(jié)的作用，使機(jī)體產(chǎn)生適度的應(yīng)激，提高機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的能力，激發(fā)身體的潛能，使機(jī)體處于一種預(yù)應(yīng)激的狀態(tài)，從而在預(yù)處理后的一段時間內(nèi)對抗來自機(jī)體內(nèi)部或外部的不良刺激，對機(jī)體的紊亂狀態(tài)做出良性的調(diào)整，達(dá)到防病治病的目的。

本結(jié)果顯示，麥粒灸內(nèi)關(guān)直接灼傷肌肉組織從而影響cTnT和CK-MB的含量。

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〔2016-11-02修回〕

(編輯 曹夢園)

Effect of wheat-moxibustion pretreatment on Neiguan on acute myocardial ischemia rats with nonspecific stress

BAI Hua,ZHANG Hong-Ru,LU Sheng-Feng,et al.

The No.2 Clinical Medical School,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,Jiangsu,China

Objective To explore the mechanism of wheat-moxibustion in the treatment and prevention of acute myocardial injury by observing the effect of wheat-moxibustion pretreatment on Neiguan on acute myocardial ischemia rats with nonspecific stress.Methods 36 SD rats were randomly divided into control (K),model (M),moxibustion groups of 1 day (A),2 days(B),3 days(C)and 5 days(D).Acute myocardial ischemia model was prepared by ligating the left anterior descending coronary artery.Rats in K group had no any processing.Rats in M group had no intervention.Rats in wheat moxibustion groups were treated once a day,6 strong/times,continuous moxibustion respectively 1 d,2 d,3 d and 5 d,and acute myocardial ischemia model was prepared at the end of moxibustion.Blood serum was prepared before and after making model each group and separated the heart for TTC staining.The content of cortisol (Cort)was determined by using enzyme-linked immunosorbent,the immune suppression method was adopted to detect the contents of CK-MB,ELISA was used to detect the content of cTnT.Results Compared with the K group,Cort levels of wheat moxibustion groups before building were increased (P<0.01);Before building,serum CK-MB,cTnT of group M and group A were increased,but there was no statistical significance (P>0.05).Before building,CK-MB and cTnT of B,C,D group were increased(P<0.05).Compared with K group,the Cort level and serum CK-MB were increased after building (P<0.01),cTnT were increased of model group and wheat moxibustion groups (P<0.05).After building,compared with the M group,the Cort levels of wheat moxibustion groups were increased (P<0.05);serum CK-MB,cTnT were increased I Group A,but there were no statistical significances (P>0.05);CK-MB,cTnT were increased in B,C,D group (P<0.05).Compared with M group,the myocardial ischemia area ratio of A and B group were decreased significantly (P<0.05);myocardial ischemia area ratio of E group was significantly increased compared with group B (P<0.05).Conclusions Wheat-moxibustion pretreatment on Neiguan is effective on prevention and treatment of acute myocardial ischemia and its mechanism is related to the degree of non-specific stress response.

Wheat-moxibustion;Myocardial ischemia;Stress;Myocardial preservation

國家自然科學(xué)基金項目(No.81674063)；江蘇省普通高?？蒲袆?chuàng)新計劃項目(No.KYLX16-1152)

顧一煌(1965-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事針灸推拿學(xué)研究。

白 樺(1992-)，女，在讀碩士，主要從事中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)研究。

R245.8

A

1005-9202(2016)23-5783-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.006