高硯春

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，四川 南充 637000)

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研究報告

miR-34a通過靶向調(diào)控Notch1表達影響乳腺癌細胞的增殖

高硯春

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，四川 南充 637000)

目的探討miR-34a通過靶向調(diào)控Notch1表達影響乳腺癌細胞的增殖。方法乳腺癌細胞MCF-7轉(zhuǎn)染miR-34a mimics及miR-34a NC，RT-PCR法檢測細胞中miR-34a表達，MTT，克隆形成實驗，Hoechst染色及流式細胞術(shù)分別檢測miR-34a mimics對乳腺癌MCF-7細胞活力、克隆能力、凋亡情況及細胞周期的影響；通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，western blot及RT-PCR檢測Notch1是否是miR-34a的下游靶基因。結(jié)果與miR-34a NC比較，miR-34 mimics組中miR-34a表達量上調(diào)，細胞活力降低(P<0.01)，細胞凋亡率顯著提高(P<0.01)，細胞克隆數(shù)目減少(P<0.01)，細胞周期阻滯在G1期(P<0.01)，Notch1蛋白及mRNA表達量都顯著降低(P<0.01)，同時熒光素酶報告基因?qū)嶒炓沧C實miR-34a mimics能與報告基因結(jié)合。結(jié)論miR-34a mimics能通過負性調(diào)控Notch1表達，從而顯著的抑制MCF-7乳腺癌細胞增值，并誘導(dǎo)細胞凋亡。

miR-34a；Notch1；乳腺癌細胞MCF-7；增殖

乳腺癌是女性較容易患的惡性腫瘤之一，是導(dǎo)致女性癌癥死亡的第二大原因，在我國及全世界范圍內(nèi)發(fā)病率都呈上升趨勢。盡管近年來放療、化療以及生物治療技術(shù)的不斷發(fā)展，使得乳腺癌患者的預(yù)后及生存期獲得了很大改善，但是乳腺癌復(fù)發(fā)率及難治率仍居高不下[1]。因此尋找有效的診斷及治療方法是乳腺癌研究一直以來的關(guān)注點。Notch是1917年美國著名遺傳學(xué)家Thomas在果蠅缺口翅膀中發(fā)現(xiàn)并命名的，并于1980年克隆成功。Notch包括配體，受體及下游效應(yīng)分子。其中受體包括4種，分別為Notch1，Notch2，Notch3，Notch4。研究顯示Notch信號通路在包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中高表達，特別是Notch1[2-3]。Notch1在乳腺癌中高表達[4]，沉默Notch1表達能顯著的抑制MCF-7細胞增殖，并誘導(dǎo)細胞凋亡[5]。同時研究也表明Notch1的高表達與miRNA的異常表達密切相關(guān)[6-8]，從而提示miRNA可能通過調(diào)控Notch1表達從而影響腫瘤的增殖與凋亡等生物學(xué)行為。

miRNA是一類高度保守的非編碼內(nèi)源性RNA分子，長度大約為19-23 nt，能通過結(jié)合于其下游靶基因3′端非編碼區(qū)，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，進而影響細胞的生物學(xué)行為。研究表明miR-34a能與Notch1報告基因結(jié)合，從而影響結(jié)腸癌SW480細胞，膀胱癌細胞T24細胞的增殖作用[7-8]。但對于在乳腺癌中miR-34a是否能夠通過靶向Notch1表達從而影響MCF-7細胞的增殖還未見報道，所以本研究將對此展開研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

人乳腺癌細胞MCF-7購于中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.1.2 試劑

兔抗Notch1多克隆抗體(美國Abcam公司)；四甲基偶氮唑鹽(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；小鼠抗GAPDH單克隆抗體，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)，BCA試劑盒，Hoechst 33258染色試劑盒，細胞周期檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；LipofectamineTM2000，trizol試劑盒，一步法RT-PCR試劑盒(大連寶生生物有限公司)；野生型載體pmir-RB-ReportTM Notch1 3’UTR-Wt，突變型載體pmir-RB-ReportTM 3’UTR-Mut，miR-34a mimics及miR-34a NC(廣州市銳博生物科技有限公司)。

1.1.3 儀器

迷你雙垂直電泳儀，迷你轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器廠)；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；TS100倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)；SMA2000型微量紫外分光光度計(美國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉(zhuǎn)染

當MCF-7細胞匯合度達到50%左右時候，利用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒分別轉(zhuǎn)染miR34a NC、miR-34a mimics，6 h以后換成含10%血清的DMEM培養(yǎng)基；37℃，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。應(yīng)用RT-PCR檢測細胞中miR-34a的表達。

12.2 MTT法檢測細胞活力

將MCF-7細胞接種于96孔板，按“1.2.1”進行轉(zhuǎn)染。48 h后，加入20 μL終濃度為5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，將上清液舍棄，并每孔加入150 μL的二甲基亞砜，震蕩使結(jié)晶物充分溶解，于酶標儀560 nm處測OD值，OD值即代表細胞活力。

1.2.3 集落形成實驗

將MCF-7細胞接種于96孔板，按“1.2.1”進行轉(zhuǎn)染，48 h后，用含10%甲醛和0.1%結(jié)晶紫染液固定染色，室溫中放置30 min。輕輕甩去染色液，用蒸餾水洗滌各孔，將培養(yǎng)板倒置于吸水紙上吸干水分，然后拍照分析。

1.2.4 Hoechst染色檢測細胞凋亡

將MCF-7細胞接種于6孔板，按“1.2.1”進行轉(zhuǎn)染。48 h后用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集細胞，后按照Hoechst 33258染色試劑盒說明書進行操作，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次，加入Hoechst 33258染色液避光染色15 min，PBS洗滌3次，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞周期

將MCF-7細胞接種于6孔板，按“1.2.1”進行轉(zhuǎn)染。48 h后，按細胞周期檢測試劑盒說明書進行檢測：用不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞，離心，并重懸，接著加入5 μL終濃度為10 mg/mL 的Rnase，37℃孵育1 h，再加入 碘化丙啶染液，室溫下避光染色 30 min，用流式細胞儀進行細胞周期檢測分析。

1.2.6 RT-PCR檢測細胞中miR-34a及Notch1 mRNA表達

參考Trizol試劑盒使用說明書提取總RNA，并用微量紫外分光光度計檢測RNA的純度，通過一步法RT-PCR試劑盒將逆轉(zhuǎn)錄RNA，并進行PCR擴增，最后將擴增產(chǎn)物用于2%的瓊脂糖膠電泳。引物如下，Notch1上游引物：5′-GTCAACGCCGTAGA TGACCT-3′，下游引物：5′-TCTCCTCCCTGTTGTTC TGC-3′；GADPH上游引物：5′-AGCCACATCGCTC AGACA-3′，下游引物：5′-TGGACTCCACGACGTACT-3′。引物分別加入25 μL PCR反應(yīng)體系中，反應(yīng)條件為94℃變性45 s，59℃復(fù)性45 s，72℃延伸60 s，共35個循環(huán)。

1.2.7 Western blot檢測細胞中Notch1蛋白表達

將MCF-7細胞接種于6孔板，按“1.2.1”進行轉(zhuǎn)染，48 h收集細胞，加入細胞裂解液，裂解30 min后，4℃，10000 r/min離心10 min，吸取上清，即可獲得總蛋白。采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白變性，上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳，后濕法轉(zhuǎn)膜30 min。將膜浸入一抗溶液(兔抗Notch1多克隆抗體，小鼠抗GAPDH單克隆抗體，稀釋比例：1:100)孵育，4℃過夜；次日二抗(辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)，稀釋比例：1:200)室溫孵育1 h。并在膜上滴加ECL曝光液，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantity one”軟件分析各抗體條帶灰度值。

1.2.8 熒光素酶報告基因表達分析

miR-34a及Notch1重組載體共轉(zhuǎn)染到MCF-7細胞中。分組如下：miR-34a mimics+Wt Notch1，miR-34a NC+ Wt Notch1，miR-34a mimics+Mut Notch1，miR-34a NC+ Mut Notch1。應(yīng)用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測轉(zhuǎn)染好的熒光素酶活性，計算公式：相對熒光值=螢火蟲熒光素梅熒光值/海腎熒光素梅熒光值。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-34a轉(zhuǎn)染效果的檢測

如圖1所示，與miR-34a組比較，miR-34a mimics組中miR-34a表達量顯著提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

注：與miR-34a NC組比較，**P<0.01。

2.2 miR-34a mimics對MCF-7細胞活力及克隆數(shù)目的影響

注：與miR-34a NC組比較，**P<0.01。

注：與miR-34a NC組比較，**P<0.01。

如圖2 MTT結(jié)果所示，與miR-34a NC組比較，miR-34a mimics組中細胞活力顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。如圖3細胞克隆實驗結(jié)果所示，與miR-34a NC組(128.57±10.69)比較，miR-34a mimics組(34.59±3.46)中細胞克隆數(shù)目顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 miR-34a mimics對MCF-7細胞周期的影響

如圖4 流式細胞術(shù)結(jié)果所示，與miR-34a NC組比較，miR-34a mimics組中細胞周期G1期顯著延長，S及G2期縮短，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明miR-34a mimics能使細胞周期顯著阻滯在G1期。

圖4 miR-34a mimics對MCF-7細胞周期的影響Fig.4 Effect of miR-34a mimics on MCF-7 cell viability

表1 miR-34a mimics對MCF-7細胞周期的影響Tab.1 Effect of miR-34a mimics on MCF-7 cell viability

2.4 miR-34a mimics對MCF-7細胞凋亡情況的影響

如圖5 Hoecsht染色結(jié)果所示，與miR-34a NC組(3.56±0.36)比較，miR-34a mimics組(36.48±3.65)細胞凋亡率顯著提高，差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖5 miR-34a mimics對MCF-7細胞凋亡情況的影響(×20)Fig.5 Effect of miR-34a mimics on MCF-7cell apoptosis (×20)

2.4 熒光素酶報告基因表達分析

將miR-34a mimics、miR-34a NC及野生型載體pmir-RB-ReportTM Notch1 3’UTR-Wt、及突變型載體pmir-RB-ReportTM Notch1 3’UTR-Mut轉(zhuǎn)入MCF-7細胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-34a mimics與野生型載體pmir-RB-ReportTM Notch1 3’UTR-Wt共轉(zhuǎn)染組的熒光信號強度明顯弱于其它轉(zhuǎn)染組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。而對于突變型載體pmir-RB-ReportTM Notch1 3’UTR-Mut來說，各組間熒光強度無任何差別(P>0.05)，說明Notch1是miR-34a下游靶基因(圖6)。

注：與miR-34a NC組比較，**P<0.01。

2.5 miR-34a mimics對MCF-7細胞中Notch1蛋白及mRNA表達量的影響

如圖7所示，與miR-34a NC組比較，miR-34a mimics組中Notch1蛋白及mRNA表達量顯著降低(P<0.05)。

注：與miR-34a NC組比較，**P<0.01。

3 討論

miRNA具有癌基因或抑癌基因的作用，能夠結(jié)合于靶基因mRNA的3’-UTR區(qū)域，阻遏靶基因的翻譯，從而抑制靶基因表達，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在腫瘤的增殖，凋亡，侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用[9-10]。miR-34家族是一類高度保守的miRNA，廣泛存在于節(jié)肢動物及哺乳動物中，包括三個同源基因，即miR-34a，miR-34b，miR-34c。其中miR-34a是miR-34基因突變的結(jié)果，染色體定位于1p36.23，且能夠廣泛存在肺以外的所有正常組織中，而miR-34b及miR-34c是miR-34串聯(lián)形成的，在肺以外的正常組織中表達量有限[11]。研究認為miR-34家族是具有抑癌作用的miRNA，miR-34家族在包括乳腺癌在內(nèi)的大多數(shù)腫瘤組織中低表達，特別是miR-34a，miR-34a的異常表達可作為乳腺癌患者患瘤風(fēng)險，診斷，預(yù)后的標志[11]。而且miR-34a表達量上調(diào)后對膀胱癌細胞，結(jié)腸癌細胞的增殖具有顯著的影響[7-8]。因此我們推測miR-34a對乳腺癌細胞的增殖凋亡等生物學(xué)行為也具有顯著的影響作用，所以本研究在此推論上，首先通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-34a mimics及miR-34a NC，RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后MCF-7細胞中miR-34a的表達，結(jié)果表明miR-34 mimics轉(zhuǎn)染成功，接著通過MTT法及克隆實驗證實了miR-34a mimics能顯著的降低MCF-7細胞活力及細胞克隆數(shù)目，說明miR-34a mimics對MCF細胞增殖具有顯著的抑制作用。Hoechst染色結(jié)果也證實了結(jié)論，也與Nie等[12]，Zhao等[13]研究miR-34a mimics在食管鱗狀細胞癌細胞，骨肉瘤細胞中的作用一致。另外腫瘤細胞的惡性增殖，說明了腫瘤細胞周期的紊亂及不可控，且大多數(shù)抗癌藥物也通過調(diào)控細胞周期的變化來發(fā)揮其療效的，所以本研究接著采用流式細胞術(shù)檢測miR-34a mimics對MCF-7細胞周期的影響，結(jié)果表明miR-34a mimics能延長MCF-7細胞周期，使細胞周期阻滯在G1期，并縮短G2和M期，從而阻斷了細胞的有絲分裂及DNA復(fù)制，進一步的說明了miR-34a mimics對MCF細胞增殖的抑制作用，與Ghawanmeh等[14]研究觀點一致。

miRNA對細胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用基本都是基于其對下游靶基因的調(diào)控作用，miR-34a也不例外。有學(xué)者通過生物軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)Notch1可能是miR-34a的下游靶基因之一，且此基因與細胞增殖密切相關(guān)[7, 8]。Notch1是1991年在人類T淋巴細胞白血病中被鑒定出來，并被證實與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Norch1是由RAM結(jié)構(gòu)區(qū)，6個與細胞周期相關(guān)的重復(fù)區(qū)，2個細胞核定位信號，富含谷氨酸區(qū)及PEST序列構(gòu)成的。研究顯示Notch1與腫瘤的生長，分化，凋亡密切相關(guān)[15]。而且本研究的雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實了miR-34a mimics能顯著的與Notch1的3’端結(jié)合，接著western blot及RT-PCR也證實了較miR-34a NC比較，miR-34a mimics組中Notch1蛋白及mRNA表達量均顯著下調(diào)，從而說明了Notch1是miR-34a的下游靶基因，而且干擾Notch1表達能顯著的抑制MCF-7增殖[5]，進而得出miR-34a mimics通過靶向下調(diào)Notch1表達，從而抑制MCF細胞的增殖。

綜上所述，miR-34a mimics能通過靶向負調(diào)控Notch1表達，誘導(dǎo)乳腺癌細胞MCF-7凋亡，并抑制細胞增殖，使細胞周期阻滯在G1期。此外研究還證實p53基因能與miR-34a啟動子結(jié)合，從而激活miR-34a的轉(zhuǎn)錄，而在腫瘤組織中p53發(fā)生突變，導(dǎo)致miR-34a的轉(zhuǎn)錄受到抑制，呈低表達狀態(tài)[16]。而且另有大量研究表明p53與Notch1之間也存在著直接的聯(lián)系[17]。從而提示了MCF-7細胞中miR-34a對于Notch1的調(diào)控作用可能與p53信號通路有關(guān)，將是本課題組將來的研究方向。

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Inhibitory effect of miR-34a on the proliferation of breast cancer cell by targeting Notch1

GAO Yan-chun

(Department of thyroid and breast surgery of the Affiliated Hospital of Chuanbei Medical College,Sichuan Nanchong, 637000, China)

Objective To explore inhibitory effect of miR-34a on the proliferation of breast cancer cell MCF-7 by targeting Notch1. Methods MCF-7 cells were transferred with miR-34a mimics and miR-34a NC. The expression of miR-34a in MCF-7 cell was examed by RT-PCR. The cell viability was detected by MTT. The cell apoptosis was examed by Hoechst staining. Cell cycle was detected by flow cytometry. Western blot, RT-PCR and dual luciferase reporter gene assay was to detect whether Notch1 was a downstream target gene of miR-34a. Results Compared with miR-34a NC group, the expression of miR-34a was up-regulated, the cell viability was decreased, cell apoptotic rate was increased, cell cycle was arrested in the G1 phase, the expression of Notch1 protein and mRNA was down-regulated (P<0.01). Conclusion miR-34a mimics inhibited MCF-7 cell proliferation and induced cell apoptosis via targeting regulation expression of Notch1.

miR-34a; Notch1; breast cancer cell MCF-7; proliferation

高硯春(1976-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：乳腺癌綜合治療。E-mail： 164771624@qq.com。

R-332

A

1671-7856(2016)11-0055-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.11.010

2016-07-28