徐建峰,容維中,王 珂,郭海龍

(甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?744000)

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早勝牛及其雜交類(lèi)群GH基因遺傳多態(tài)性研究

徐建峰,容維中*,王 珂,郭海龍

(甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?744000)

[目的]為深入探究早勝牛的分子遺傳特性及潛力，重視和保護(hù)地方優(yōu)秀種質(zhì)資源，加快甘肅省肉牛新品種選育。[方法]以GH 基因作為影響早勝牛及其雜交類(lèi)群生長(zhǎng)發(fā)育性狀的候選基因，采用PCR-SSCP方法和DNA測(cè)序技術(shù)分析了GH基因Exon2和Exon5兩個(gè)位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性。[結(jié)果]表明：GH基因存在遺傳多態(tài)性，其中，Exon2位點(diǎn)檢測(cè)到C1059T和C1150A 兩處SNPs，產(chǎn)生了AA、AB和BB 三種基因型；Exon5位點(diǎn)檢測(cè)到C2258T、C2277T和 A2291C三處SNPs，產(chǎn)生了CC和CD兩種基因型。[結(jié)論]為開(kāi)展早勝牛GH基因遺傳多態(tài)性與其生產(chǎn)性能的相關(guān)性研究提供了一定的理論依據(jù)。

早勝牛；GH基因；PCR-SSCP；品種；選育

早勝牛是在隴東早勝塬等溝壑山區(qū)特有的黃土高原自然環(huán)境下，引入秦川牛經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期馴化和雜交選育形成的地方群體，具有培育現(xiàn)代肉牛的潛力和生產(chǎn)以沉積脂肪為特點(diǎn)的優(yōu)質(zhì)高檔牛肉的潛質(zhì)[1]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，從分子水平上探索物種的遺傳多樣性，已成為群體遺傳學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)研究的一個(gè)重要領(lǐng)域，也使得在人為選留地方群體優(yōu)良特性的基礎(chǔ)上，應(yīng)用分子輔助標(biāo)記選擇技術(shù)培育以肉用性狀為主的肉牛新類(lèi)群(品種)成為可能。部分研究[2-5]表明，生長(zhǎng)激素基因(growth hormone，GH)是動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育和代謝的主要調(diào)節(jié)因子，具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成及骨骼肌肉生長(zhǎng)、減少脂肪沉積、提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度和參與動(dòng)物免疫及泌乳等功能。

本研究以早勝牛及其雜交類(lèi)群為試驗(yàn)對(duì)象，以GH基因作為影響生長(zhǎng)發(fā)育性狀的候選基因，采用 PCR-SSCP 技術(shù)對(duì)GH基因外顯子2及外顯子5進(jìn)行多態(tài)性分析，旨在深入探究早勝牛的分子遺傳特性及潛力，為重視和保護(hù)地方優(yōu)秀種質(zhì)資源，加快我省肉牛新品種選育提供分子水平上的依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血樣的采集 在慶陽(yáng)及平?jīng)鍪幸?guī)模養(yǎng)殖企業(yè)及散養(yǎng)戶(hù)，采集早勝牛及其雜種牛血樣240份，每份血樣7 mL，低溫條件下帶回實(shí)驗(yàn)室，于-20℃超低溫冰箱保存。

1.1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 參照已發(fā)表在Gen Bank上的GH基因核苷酸序列(登錄號(hào)：M57764)，采用Prime 5.0 軟件設(shè)計(jì)2對(duì)引物，由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行合成，引物信息見(jiàn)表1。

1.1.3 主要試劑 Taq Master Mix反應(yīng)混合液、GoldView (GV)染色劑、Tris-HC1緩沖液、N,N-二亞甲雙丙烯酰胺、乙二胺四乙酸二鈉等試劑均購(gòu)自北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司，血液DNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)megabiotek公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用D3471型血液DNA提取試劑盒對(duì)牛冷凍血液DNA進(jìn)行提取，然后用1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度和分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/OD280值。

表1 引物信息

1.2.2 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系：總體積50 μL，其中2×Taq Master Mix 混合液25 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各2 μL，DNA模板(100 ng/μL)2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)條件:：94℃預(yù)變性5 min，32個(gè)循環(huán)(GH-2：94℃變性5 min，60℃退火50 sec，72℃延伸50 sec；GH-5：94℃變性30 sec，51℃退火40 sec，72℃延伸50 sec)，72℃延伸8 min，4℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.2.3 SSCP檢測(cè)與測(cè)序 取2 μLPCR產(chǎn)物與6 μL變性緩沖液(98%甲酰胺、10 mmol/L EDTA、0.025%溴酚蘭、0.025%二甲苯青)混勻，98℃變性10 min后置于冰水浴上5 min，然后分別上樣于不同濃度(GH-2為8%、GH-5為12%)和交聯(lián)度為29:1的非變性聚丙烯酰胺凝膠，在4℃、220 v的條件下預(yù)電泳20 min，然后將電泳槽接通電源后放在冰箱中(4℃、140v)恒溫恒壓電泳12～18h。電泳結(jié)束后，用優(yōu)化后的銀染法進(jìn)行染色，根據(jù)染色后條帶位置及數(shù)量判定不同基因型，并將不同基因型個(gè)體送至北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行純化和測(cè)序。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 利用PopGen32軟件計(jì)算基因型頻率、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)(Ne)、純合度(Ho)、雜合度(He)，利用PIC CALC V0.6軟件計(jì)算多態(tài)性信息含量(PIC)。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA提取

采用試劑盒法提取的DNA條帶清晰，無(wú)拖尾現(xiàn)象(圖1)。經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)，OD260/OD280值為1.7，純度較好。

圖1 血液基因組 DNA 凝膠電泳圖

2.2 PCR擴(kuò)增

對(duì)240頭早勝牛及其雜交類(lèi)群GH基因第2外顯子及第5外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖2、圖3)。結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段與目的片段大小一致，條帶特異性良好，可以進(jìn)行SSCP分析。

圖2 Exon2 位點(diǎn) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物圖3 Exon5 位點(diǎn) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 SSCP多態(tài)性檢測(cè)

經(jīng)PCR-SSCP檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)GH基因Exon2位點(diǎn)及Exon5位點(diǎn)均存在遺傳多態(tài)性，其中，Exon2位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)C1059T和C1150A 兩處SNPs(圖4)，產(chǎn)生了A、B 兩個(gè)等位基因和AA、BB、AB三種基因型(圖5)。Exon5位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)C2258T、C2277T、 A2291C三處SNPs(圖6)，產(chǎn)生了C、D兩個(gè)等位基因和CC、CD兩種基因型(圖7)。

Exon2位點(diǎn)，早勝牛及其雜交類(lèi)群體中等位基因A的基因頻率高于等位基因B，為優(yōu)勢(shì)等位基因；基因型頻率從大到小依次為AA、BB和AB型，AA型為優(yōu)勢(shì)等位基因型。該群體純合度接近1，趨于純合狀態(tài)；PIC<0.25，屬于低度多態(tài)(表2)。

Exon5位點(diǎn)，早勝牛及其雜交類(lèi)群體中C為優(yōu)勢(shì)等位基因，CD型為優(yōu)勢(shì)等位基因型。該群體純合度較高，且0.25

圖4 Exon2 位點(diǎn)不同基因型測(cè)序圖

圖5 Exon2 位點(diǎn) PCR-SSCP 檢測(cè)結(jié)果

圖6 Exon5 位點(diǎn)不同基因型測(cè)序圖

圖7 Exon5 位點(diǎn) PCR-SSCP 檢測(cè)結(jié)果

表2 GH基因Exon2位點(diǎn)遺傳多態(tài)分析

表3 GH基因Exon5位點(diǎn)遺傳多態(tài)分析

3 分析與討論

本研究采PCR-SSCP和DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)早勝牛及其雜交類(lèi)群GH基因不同位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)GH基因Exon2位點(diǎn)上存在兩處SNPs和3種基因型，這與王利明等[6]研究發(fā)現(xiàn)的信陽(yáng)水牛第2外顯子存在1處SNP(G413A)和產(chǎn)生了CC、CD和DD三種基因型的結(jié)果類(lèi)似。Exon5位點(diǎn)上檢測(cè)到三處SNPs，這與薛愷等[7]在南陽(yáng)牛中發(fā)現(xiàn)的研究結(jié)果一致，除以上突變外，高雪等[8]、郝靈慧等[9]還在2141bp、2386bp處檢測(cè)到C/G、T/C的替換，這表明在牛GH 基因第5外顯子多態(tài)性豐富，屬于高突變區(qū)。此外，高雪等[10]在第5外顯子檢測(cè)到3種基因型，而本研究發(fā)現(xiàn)兩種基因型，這可能與牛種不同和樣本量采集范圍有關(guān)，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

群體多態(tài)信息含量(PIC)與群體雜合度(He)都是反映群體遺傳多樣性的指標(biāo)，其數(shù)值的大小表明群體中遺傳變異水平的高低。本研究發(fā)現(xiàn)，GH基因Exon2和Exon5位點(diǎn)分別呈現(xiàn)出低度多態(tài)和中度多態(tài)，表明GH基因Exon5位點(diǎn)，早勝牛純合度較高，群體遺傳變異較大、可選擇的空間很大，適合作為經(jīng)濟(jì)性狀與基因型間連鎖分析的候選標(biāo)記，以便為早勝牛遺傳資源的保護(hù)和肉用潛力的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

[1] 甘肅省畜牧廳主編.甘肅省畜禽品種志[M].蘭州:甘肅人民出版社,1986.

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Polymorphism Analysis of Growth Hormone Gene(GH) in Zaosheng Cattle and Hybrid Groups

XU Jian-feng, RONG Wei-zhong, WANG Ke, GUO Hai-long

(AnimalhusbandryandVeterinaryResearchInstituteinGansuProvince,PingLiang,Gansu744000)

GH gene were used as candidate gene which was influenced with growth and development traits in zaosheng cattle and hybrid groups. PCR-SSCP and DNA sequencing technologies were conducted to detect their single nucleotide polymorphism. The results showed that there were two SNPs (C1059T、C1150A) and three genotypes in the exon 2 of GH gene, and three SNPs (C2258T、C2277T、A2291C) and two genotypes in the exon 5 of GH gene. Therefore, the study result provided certain theoretical basis with association study of genetic polymorphism of GH gene and production performance in.

Zaosheng cattle; GH gene; RCP-SSCP; breed; breeding

2015-12-21修改日期:2015-12-29

甘肅省技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)專(zhuān)項(xiàng)計(jì)劃“分子遺傳標(biāo)記在早勝牛遺傳多樣性研究中的應(yīng)用” (項(xiàng)目編號(hào)：1207TCYL016)。

徐建峰(1981-)，男，漢，甘肅天水人，助理研究員，E-mail：710401384@qq.com。

容維中(1965-)，男，漢，甘肅平?jīng)鋈?，副研究員，研究方向?yàn)閯?dòng)物營(yíng)養(yǎng)及牛羊繁殖技術(shù)。

S823.2

A

1001-9111(2016)01-0006-04