張清健 宋 革 祝曉麗 譚玉梅 鄭煒煒

國家衛(wèi)生計生委男性生殖與遺傳重點實驗室，廣東省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究所生殖中心（廣州 510600）

梯度密度離心中離心力、時間和梯度液體積對精子回收率和受精潛能的影響*

張清健 宋 革 祝曉麗 譚玉梅 鄭煒煒

國家衛(wèi)生計生委男性生殖與遺傳重點實驗室，廣東省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究所生殖中心（廣州 510600）

目的 探究梯度密度離心中離心力、時間和梯度液體積對前向運動精子回收率和受精潛能的影響。方法 實驗分新鮮精液組和冷凍精液組各30例。每例精液充分混勻后，平均分為4份，進(jìn)行下列各組實驗：（1）組1為80%和40%的梯度離心液各0.5mL， 300×g，離心20min；（2） 組2為80%和40%的梯度離心液各1.0mL，300×g，離心20min；（3）組3為80%和40%的梯度離心液各1.0mL，1 200×g，離心5min；（4）組4為80%和40%的梯度離心液各0.5mL，1 200×g，離心5min。分別檢測處理前后每組精液濃度、前向運動精子百分率、正常形態(tài)率以及精子DNA碎片率，以分析離心力、時間和梯度液體積對精子前向運動精子回收率和受精潛能的影響。結(jié)果無論是新鮮精液，還是冷凍精液，組1、組3和組4前向運動精子的回收率和精子的正常形態(tài)率以及精子的DNA碎片率與組2比較無明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論 將現(xiàn)行的300×g，離心20min的離心方法，改為1 200×g，離心5min，梯度離心液體積從1.0mL降低至0.5mL，并不顯著影響精子正常形態(tài)率、前向運動精子的回收率和精子的受精潛能，是可行的。

離心法, 梯密度; 精子; 受精

在輔助生育技術(shù)中，技術(shù)人員要通過相應(yīng)的精子分離技術(shù)除去不活動的、形態(tài)不正常、不成熟的精子以及精漿，獲得高質(zhì)量的精子進(jìn)行體外受精。精子分離技術(shù)的效率通常用精子絕對數(shù)目、活動精子總數(shù)或形態(tài)學(xué)正常的活動精子回收率來表示。非連續(xù)梯度密度法因具有較高的前向運動精子回收率，是臨床最常用的技術(shù)方法[1]。目前生殖醫(yī)學(xué)實驗室常用的非連續(xù)梯度密度離心方法是40%和80%梯度液各1mL，300×g，離心15～30min[2]，此方法缺點是離心時間太長。在精液處理過程中，還有患者取精和精液液化時間等不確定性因素，當(dāng)標(biāo)本量多時，沒有足夠的時間一次只處理一份精液，通常做法是幾份精液標(biāo)本同時處理。這種做法雖提高了工作效率，但埋下了精液之間相互混淆的隱患，導(dǎo)致產(chǎn)生嚴(yán)重的醫(yī)療糾紛。

本研究的目的是：在不影響前向運動精子的回收率和回收精子質(zhì)量的前提下，探索通過降低梯度離心液體積、提高離心力而達(dá)到縮短離心時間的可行性。

對象與方法

一、研究對象

精液標(biāo)本來源于60例成年男性，平均年齡（23.62±3.1）歲，無傳染性疾病。

二、方法

（一） 精液的收集與分析

男性60例，禁欲3～7d，手淫法采集精液于廣口無菌無毒容器中，置室溫充分液化混勻后，分別檢測精液量、精子濃度、前向運動精子百分率、精子正常形態(tài)率和精子DNA碎片率。

（二）精液的冷凍

精液冷凍方法：將冷凍保護(hù)液置室溫平衡，待精液完全液化后，將一份精子冷凍液一滴一滴地加進(jìn)一份液化好的精液，然后讓混合物平衡3min；將混合物分裝至冷凍管內(nèi)，冷凍管做好標(biāo)記，然后將其固定在鋁架上，置4℃冰箱15min；迅速將鋁架轉(zhuǎn)移至距液氮面10～20 cm處放置15min，然后投入液氮保存。

（三）冷凍精液的復(fù)蘇及精液常規(guī)分析

把冷凍管從液氮中取出，放入37℃水浴箱解凍5分鐘。混勻樣本后取10μL復(fù)蘇精液置顯微鏡下進(jìn)行濃度、精子活動率等精液常規(guī)分析。

（四）用Diffquik染色法進(jìn)行精子形態(tài)學(xué)分析

依照世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室書冊第5版[3]，精子液化混勻后分別涂片，自然風(fēng)干后采用 Diff-Quik 快速染色法染色，在光學(xué)顯微鏡油鏡（×1 000）下，每片讀取 200個精子，計算正常形態(tài)率。

（五）精子染色質(zhì)擴(kuò)散法，用于檢測精子核DNA完整性

用精子稀釋液將精子密度調(diào)至5～10×106/mL，吸取60μL上述稀釋的精子溶液到140μL低熔點瓊脂糖溶液的EP管中混勻，取出30μL滴加到水平位置的預(yù)處理載玻片上，將載玻片置于2～8℃冰箱4min，再將預(yù)處理載玻片浸入變性液中7min。取出載玻片，在蒸餾水中浸泡5s；再將載玻片浸入裂解液中準(zhǔn)確反應(yīng)20min。反應(yīng)畢，將預(yù)處理載破片浸入洗滌液3min，以洗掉裂解液。然后將其取出依次浸入70%、90%、無水乙醇溶液中脫水各2min。讓預(yù)處理載玻片自然晾干。晾干后的預(yù)處理載玻片用瑞氏染色劑進(jìn)行染色5min。將染色后的載玻片以蒸餾水輕輕沖洗10～15次以除去多余的染色劑。風(fēng)干載玻片，待完全干燥后在常規(guī)顯微鏡下觀察。

（六） 梯度離心實驗

新鮮精液組和冷凍精液組各30例，每例精液充分混勻后，平均分為4份，進(jìn)行下列各組實驗：（1）組1為80%和40%的梯度離心液各0.5mL，300×g，離心20min；（2）組2為80%和40%的梯度離心液各1.0mL，300×g，離心20min；（3）組3為80%和40%的梯度離心液各1.0mL，1200×g，離心5min；（4）組4為 80%和40%的梯度離心液各0.5mL，1200×g，離心5min。各組梯度離心后，棄梯度液，加入3 mL精子洗滌液，300×g，離心5min，棄上層精子洗滌液，分別加入0.5 mL精子洗滌液混勻，進(jìn)行精子濃度、前向精子百分率、精子正常形態(tài)率和精子DNA碎片率的檢測。

常規(guī)非連續(xù)梯度密度離心方法是40%和80%梯度液各1mL，300×g，離心15～30min[2]，為此我們將組2設(shè)為常規(guī)方案組；組1是在組2的基礎(chǔ)上僅將梯度液從1.0mL改為0.5mL，以此來分析降低梯度離心液的體積對精子回收率和受精潛能的影響；組3是在組2的基礎(chǔ)上改變了離心力和離心時間，以此分析增加離心力的同時縮短離心時間對精子的回收率和受精潛能的影響。組4既改變梯度液的體積，又改變了離心力和離心時間，以此分析梯度液的體積、離心力和離心時間，對精子回收率和受精潛能的綜合影響。

（七） 統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，處理前后精子濃度、活動率、形態(tài)以及DNA碎片率等數(shù)據(jù)比較采用配對t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、3030例新鮮精液不同實驗方案（4組）處理后精液質(zhì)量比較

4 組不同實驗方案以組2為常規(guī)方案（離心液1.0mL，300×g，離心20min），其他3組均以此為基礎(chǔ)，改變離心液體積、離心力和離心時間探研對精子的前向運動精子百分率、正常形態(tài)率、DNA碎片率以及前向運動精子回收率的影響

（一）組1方案（改變梯度離心液的體積）處理對精液質(zhì)量的影響

組1和組2的區(qū)別僅梯度液的體積不同，研究發(fā)現(xiàn)兩組間回收精子的前向運動精子百分率、正常形態(tài)率、DNA碎片率以及前向運動精子回收率沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表1。

表1 不同實驗方案處理后精液質(zhì)量比較（30例新鮮精液組）

（二）組3方案（改變離心力和離心時間）對精液質(zhì)量影響

組3是在組2的基礎(chǔ)上改變了離心力和離心時間，研究發(fā)現(xiàn)兩組間回收精子的前向運動精子百分率、正常形態(tài)率、DNA碎片率以及前向運動精子回收率沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表1。

（三）組4方案（改變梯度離心液的體積、離心力和離心時間）對精液質(zhì)量影響

組4在組2的基礎(chǔ)上，既改變了梯度液的體積，又改變了離心力和離心時間，研究發(fā)現(xiàn)兩組間回收精子的前向運動精子百分率、正常形態(tài)率、DNA碎片率以及前向運動精子回收率沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表1。

二、 3030例冷凍精液不同實驗方案（4組）處理后精液質(zhì)量比較

30例冷凍精液中，梯度離心液的體積、離心力和離心時間對精子的前向運動精子百分率、正常形態(tài)率、DNA碎片率以及前向運動精子回收率的影響。

（一）組1方案（改變梯度離心液的體積）對精液質(zhì)量的影響

組1和組2的區(qū)別僅梯度液的體積不同，研究發(fā)現(xiàn)兩組間回收精子的前向運動精子百分率、正常形態(tài)率、DNA碎片率以及前向運動精子回收率沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表2。

表2 不同實驗方案處理后精液質(zhì)量比較（30例冷凍精液組）

（二）組3方案（改變離心力和離心時間）對精液質(zhì)量影響

組3是在組2的基礎(chǔ)上改變了離心力和離心時間，研究發(fā)現(xiàn)兩組間回收精子的前向運動精子百分率、正常形態(tài)率、DNA碎片率以及前向運動精子回收率沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表2。

（三）組4方案（改變梯度離心液的體積、離心力和離心時間）對精液質(zhì)量影響

組4在組2的基礎(chǔ)上，既改變了梯度液的體積，又改變了離心力和離心時間，研究發(fā)現(xiàn)兩組間回收精子的前向運動精子百分率、正常形態(tài)率、DNA碎片率以及前向運動精子回收率沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表2。

討 論

一份較好質(zhì)量的精子樣本是指含有較高數(shù)量的前向運動精子，并具有較高正常形態(tài)率[4]和較低的DNA碎片率[5]。為此，本研究采用前向運動精子百分率、回收精子的正常形態(tài)率以及精子DNA碎片率等參數(shù)來評估回收精子的受精潛能。

一、離心力和離心時間對精子質(zhì)量和回收率的影響

梯度密度離心法是根據(jù)正常精子與畸形精子、不活動精子及精液中的其他細(xì)胞成分在運動能力、運動軌跡和浮力密度等方面存在差異，在密度梯度溶液柱中運動的能力也有差異，離心后精液中的各種成分在密度梯度溶液柱中達(dá)到平衡，停留在各自的等浮力密度點上，從而達(dá)到分離精子的目的[6]。

梯度密度離心要盡可能選用高的轉(zhuǎn)速，因為太低的速度將需要很長的時間來建立梯度并使顆粒成帶，并相應(yīng)增加了精子損傷的危險，使分離失敗，應(yīng)盡量將離心時間控制在精子損傷之前、精子穿過梯度形成分離區(qū)之后。離心時間對密度區(qū)帶的形成和分離狀態(tài)有著很大影響，直接影響到精子的純化效果。離心時間過短，不能形成等密度區(qū)帶，精子不能得到有效純化；在體系到達(dá)平衡狀態(tài)后，不同密度區(qū)帶形成，再延長離心時間已無意義。我們將現(xiàn)行的300 ×g，離心20min的離心方法，改為1 200×g，離心時5min，發(fā)現(xiàn)兩組處理后前向運動精子的回收率、精子的正常形態(tài)率無明顯差異。

對于梯度密度離心過程離心力對精子的影響，不同的研究者觀點不一致。有一些學(xué)者報道梯度密度離心技術(shù)中采用較高的離心力會產(chǎn)生活性氧類物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS）而對精子有不利的影響[7-9]；也有學(xué)者[10]研究發(fā)現(xiàn)300×g，離心20min的離心方法，離心力的作用不會導(dǎo)致精子凋亡或僅導(dǎo)致極少的精子凋亡。同樣，Stevanato等[11]研究表明，梯度密度離心前后精子的DNA碎片率沒有顯著差異，即離心力的作用不會明顯導(dǎo)致精子DNA碎片的增加。我們研究發(fā)現(xiàn)300×g，離心20min與1200×g，離心5min，回收的精子DNA碎片率無明顯差異，這說明1200×g，離心5min與300×g，離心20min對精子的損傷并無明顯差異。與我們的方法相似，有學(xué)者[12]采用500×g，離心10min的方法進(jìn)行密度梯度離心，獲得了較高質(zhì)量的精子，并最大限度減少對精子的損害。

在梯度密度離心過程中，當(dāng)精子離心下沉聚成團(tuán)時，上下兩層的梯度液可以充當(dāng)密度較高的緩沖液體，可以緩解較高離心力的沖擊；另外梯度液對精子有懸浮作用，也可減輕離心對精子的損害。因而以較高的離心力伴較短的離心時間，也可以獲得相同質(zhì)量的精子[3]。

我們分析認(rèn)為通過梯度密度離心技術(shù)分離的精子類型的主要取決于其浮力密度，在密度梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和足夠的時間可以沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡, 從而分離不同密度的精子。因此，只要達(dá)到一定的離心力和一定時間就將能分離到目標(biāo)精子，即較低的離心力結(jié)合較長的離心時間或較高的離心力結(jié)合較短的離心時間都可分離到相同數(shù)量和質(zhì)量目標(biāo)精子。

二、離心液的體積對精子質(zhì)量和回收率的影響

梯度密度離心的效果與加樣本體積有關(guān)，加樣量體積過大，梯度液的負(fù)載大，多組份體系不能有效分離，嚴(yán)重時可能產(chǎn)生梯度塌陷現(xiàn)象，致使分離失敗。理論上，減少梯度液的總體積，可以減少精子遷移的距離而最大限度地回收活動精子。但我們研究發(fā)現(xiàn)梯度液的體積對精子的回收率影響并不大，80%和40%的梯度離心液從1.0mL降低至0.5mL，兩組前向運動精子的回收率、正常精子形態(tài)率和精子的DNA碎片率并無顯著差異，與我們的研究結(jié)果一致。Edmond 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在相同的離心力和離心時間下，離心液的體積不影響精子的回收率和精子的質(zhì)量相關(guān)參數(shù)。究其原因，可能是只要保證有一定范圍的離心力和離心時間，目標(biāo)精子都可以穿過梯度液得到很好的分離。

三、離心力、離心時間和離心液體積對精子質(zhì)量和回收率的影響

最后我們將80%和40%的梯度離心液由各1 mL改為0.5mL，300×g，離心20min改為1 200×g，離心5min，研究發(fā)現(xiàn)兩組回收精子的前向運動精子百分率、正常形態(tài)率、DNA碎片率以及前向運動精子回收率也沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。這一結(jié)果進(jìn)一步表明，將現(xiàn)行常規(guī)離心方案改為80%和40%的梯度離心液體積各0.5mL，1 200×g，離心時5min是可行的。

IVF實驗室技術(shù)人員必須在每天上午12點前處理好所有的精液，以準(zhǔn)備與卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精，否則就會錯過卵母細(xì)胞受精的最佳時間造成受精失敗。本方法可為體外受精技術(shù)的精液處理環(huán)節(jié)節(jié)省大量操作時間，大大提高了工作效率，這使得每次離心只處理一份精液成為可能，這樣可以從根本上杜絕不同精液標(biāo)本之間相互混淆的可能性，這對于整個IVF項目的開展、運行和長遠(yuǎn)發(fā)展有著十分重要的意義。

1 Jayaraman V, Upadhya D, Narayan, PK, et al. Sperm processing by swim-up and density gradient is effective in elimination of sperm with DNA damage. J Assist Reprod Genet 2012; 29(6): 557-563

2 世界衛(wèi)生組織著, 古翊群等譯. 世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室書冊第5版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2011: 139

3 世界衛(wèi)生組織著, 古翊群等譯. 世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室書冊第5版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2011: 52

4 Stuhtmann G, Oldenhof H, Peters P, et al. Iodixanol density gradient centrifugation for selecting stallion sperm for cold storage and cryopreservation. Anim Reprod Sci 2012; 133(3-4): 184-190

5 陳欣潔, 孫筱放, 張偉良, 等. 精子形態(tài)與體外授精妊娠結(jié)局的關(guān)系. 中國男科學(xué)雜志 2008; 22(10): 29-32

6 黃荷鳳.現(xiàn)代輔助生育技術(shù). 北京: 人民軍醫(yī)出版社, 2003: 201

7 Aitken RJ, Clarkson JS. Signifi cance of reactive oxygen species and antioxidants in defi ning the effi cacy of sperm preparation techniques. J Androl 1988; 9(6): 367-376

8 Mortimer D. Sperm preparation techniques and iatrogenic failures of in vitro fertilization. Hum Reprod 1991; 6(2): 173-176

9 Zini A, Mak V, Phang D, et al. Potential adverse effect of semen processing on human sperm deoxyribonucleic acid integrity. Fertil Steril 1999; 72(3): 496-499

10 Ricci G, Perticarari S, Boscolo R, et al. Semen preparation methods and sperm apoptosis: swim-up versus gradientdensity centrifugation technique. Fertil Steril 2009; 91 (2): 632-638

11 Stevanato J, Bertolla RP, Barradas V, et al. Semen processing by density gradient centrifugation does not improve apoptotic deoxyribonucleic acid fragmentation rate. Fertil Steril 90(3) :889-890

12 吳穎, 張欣宗, 姚康壽. 兩種精液處理方法對精液參數(shù)及冷凍效果的比較分析. 中國男科學(xué)雜志 2010; 24(9): 40-42

13 Edmond AJ, Brinsko SP, Love CC, et al. Effect of centrifugal fractionation protocols on quality and recovery rate of equine sperm. Theriogenology 2012; 77(5): 959-966

（2016-03-21收稿）

The effects of centrifugal force, time and gradient liquid volume of gradient density centrifugation gradient on the recovery of sperm and fertilization potential

Zhang Qingjian, Song Ge, Zhu Xiaoli, Tan Yumei, Zheng Weiwei
Key Laboratory of Male Reproduction and Genetics of National Health and Family Planning Commission Reproductive center of Guangdong province Family Planning Science and Technology Research Institute, Guangzhou 510600, China

Objectivee To investigate the effect of centrifugal force, time and gradient liquid volume of the gradient density centrifugation on the recovery of the progressive motile sperm and fertilization potential. Metthhooddss Semen samples were divided into 30 cases of fresh semen group and 30 cases of frozen semen group. And each sample was divided into 4 subgroups: Subgroup 1: 80% and 40% gradient liquid volume each 0.5 mL, 300×g centrifugation for 20 minutes. Subgroup 2: 80% and 40% gradient liquid volume each 1mL, 300×g centrifugation for 20 minutes. Subgroup 3: 80% and 40% gradient liquid volume each 1mL, 1 200×g centrifugation for 5 minutes. Subgroup 4: 80% and 40% gradient liquid volume each 0.5mL, 1 200×g centrifugation for 5 minutes. Recovery of the sperm and fertilization potential, sperm concentration, progressive motile sperm, normal morphology and sperm DNA fragmentation rates were detected before and after treatment in each group. Ressuullttss There were no signifi cant differences in the normal morphology of sperm, the recovery rate of the progressive motile sperm and the rate of sperm DNA fragments between subgroup 2 and other subgroups(P＞ 0.05),regardless of fresh or frozen semen sample. Conclusionusion Although 300g centrifugation 20 min of centrifugation was changed into 1 200×g, centrifuged for 5 minutes, and 1.0mL gradient liquid volume was changed into 0.5 mL, sperm normal morphology rate, progressive motile sperm rate and sperm fertilization potential remained unchanged

ords centrifugation, density gradient; spermatozoa; fertilization

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2016.08.005

R 321-33

項目：本課題受廣東省計劃生育委員會研究項目（編號：20132010）和廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項目（編號：A2014195）資助