霍震　沈進　許禮發(fā)

摘要： 運用pADxsi系統(tǒng)制備可表達人PDX1與PAX4雙基因的重組5型腺病毒。從pEGFP-N1-PDX1質粒上酶切下目的基因PDX1并酶連到腺病毒穿梭質粒pShuttle-EGFP-CMV上，替換EGFP而得到pShuttle-CMV-PDX1；再將PAX4從pEGFP-N1-PAX4質粒上酶切下連到pShuttle-CMV-PDX1的多克隆酶切位點而得到穿梭質粒pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4；雙酶切pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4將CMV-PDX1/CMV-PAX4轉移到ADxsi骨架質粒上，得到pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4腺病毒質粒，然后在293細胞中進行包裝并擴增重組腺病毒，并進行病毒滴度測定；體外感染人間充質干細胞。依據(jù)酶切、測序和PCR的結果均證明重組人PDX1與PAX4雙基因表達腺病毒載體構建正確；而RT-PCR與WB結果也顯示目的基因在細胞中穩(wěn)定表達。應用重組技術成功構建人PDX1與PAX4雙基因表達5型腺病毒載體，轉錄因子PDX1與PAX4在間充質干細胞內穩(wěn)定表達且定位于細胞核內。

關鍵詞： 5型腺病毒；間充質干細胞（MSCs）；胰腺十二指腸同源框蛋白1（PDX1）；成對盒基因4（PAX4）；轉錄因子

中圖分類號：Q78文獻標志碼：A

文章編號：1672-1098（2016）02-0080-07

Abstract：With the use of pADxsi system， the recombinant adenovirus of expressing PDX1 and PAX4 is in place.GFP in the pShuttle-GFP-CMV vector is replaced with the target gene of PDX1 obtained from the pEGFP-N1-PDX1 plasmid， resulting in the pShuttleCMV-PDX1 plasmid. With the pEGFP-N1-PAX4 plasmid cut off， PAX4 is inserted into pShuttle-CMV-PDX1 to acquire the pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4 plasmid. Afterwards， the CMV-PDX1/CMV-PAX4 fragment is transferred to the ADxsi skeleton vector to get the pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4 virus vector. Finally， the recombinant adenovirus is packaged， amplificated， and titrated in HEK293 cells for the infection of human umbilical cord mesenchymal stem cells. The structure of pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4 adenovirus expression vector is confirmed by means of a restriction analysis and PCR. RT-PCR and Western blot results have established that the target genes are persistently expressed in the infected cells.The recombinant human PDX1 and PAX4 expressing adenovirus is successfully constructed， packaged， and amplificated.The target genes can be continuously presented in mesenchymal stem cells.

Key words：adenovims vector；pancreatic and duodenal homeobox factor 1；paired box gene 4；mesenchymal stem cells

糖尿病是由于胰島β細胞功能絕對或相對缺陷，以慢性高血糖為特征的終身性代謝性疾病[1-2]。長期血糖增高，可導致大血管、微血管受損并危及心、腦、腎、周圍神經、眼睛、足等，每年因糖尿病死亡者有一半以上是心腦血管所致，10%是腎病變所致；因糖尿病截肢是非糖尿病的10～20倍[3-4]。因此，預防糖尿病的并發(fā)癥并最終控制血糖是重要的社會問題。

至目前為止，控制患者血糖仍主要是依賴每天胰島素的補充，給患者生活帶來極大的不便與沉重的經濟負擔。尋找具有合成與分泌胰島素的細胞進行細胞替代治療一直是研究的熱點。近年來研究證實間充質干細胞具有多向分化的潛能且無免疫原性，是一類極具應用潛能的干細胞[4-5]。胰十二指腸同源框基因1 （pancreatic and duodenal homeobox factor 1，PDX 1）在胚胎發(fā)育過程中具有促進胚胎干細胞向胰腺的早期發(fā)育和晚期胰島素分泌細胞分化的功能[6]；此外，還具有維持胰島β細胞合成與分泌胰島素的功能[7-8]；然而，單獨的PDX1轉錄因子并不能有效誘導干細胞定向向胰島β細胞分化，在胰腺前體分化與發(fā)育過程中，成對盒基因4（paired box gene 4，PAX4）表達將有利于胰腺前體細胞定向向β細胞分化，并參與調控β細胞功能的成熟[8-10]。因此，PDX1與PAX4聯(lián)合作用對誘導MSCs定向向具有合成與分泌胰島素功能的β樣細胞可能具有促進作用，基于這一假設，在本研究中，選用對MSCs具有較高感染效率的Ⅴ型腺病毒載體，構建攜帶目的基因PDX1與PAX4的重組腺病毒ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4，感染MSCs細胞，以觀測所攜帶的目的基因表達情況，為進一步研究PDX1與PAX4在誘導MSCs向具有合成與分泌胰島素功能的β樣細胞分化的可能及其分子機制奠定實驗基礎。

1材料和方法

1.1材料與試劑

Bgl II等多種限制性內切酶、Klenow及T4 DNAligase均購自美國Sigma 公司；CIP（Alkaline Phosphatase，Calf Intestinal）酶、質粒提取純化試劑盒和凝膠回收試劑盒購自北京天恩澤公司；腺病毒pADxsi載體系統(tǒng)由上海漢恒生物有限公司提供；293細胞及DH5a菌株由深圳清華研究院鄭義博士惠贈，pEGFP-N1-PAX4與pEGFP-N1-PDX1質粒為前期本實驗室所構建。Anti-PAX4 antibody （ab42450）/IgG、Anti-PDX1 antibody （ab47383）/IgG購自美國Abcam公司，HRP標羊抗鼠IgG、HRP標羊抗兔IgG、FITC標羊抗兔IgG、CY5標羊抗鼠IgG購自eBioscience公司。Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成；RT-PCR試劑盒為北京天恩澤公司； DMEM/F12培養(yǎng)基購自武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Hyclone公司。原代人臍帶間充質干細胞購自北京醫(yī)科利昊生物科技有限公司。

1.2方法

1） pADxsi-CMV- PDX1/CMV- PAX4腺病毒載體的構建。 首先構建pShuttle-GFP-CMV- PDX1穿梭質粒：已知PDX1序列上游有Nhe I和Bgl II酶切位點，下游有Sal I和EcoR I酶切位點，首先用Sal I酶切pEGFP-N1- PDX1，再用Klenow平端處理，最后用Nhe I酶切，回收0.66 kb片段；其次用Nhe I和Pme I雙酶切pShuttle-GFP-CMV載體，替換GFP， CIP去磷酸化處理，回收載體片段5.2 kb；最后，酶連切好的載體片段和插入片段，獲得pShuttle-CMV-PDX1。再構建pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4穿梭質粒載體：從pEGFP-N1-PAX4上用BamH I和Sal I雙酶切切下PAX4（PAX4序列上游存在BamH I和Bgl II酶切位點，下游存在Xba I和Sal I酶切位點）；同時對pShuttle-CMV- PDX1載體用BamH I和 Sal I雙酶切，CIP去磷酸化處理，膠分別回收與純化載體與酶切PAX4目的基因片段并用T4 DNA 連接酶酶連得到pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4穿梭質粒。最后用T4 DNA 連接酶酶連目的片段pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4和pADxsi骨架質粒；轉化產物并轉染DHSa，擴增pADxsi -CMV-PDX1/CMV- PAX4質粒，對質粒產物進行提取并進行電泳簽定，產物由上海豐恒生物科技有限公司進行測序鑒定。

2） 重組腺病毒的包裝、擴增和滴度測定。 Pac I酶切線性化重組腺病毒質粒，用Lipofectamine 2000脂質體轉染細胞密度約80%的293細胞。3～5 d后，開始出現(xiàn)明顯噬斑，待大部分細胞病變（cyto-pathic effect，CPE）時，收集細胞混懸液，于-80℃/25℃反復凍融3次，再離心收集上清，繼續(xù)感染293細胞擴增病毒以提高腺病毒（ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4）滴度，TCID 50法測定病毒滴度。

3） ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4感染MSCs與目的基因表達。 于六孔板接種MSCs細胞5.0×105/孔，細胞密度達80%時，按感染指數(shù)為10PFU/細胞、50PFU/細胞、100PFU/細胞加入相應量的腺病毒液；同時設ADxsi-CMV-GFP感染的空病毒對照組。當實驗進行到相應階段時，即培養(yǎng)到24h、48h和72h等階段分別收集細胞行WB、免疫細胞化學與間接熒光檢測；同時RT-PCR檢測目的基因表達，引物分別如下PDX1 的F：5′-AAGCTAGCCCGCAGCCATGA-3′、R：5′-TCCTCGAGTCATCGTGGTTCCTG-3′，Tm為61.5℃，擴增目的片段為882bp；PAX4：F：5′-TCCCAGTGTCTCCTCCATC-3′、R：5′-ACCTTTCCGGTGCTGTTGC-3′，Tm為60 ℃，擴增目的片段為515 bp；內參照分子GAPDH：F：5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′、R： 5′-TGAGGAGGGGAGATTCAGTG-3′。

（4）Western blotting檢測

胰酶消化，收集目的細胞，裂解細胞并離心取上清液，應用15%的SDS-PAGE膠電泳2h后，濕轉移法至PVDF膜，脫脂牛奶TBST液封閉1h，再分別加抗人PAX4、PDX1抗體IgG液振蕩過夜，HRP標記相應二抗親合反應后ECL顯色。

2結果

2.1鑒定重組腺病毒質粒

Xho I酶切pADxsi-CMV- PDX1/CMV-PAX4病毒質粒，陽性克隆pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4由以下6條帶組成即：14 kb、11.8 kb、5.9 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.6 kb；而陰性克隆（pADxsi骨架質粒）只有以下6條帶組成：14 kb、11.8 kb、4.0 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.6 kb；酶切結果陽性質粒均與理論預期一致，具體酶切結果（見圖1）。

2.2重組腺病毒的包裝和滴度測定

Pac I酶切線性化的pADxsi-CMV- PDX1/CMV-PAX4重組腺病毒質粒經脂質體Lipofectamine2000轉染293細胞后3 d，開始出現(xiàn)病變效應（見圖3）。120 h后，此時約70%細胞懸浮，收集細胞與上清液體，凍融后，再應用293細胞重復擴增、收集病毒液?？瞻哂嫈?shù)法（PFU）測定病毒滴度為1.0×108 PFU/mL；使用同樣方法測定對照組。空載腺病毒ADxsi的滴度為2.0×108 PFU/mL。

2.3 目的基因表達

MSCs在光學顯微鏡下呈典型的長梭形，呈漩渦狀或放射狀平行排列（見圖4）； ADxsi-CMV-GFP空病毒感染后24 h即可在熒光鏡下觀察到GFP表達。免疫細胞化學染色與間接熒光分別證實ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4腺病毒以感染復數(shù)（MOI）=100感染目的細胞 （MSCs）24 h后，實驗組MSCs的細胞核中即可檢測到PDX1與PAX4 mRNA；細胞化學檢測顯示，PDX1與PAX4 主要定位于細胞核內，陽性率高于75%。間接熒光同樣證實細胞核中PAX4（FITC）與PDX1 （CY5）均穩(wěn)定表達（見圖4）。

轉染后光鏡下的細胞形態(tài)相同于正常的MSCs細胞形態(tài)，呈梭形排列，應用ADxsi-CMV-EGFP空病毒感染細胞后，可見到細胞內綠色熒光表達，分別應用抗體檢測PDX1與PAX4表達與定位，熒光結果顯示PDX1與PAX4均定位于細胞核內，且免疫細胞化學檢測也證實兩轉錄因子定位于細胞核內，且穩(wěn)定表達。

2.4 目的基因轉錄與表達

RT-PCR法與WB分別檢測重組腺病毒ADxsi-CMV- PDX1/CMV-PAX4轉染后不同時段細胞內目的基因mRNA和蛋白表達結果顯示：MSCs胞質內PDX1與PAX4 mRNA水平穩(wěn)定；進一步Western blotting（WB）法檢測感染后12 d的細胞核內PDX1與PAX4蛋白一直穩(wěn)定表達（見圖5），提示重組腺病毒ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4可以有效感染MSCs，且目的基因均能穩(wěn)定表達，這為后續(xù)研究目的基因在MSCs轉分化過程中的功能奠定實驗基礎。

3討論

MSCs具有多向分化潛能，為探討MSCs分化為合成與分泌胰島素功能的胰腺β細胞，選用了在胰腺前體細胞向β細胞分化過程中起關鍵作用的兩個轉錄因子PDX1與PAX4[8-11]，并構建對MSCs具有穩(wěn)定轉染能力的Ⅴ型腺病毒載體[12-13]，用PDX1換去示蹤基因EGFP，把PAX4基因插入到多克隆位點，構建并包裝成帶PDX1與PAX4雙目的基因的活性重組腺病毒（ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4），酶切結果與測序結果證實重組腺病毒構建成功，目的基因連接正確。

應用ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4感染MSCs結果顯示，重組病毒可以穩(wěn)定高效感染MSCs，間接熒光檢測結果顯示，轉染的MSCs在細胞核穩(wěn)定表達PDX1與PAX4分子，細胞化學染色結果同樣證實PDX1與PAX4分子定位于在MSCs細胞核內，這提示帶PDX1與PAX4轉錄因子基因的重組腺病毒不僅可以高效感染目的細胞，并且穩(wěn)定表達目的轉錄因子，而且所帶的轉錄因子均具有核定位功能。

另一方面應用RT-PCR技術檢測轉錄重組腺病毒的MSCs細胞內目的基因的轉錄水平表明目的基因在重組腺病毒感染細胞后仍可以檢測到轉錄目的基因的mRNA水平穩(wěn)定，提示在腺病毒的CMV啟動子的作用下，目的基因在細胞內穩(wěn)定轉錄。進一步抽提感染腺病毒的MSCs的細胞核蛋白，并行WB檢測PDX1和PAX4轉錄因子蛋白水平，發(fā)現(xiàn)兩種轉錄因子在細胞核水平穩(wěn)定，這一方面提示腺病毒的CMV啟動子具有強的啟動目的基因轉錄功能，另一方面，目的轉錄因子穩(wěn)定定位于細胞核，說明表達的轉錄因子具有核定位能力。的并且能穩(wěn)定轉錄與表達PDX1與PAX4分子。

綜上檢測結果證實， PDX1與PAX4雙帶目的基因的Ⅴ型重組腺病毒被成功構建，重組腺病毒所帶的目的基因均能穩(wěn)定轉錄與翻譯成功能轉錄因子PDX1與PAX4，且兩功能轉錄因子均具有核定位功能，這為下一步研究2功能轉錄因子在誘導MSCs定向向胰腺β細胞分化過程中的功能與分子機制奠定了實驗基礎。

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（責任編輯：何學華吳曉紅）