羅 旻， 顧 華

(1. 上海市控江中學， 上海 200093； 2. 同濟大學 生命科學與技術學院， 上海 200092)

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CRISPR-dCas9系統(tǒng)在基因表達調(diào)控中的最新研究進展

羅 旻1， 顧 華2

(1. 上海市控江中學， 上海 200093； 2. 同濟大學 生命科學與技術學院， 上海 200092)

CRISPR-Cas9系統(tǒng)自問世以來一直被廣泛地應用于基因組編輯技術中，直到人們通過點突變的方式將Cas9的RuvC和HNH剪切結(jié)構(gòu)域失活得到dCas9后，這個系統(tǒng)又有了新的功能——調(diào)節(jié)基因的表達水平。研究者通過改變gRNA的結(jié)構(gòu)，并與RNA結(jié)合蛋白配對，從而招募轉(zhuǎn)錄因子以調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄水平，達到影響基因表達的目的。本文主要討論了CRISPR-dCas9系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)特點、作用原理和目前對調(diào)節(jié)基因表達的最新研究進展，以期為此領域的研究者提供參考。

CRISPR； dCas9； 引導RNA； 協(xié)同激活因子

E-mail:gu_hua@#edu.cn

0 引 言

微生物體持續(xù)不斷地受到外源DNA的侵染，使得它們不得不建立起一套防御系統(tǒng)來識別外源DNA和“自己”的DNA，并且將外源DNA“驅(qū)逐”出基因組，當然這套系統(tǒng)也允許某些對遺傳物質(zhì)守恒有利的外源DNA整合到自己的基因組里，增強自身對外界環(huán)境的適應性。之前的研究中，CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas(CRISPR-associated)系統(tǒng)已經(jīng)被證實能夠幫助微生物抵抗病毒與質(zhì)粒的干擾。

CRISPR序列是一個高度多變的DNA序列，常包含一個550bp的leader 序列和一系列重復-間隙單位(repeat-spacer units)。重復序列長度在24-48bp，他們通常會形成二重對稱，因此會形成如發(fā)夾結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu)，但不是回文結(jié)構(gòu)，重復次數(shù)最高可達250 次。重復序列之間被26～72 bp 間隔序列(spacer)隔開, 間隔序列長度與細菌種類和CRISPR 位點有關，間隔序列能夠通過堿基互補配對的方式使外源DNA被降解。在CRISPR 位點附近, 存在一系列CRISPR相關基因(CRISPR-associated, Cas)，在CRISPR 位點的第一個重復序列的上游定位有CRISPR 前導序列(leader sequence)作為啟動子啟動下游序列表達(見圖1)。當CRISPR序列轉(zhuǎn)錄時，Cas 蛋白加工CRISPR RNA成一個沉默RNA，這個沉默RNA就會對外來同源的DNA起到作用。Cas基因能夠編碼一個大的且多樣化的蛋白家族，這些蛋白攜帶核酸酶、解旋酶、聚合酶和多核酸結(jié)合蛋白的功能[1]。如今，隨著研究的深入進行，CRISPR系統(tǒng)已經(jīng)成為了目前不可或缺的、精確性高的基因編輯工具。

圖1 CRISPR基本結(jié)構(gòu)示意圖(“n”表示不同來源的間隔序列)[2]

CRISPR-Cas9系統(tǒng)主要有三類，其中CRISPR II類系統(tǒng)是目前最為廣泛使用的RNA指導核酸內(nèi)切酶技術，此系統(tǒng)有兩個主要的成分：引導RNA(guide RNA，gRNA)和核酸內(nèi)切酶(Cas9)。其中，gRNA是由細菌的內(nèi)源性crRNA和tracrRNA嵌合而成的人工合成RNA。在CRISPR基因序列中，重復-間隙單元能夠轉(zhuǎn)錄出crRNA的前體，在Cas9核酸內(nèi)切酶或內(nèi)源性RNA酶III的作用下形成crRNA。crRNA能夠與CRISPR基因座上編碼的tracrRNA結(jié)合形成RNA二聚體，引導Cas9識別并降解特異性的外源DNA序列[3]。因此gRNA既有crRNA的靶向特異性又有tracrRNA的輔助功能。當細胞內(nèi)同時表達Cas9和gRNA時，兩者形成的復合物能夠?qū)蚪MDNA進行修飾編輯或造成永久性改變。

為了實現(xiàn)Cas9對靶向序列的切割，不僅需要gRNA與靶向序列的堿基互補配對，還要求靶向序列的下游存在原型間隔序列毗鄰區(qū)(Protospacer Adjacent Motif，PAM)，兩個條件缺一不可。PAM序列與Cas9一樣，在不同的細菌物種中存在序列的多樣性。目前，最常見的CRISPR II類系統(tǒng)是在化膿性鏈球菌中發(fā)現(xiàn)，其中PAM序列為NGG[3]。有趣的是，只有來自于同一物種的Cas9、gRNA和PAM才能相互發(fā)揮作用。在gRNA的引導下，Cas9識別并在靶向基因的PAM上游剪切3-4個堿基，產(chǎn)生雙鏈缺口(Double Strand Break，DSB)[4]，從而實現(xiàn)對基因組DNA編輯。

1 CRISPR-dCas9系統(tǒng)對基因表達水平的調(diào)控作用

CRISPR-Cas9是基因組調(diào)控技術中靈活性最強的系統(tǒng)之一。Cas9的核酸酶剪切活性取決于兩個結(jié)構(gòu)域：RuvC和HNH。這兩個結(jié)構(gòu)域分別負責切割DNA鏈的兩條鏈，并且這兩個結(jié)構(gòu)域能夠單獨地被人工點突變失活?；撔枣溓蚓写嬖谝环NCas9 D10A突變體，這種鏈球菌的Cas9的RuvC失活(RuvC-)，HNH仍有活性(HNH+)；另一種Cas9 H840A的突變體的Cas9蛋白則呈現(xiàn)RuvC激活(RuvC+)和HNH失活(HNH-)的狀態(tài)，但這兩種突變體的Cas9仍然具有核酸酶活性，可對靶向序列進行剪切作用。當RuvC和HNH同時處于失活狀態(tài)時(D10A&H840A；RuvC-&HNH-)，Cas9將不具有核酸酶活性，成為dCas9(dead Cas9)[5]。dCas9雖然沒有剪切DNA的能力，但仍然可以在gRNA的引導下與特定的DNA序列結(jié)合。由此，研究者們試圖利用dCas9能與DNA序列結(jié)合的能力將dCas9轉(zhuǎn)化為能激活基因表達的轉(zhuǎn)錄因子。

研究發(fā)現(xiàn)，dCas9只有通過與其他蛋白融合后，才能夠發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，促進或抑制基因的表達，并且不失去與gRNA結(jié)合的能力(見圖2)。例如：當轉(zhuǎn)錄激活子VP64與dCas9融合后，能夠促進靶向基因的表達[6]。但后續(xù)實驗證實，若直接將dCas9與VP64融合，只能較小程度地提高轉(zhuǎn)錄水平。人們試著將VP64與dCas9的氨基端和羧基端融合[3]或?qū)Cas9與10拷貝數(shù)的VP64融合[14]，均能提高CRISPR-dCas9對基因表達的促進作用。Chavez[16]等人構(gòu)建出一種稱為VP64-p65-Rta 三次方激活子的蛋白與dCas9融合，改造后的VP64蛋白與dCas9融合能夠顯著地促進內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄水平。

當轉(zhuǎn)錄抑制子KRAB的Kox1結(jié)構(gòu)域與dCas9融合后，能夠改善CRISPR系統(tǒng)的剪切作用[7]。若沒有蛋白與dCas9融合，dCas9則會干擾靶向序列的轉(zhuǎn)錄過程[4]。因此，若gRNA識別的基因位點在靶向基因的啟動子附近，研究者將可以通過人工合成的方式改變dCas9的結(jié)構(gòu)，以實現(xiàn)對靶向基因表達的調(diào)控[3]。

除了對蛋白編碼區(qū)域的調(diào)節(jié)，CRISPR-dCas9系統(tǒng)同樣能夠作用于非編碼RNA(lncRNAs)。例如，在人白血病細胞K562中，5種lncRNAs(H19，MALAT1，NEAT1，TERC,XIST)都能夠在CRISPR-dCas9系統(tǒng)的介導下，顯著下調(diào)80%以上[16]。

圖2 CRISPR-dCas9系統(tǒng)招募不同的轉(zhuǎn)錄因子促進或抑制基因的表達水平[11]

2 CRISPR-dCas9系統(tǒng)對調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄作用的優(yōu)化及應用

Perez-Pinera等人設計了4種特異性的gRNA，能夠與8個藥物治療有關的基因(ASCL1, NANOG, HBG1/2, MYOD1, VEGFA, TERT, IL1B, IL1R2)的啟動子結(jié)合。與表達dCas9-VP64和這4種gRNA的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞后，以上8種靶向基因的表達水平均上升，并且這4種gRNA在細胞中發(fā)揮協(xié)同效應。相比于蛋白質(zhì)，這種通過RNA來識別目的基因序列的方式，能夠避免表觀遺傳對DNA序列修飾后帶來的局限性，例如甲基化的DNA序列仍然能夠被RNA識別。但是相比于TALEN技術，與相同的啟動子結(jié)合作用后，dCas9-VP64對于IL1 RN等幾個基因的激活水平較低[8]。因此，dCas9與轉(zhuǎn)錄因子形成的復合物對靶向基因表達的調(diào)節(jié)能力并不突出。

為了提高CRISPR-dCas9系統(tǒng)調(diào)節(jié)基因表達水平的能力，Konermann等人將單鏈引導RNA(single-guide RNA，sgRNA)的結(jié)構(gòu)改變，使其成為多種轉(zhuǎn)錄因子的組裝場所，這種方法通過引入轉(zhuǎn)錄激活子以提高CRISPR-dCas9系統(tǒng)對基因表達的促進作用。他們找到了sgRNA的兩個可結(jié)合RNA結(jié)合蛋白的區(qū)域。sgRNA在添加了兩個適配體后，能夠通過適配體招募RNA結(jié)合蛋白(如VP60)，RNA結(jié)合蛋白又能與轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而提高基因表達的水平。他們將這個系統(tǒng)命名為協(xié)同激活因子(synergistic activation mediator，SAM)，通過實驗證明，相比于dCas9與轉(zhuǎn)錄激活子直接融合的方法，這個系統(tǒng)能夠?qū)⒅半y以激活的12個基因的轉(zhuǎn)錄水平提高約100倍[9]。

為了證明這個系統(tǒng)的廣泛性，他們創(chuàng)建了人工sgRNA數(shù)據(jù)庫，這些sgRNA經(jīng)過人為改造后能夠使超過23000個人類基因獨立地表達。通過這個系統(tǒng)，找到了黑色素瘤對PLX-4720的耐藥性的問題所在。之前的研究認為，PLX-4720之所以對黑色素瘤的治療失效，是由于黑色素瘤細胞的某些基因表達所致。通過人為設計特異性的sgRNA，研究者能夠單獨的控制基因的表達，由此也能找到致使黑色素瘤細胞耐藥的關鍵基因所在?？梢灶A期，SAM將成為疾病治療的研究方法之一，引導人們將問題轉(zhuǎn)移到基因的表達上[9]。這種SAM系統(tǒng)也是根據(jù)天然的基因調(diào)節(jié)機制改良而來。增強子(enhancer)，本質(zhì)上是一段基因序列，通過與多種轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能夠啟動基因的表達。另外，增強子和其他轉(zhuǎn)錄元件能夠產(chǎn)生一段長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，這種lncRNA能夠招募各種細胞調(diào)節(jié)因子，進而作用于組蛋白與DNA組成的染色質(zhì)，調(diào)節(jié)基因的表達水平(見圖3)[10]。

后續(xù)的研究表明，通過改變dCas9或CRISPR RNA的結(jié)構(gòu)能夠提高CRISPR靶向基因的轉(zhuǎn)錄效率。在同一細胞里可以同時使用多種改良的CRISPR RNA對基因的轉(zhuǎn)錄進行調(diào)節(jié)，從而控制細胞的代謝水平[11]。綜上所述，當CRISPR-dCas9系統(tǒng)中的sgRNA結(jié)構(gòu)與lncRNA相似時，能使特定的多種效應分子蛋白組裝成一個大分子蛋白，并作用于基因組。

圖3 lncRNA招募各種細胞調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)基因的表達[11]

3 討 論

盡管CRISPR-Cas9系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛地應用于基因組編輯技術中，但這項技術也存在著一定的缺陷：脫靶效應。在人類細胞中，當存在著5個堿基錯配的情況下，Cas9仍能實行切割功能[17]。在這個系統(tǒng)中，sgRNA是決定特異性的重要因素。Hsu[18]等人認為，在設計sgRNA時，在位點決定性的8-12bp內(nèi)，至少有兩個堿基發(fā)生錯配。

近年來，RNAi技術被廣泛使用于基因敲除技術，但RNAi只能作用于mRNA，編碼mRNA的DNA只占總DNA的小部分，因此RNAi的適用范圍不大。另外，從細菌中發(fā)現(xiàn)的天然DNA結(jié)合域(DNA-binding domain，DBDs)也常被用于招募轉(zhuǎn)錄因子。人工合成的DBDs(如ZFs和TALENs)能夠精確地控制靶向基因的轉(zhuǎn)錄水平，但此技術耗時較長，脫靶現(xiàn)象以及載體的未知毒性嚴重阻礙了這種技術的發(fā)展[12]。因此，龐大的sgRNA數(shù)據(jù)庫及其可靠的、天然的調(diào)控機制使得CRISPR-dCas9技術更具有競爭力，CRISPR-Cas9系統(tǒng)不論在功能缺失還是功能獲得篩選中，都表現(xiàn)出更高水平的有效性和可靠性。與RNAi和DBDs技術相比，CRISPR-dCas9系統(tǒng)可以靶向編碼序列和調(diào)控元件，包括啟動子、增強子和轉(zhuǎn)錄microRNAs和長非編碼RNAs的元件。這一強大的遺傳工具的應用，無疑將大大加速生命領域的各項機理發(fā)現(xiàn)。南京大學的杜憶南等人在人源的tet-on MAVS轉(zhuǎn)基因293T細胞系中，利用dCas9/sgRNA靶向結(jié)合NF-κB、IRF3/7和cJun/ATF2轉(zhuǎn)錄因子在IFNB1啟動子區(qū)的順式作用元件，競爭性的阻止了轉(zhuǎn)錄因子對其的結(jié)合，達到阻斷信號通路的目的，首次證明了CRISPR-dCas9技術可用于內(nèi)源順式作用元件的功能注釋[19]。

另外，CRISPR-dCas9系統(tǒng)的應用對于人類疾病的研究也有至關重要的作用。研究證實，93%的與性狀變異相關的疾病都存在蛋白編碼區(qū)域以外的基因表達異常[20]。因此，利用CRISPR-dCas9系統(tǒng)對基因的異常表達和非編碼RNA進行改造有利于后續(xù)的疾病研究工作。

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·名人名言·

大學的榮譽，不在它的校舍與人數(shù)；而在于它一代一代人的質(zhì)量。

——柯南特

The State of the Art of CRISPR-dCas9 System on Regulating Level of Gene Expression

LUOMin1，GUHua2

(1. Shanghai Kongjiang High School, Shanghai 200093, China;2. School of Life Science and Technology, Tongji University, Shanghai 200092, China)

CRISPR-Cas9 system has been widely considered as a promising genome editing technology in molecular biology research. The engineered dCas9 protein by inactivating RuvC and HNH nuclease domains of Cas9 protein plays a role in gene expression regulation. Researchers manipulated the structures of gRNA that can attract RNA binding proteins which fuse to different transcription factors for the purpose of activating or inhibiting gene transcription. This paper reviewed the structure, function, mechanism and current progress of CRISPR-dCas9 system in gene expression regulation.

CRISPR； dCas9； gRNA； SAM

2015-12-05

國家自然科學青年基金(81402399)項目資助

羅 旻(1998-)，女，湖北宜昌人，高中學生，研究興趣：生物信息技術。E-mail:luomin_kj@sina.com

顧 華(1974-)，女，江蘇吳縣人，博士，講師，研究方向：抗腫瘤和自身免疫疾病的生物醫(yī)藥開發(fā)。

Q-7

A

1006-7167(2016)03-0020-04