張永紅, 朱 峰, 唐芬芬, 邵榆嵐, 于 濱, 白興榮*

1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所, 云南 蒙自 661101;2.西南大學(xué), 家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400715

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家蠶云7ASericin1基因啟動(dòng)子克隆及活性分析

張永紅1, 朱 峰1, 唐芬芬1, 邵榆嵐1, 于 濱2, 白興榮1*

1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所, 云南 蒙自 661101;2.西南大學(xué), 家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400715

家蠶Sericin1基因(Ser1)是中部絲腺特異表達(dá)基因，其啟動(dòng)子在家蠶生物反應(yīng)器研究方面發(fā)揮著重要作用。為了解云南家蠶品種云7Ser1基因上游調(diào)控序列存在的多態(tài)性，進(jìn)而獲得具有驅(qū)動(dòng)活性的Ser1啟動(dòng)子序列，克隆了家蠶Ser1基因啟動(dòng)子并進(jìn)行序列分析，構(gòu)建了由該基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)紅色熒光蛋白基因DsRed的表達(dá)載體pBac[Ser1p-DsRed-SV40+A3-EGFP]，轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)來(lái)驗(yàn)證啟動(dòng)子活性。該啟動(dòng)子同已報(bào)道Ser1基因上游調(diào)控序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，順式作用元件區(qū)域高度保守，而其他區(qū)域存在422 bp的堿基缺失；Ser1基因上游調(diào)控序列中存在啟動(dòng)子TATA框和CAAT框分別位于-24～-30處和-112～-115處，其中TATA框的保守序列是TATAAAA；而啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的DsRed基因在BmN細(xì)胞和中部絲腺中成功表達(dá)。結(jié)果表明云南家蠶品種Ser1上游調(diào)控序列存在多態(tài)性和驅(qū)動(dòng)活性，為了解不同家蠶品種絲膠合成能力差異和獲得高效啟動(dòng)子奠定了基礎(chǔ)。

家蠶；Ser1基因；啟動(dòng)子；活性分析

家蠶(Bombyxmori) 是一種重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，更是經(jīng)典遺傳學(xué)研究的模式生物之一。家蠶幼蟲(chóng)絲腺分前、中、后3部分，中部絲腺主要合成絲膠蛋白(sericin)，后部絲腺合成絲心蛋白(fibroin)，而前部絲腺組裝兩根絲腺的絲膠和絲心蛋白單絲吐出，絲腺作為一種特殊器官具有大量合成和分泌絲蛋白的能力[1]。家蠶幼蟲(chóng)5齡起至上簇期間，能夠合成大量的絲膠蛋白，表達(dá)的絲膠蛋白容易純化且成分相對(duì)單一，正因如此家蠶絲腺可作為良好的生物反應(yīng)器[2]。不同家蠶品種合成和分泌絲膠蛋白的能力存在差異，研究基因的上游調(diào)控序列對(duì)優(yōu)化家蠶生物反應(yīng)器具有重要的理論和實(shí)踐意義。

家蠶絲蛋白由絲心蛋白和絲膠蛋白組成，絲心蛋白又稱(chēng)絲素蛋白，絲膠層附著絲素層，約占繭層質(zhì)量的25%，對(duì)絲素起到保護(hù)和膠粘作用。編碼絲膠蛋白的相關(guān)基因有Ser1、Ser2、MSGS3、MSGS4和MSGS5[3]，其中Ser1基因是絲膠蛋白的主要表達(dá)基因且是目前研究最為詳細(xì)的基因[4]，Ser1基因的全長(zhǎng)為24 kb，由9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成, 該基因轉(zhuǎn)錄后可形成4種不同長(zhǎng)度的轉(zhuǎn)錄本：Ser1A(2.6～2.8 kb)、Ser1B(4 kb)、Ser1C(10.5 kb)和Ser1D(9 kb)[5]。Ser1基因?yàn)榧倚Q中部絲腺特異表達(dá)基因[6]，啟動(dòng)子核心區(qū)域由轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(A，+1)和上游的TATA box(-30 TATAAAA -24) 組成，啟動(dòng)子序列中存在3個(gè)特異性蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)：SA(-103～-85)、SB(-149～-135)和SC(-204～-183)[7]，其中SA位點(diǎn)能被絲腺因子SGF1識(shí)別，SGF1參與Ser1基因在中部絲腺的特異性轉(zhuǎn)錄[8]，SB和SC被SGF3因子識(shí)別[9]；不同家蠶品種Ser1基因上游調(diào)控序列存在差異，啟動(dòng)子核心區(qū)域高度保守[10]，利用家蠶生物反應(yīng)器表達(dá)的有用蛋白中，Ser1基因啟動(dòng)子得到成功運(yùn)用，人血清白蛋白(human serum albumin)[11]、人腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(hBDNF)[12]、蜘蛛大壺狀腺絲蛋白1(MaSp1)[13]、人體脂聯(lián)素(human adiponectin)[14]等蛋白在家蠶中部絲腺特異表達(dá)。

家蠶品種云7A作為云南蠶區(qū)選育的優(yōu)良品種，該品種與大造的繭層率分別為26.06%[15]、12.919%[16]，它具有體質(zhì)強(qiáng)健、經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良等突出特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)該品種作為生物反應(yīng)器具有重要的科研價(jià)值。本研究克隆了Ser1基因上游調(diào)控序列，分析調(diào)控序列同已報(bào)道序列是否存在核苷酸多態(tài)性，并驗(yàn)證其驅(qū)動(dòng)活性。在克隆Ser1基因上游調(diào)控序列的基礎(chǔ)上，對(duì)該啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)活性進(jìn)行了初步研究，為云南本土家蠶品種絲腺組織高效表達(dá)外源蛋白提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

家蠶品種云7A由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所資源室提供；家蠶卵巢BmN細(xì)胞、帶有紅色熒光蛋白基因(DsRed)的pBac[3×P3-DsRed afm]、綠色熒光蛋白基因(EGFP)的pBac[A3-EGFP afm]和帶有猴空泡病毒SV40的加尾信號(hào)序列的pSL[IE1p-pGH-SV40 polyA]質(zhì)粒由家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室微生物分室李春峰副教授饋贈(zèng); TC-100細(xì)胞培養(yǎng)基、FBS、Lipofectin試劑等為Invitrogen公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、PCR相關(guān)試劑、膠凝膠回收試劑盒等購(gòu)于寶生物(大連)有限公司。

1.2 家蠶基因組DNA的提取

將適量家蠶品種組織用液氮充分研磨，研磨后加到含1 mL基因組抽提液(10 mmol/L Tris-Cl，pH 8.0；0.1 mol/L EDTA，pH 8.0；0.5% SDS)的離心管中并加入蛋白酶K，55℃水浴消化2 h；利用Tris平衡酚、酚:氯仿(1∶1)、酚:氯仿:異戊醇(25∶24∶1)、氯仿各抽提1次；無(wú)水乙醇沉淀基因組，70%乙醇洗滌DNA，沉淀溶于TE并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3Ser1基因上游調(diào)控序列的擴(kuò)增和克隆

根據(jù)已報(bào)道Ser1基因5′端上游序列(GenBank登錄號(hào)：AB007831.1)采用Primer 5.0(http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/index. html)設(shè)計(jì)引物(下劃線分別為EcoRⅠ和BamHⅠ的酶切位點(diǎn))：Ser1p-F(5′-GCGAATTCGTAAAAGCATAAGCGGTCAGAAAC-3′)，Ser1p-R(5′-GATCGGATCCGTCTTTGGATCGCTTGATCCTTAG-3′)。以家蠶云7A基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液(Mg2+Plus)5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，基因組模板1 μL，Ex-TaqDNA 聚合酶0.25 μL，加ddH2O至50 μL；反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；終止延伸72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收試劑盒純化，連接到pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用引物M13F/M13R擴(kuò)增驗(yàn)證陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性菌液送上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.4 序列分析

擴(kuò)增的Ser1基因上游5′端片段測(cè)序后用BioXM 2.6軟件(http://home.njau.edu.cn/～bioxm)進(jìn)行拼接和分析；使用ClustalX 2.0軟件對(duì)已報(bào)道和云7ASer1基因上游調(diào)控序列進(jìn)行多序列比對(duì)。

1.5DsRed基因瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)DsRed基因(JX088704.1)設(shè)計(jì)引物(F：5′-GCGGATCCATGGTGCGCTCCTCCAAG-3′，下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)；R：5′-GATCGCGGCCGCCTACAGGAACAGGTGGTG-3′，下劃線部分為NotⅠ酶切位點(diǎn))，質(zhì)粒pBac[3×P3-DsRed afm]為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系同1.3；含PCR產(chǎn)物連接至pMD19-T載體上；T-DsRed經(jīng)BamHⅠ與NotⅠ酶切后回收片段，載體pSL[IE1p-pGH-SV40]經(jīng)同樣酶切并回收較大片段，構(gòu)建成pSL[IE1p-DsRed-SV40]；將含Ser1p片段的T載體經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，而載體pSL[IE1p-DsRed-SV40]也經(jīng)相同酶切，構(gòu)建成含DsRed基因的pSL[Ser1p-DsRed-SV40]與pSL[IE1p-DsRed-SV40]的兩個(gè)表達(dá)盒，兩個(gè)載體經(jīng)AscⅠ酶切后回收Ser1p-DsRed-SV40與IE1p-DsRed-SV40片段，回收片段連接到pBac[A3-EGFP afm]載體中，最終構(gòu)建成pBac[Ser1p-DsRed-SV40+A3-EGFP]與pBac[IE1p-DsRed-SV40+A3-EGFP]瞬時(shí)表達(dá)載體(圖1)，其中pBac[IE1p-DsRed-SV40+A3-EGFP]載體作為陽(yáng)性對(duì)照。

圖1 瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建圖譜Fig.1 Construction map of instantaneous expression vector.A：IE1p-DsRed; B：Ser1p-DsRed

1.6Ser1基因啟動(dòng)子活性驗(yàn)證

細(xì)胞轉(zhuǎn)染驗(yàn)證啟動(dòng)子活性。準(zhǔn)備BmN細(xì)胞、瞬時(shí)表達(dá)載體A3-EGFP、IE1p-DsRed、Ser1p-DsRed，以不含DsRed基因的A3-EGFP載體作為陰性對(duì)照，IE1p-DsRed作為陽(yáng)性對(duì)照。按照Invitrogen公司脂質(zhì)體(CellfectionRII Reagent)轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)將其轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，將1×106cells/mL BmN細(xì)胞鋪于35 mm培養(yǎng)皿或六孔板中，貼壁培養(yǎng)過(guò)夜；用1～2 mL無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基(TC-100)洗滌3次，加1 mL無(wú)血清培養(yǎng)基備用；5 μL Lipofection、200 ng 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒與45 μL無(wú)血清培養(yǎng)基混勻，再加入50 μL無(wú)血清培養(yǎng)基充分混勻，室溫靜置20～30 min；將上述混合液逐漸加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，邊加邊搖，27℃溫育5 h，棄共轉(zhuǎn)染液，加2 mL完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d；培養(yǎng)過(guò)程中在倒置顯微鏡下觀察紅色熒光并拍照。

家蠶蠶體驗(yàn)證啟動(dòng)子活性。準(zhǔn)備2.5 μg構(gòu)建好的瞬時(shí)表達(dá)載體與2.5 μL Lipofection混合，用ddH2O補(bǔ)至10 μL，注射五齡家蠶腹部。注射24 h后解剖絲腺，通過(guò)熒光顯微鏡觀察熒光情況。

2 結(jié)果與分析

2.1Ser1啟動(dòng)子克隆及序列分析

以家蠶云7A基因組為模板，Ser1啟動(dòng)子特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約650 bp大小的條帶(圖2)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果得知，在特定的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)，家蠶云7ASer1基因啟動(dòng)子序列大小為643 bp，該啟動(dòng)子存在真核生物啟動(dòng)子的特征保守序列TATA box和CAAT box，同已報(bào)道家蠶kinshuSer1基因啟動(dòng)子(AB007831.1)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因上游調(diào)控序列存在422 bp的缺失(圖3)，Ser1基因啟動(dòng)子的核心區(qū)域位于基因的上游約200 bp內(nèi)，該區(qū)域發(fā)生缺失，會(huì)降低啟動(dòng)子的活性[9]，而該區(qū)域內(nèi)高度保守。

圖2 家蠶云7A Ser1啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of PCR product of silkworm Yun 7A.M：DL2 000 Marker；1：Ser1p PCR產(chǎn)物

2.2DsRed瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建

重組載體IE1p-DsRed、Ser1p-DsRed經(jīng)PCR和NotⅠ限制性內(nèi)切酶驗(yàn)證構(gòu)建成功(圖4)，其中載體IE1p-DsRed用DsRed基因上下游引物擴(kuò)增和NotⅠ進(jìn)行酶切，分別獲得1 385 bp、2 625 bp大小的條帶(圖4A)；載體Ser1p-DsRed用DsRed基因上下游引物和NotⅠ酶切驗(yàn)證，分別獲得了1 362 bp和2 595 bp大小的條帶(圖4B)。

2.3Ser1基因啟動(dòng)子活性驗(yàn)證

瞬時(shí)表達(dá)載體A3-EGFP、IE1p-DsRed、Ser1p-DsRed轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞24 h后觀察熒光，其中陰性對(duì)照A3-EGFP、陽(yáng)性對(duì)照IE1p-DsRed、驗(yàn)證載體Ser1p-DsRed均帶有綠色熒光蛋白EGFP篩選標(biāo)記，在熒光顯微鏡下都觀察到綠色熒光(圖5-A1、A2、A3,彩圖見(jiàn)圖版三)，載體IE1p-DsRed與Ser1p-DsRed在熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光(圖5-B1、B2、B3)。

圖3 家蠶云7A與Kinshu Ser1基因上游調(diào)控序列比對(duì)Fig.3 Alignment of upstream regulation sequence of Ser1 gene from Yun 7A and Kinshu.Ser1p1：云7A Ser1p；Ser1p2：Kinshu Ser1p；虛線下劃線：CAAT box；下劃線：TATA box，SA、SB和SC蛋白結(jié)合位點(diǎn)；方框：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。

圖4 IE1p-DsRed與Ser1p-DsRed載體PCR和酶切驗(yàn)證Fig.4 Verification of PCR amplication and enzyme digestion of IE1p-DsRed and Ser1p-DsRed vector.M：DL 2 000 Marker；A1：IE1p-F/DsRed-R PCR產(chǎn)物；A2：NotⅠ酶切產(chǎn)物；B1：Ser1p-F/DsRed-R PCR產(chǎn)物；B2：NotⅠ酶切產(chǎn)物

將瞬時(shí)表達(dá)載體注射家蠶后48 h，解剖出絲腺、脂肪體和中腸組織，置于熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示(圖6-B3，彩圖見(jiàn)圖版三)在中部絲腺處可觀察到明顯紅色熒光，而注射ddH2O的對(duì)照組未觀察到紅色熒光(圖6-B1)。根據(jù)瞬時(shí)表達(dá)載體在BmN細(xì)胞和蠶體中表達(dá)情況，充分說(shuō)明該上游調(diào)控序列是具有驅(qū)動(dòng)活性的啟動(dòng)子序列，且DsRed基因在中部絲腺特異表達(dá)。

圖5 瞬時(shí)表達(dá)載體Ser1p-DsRed在家蠶BmN細(xì)胞中的表達(dá)Fig.5 Transient expression of recombinant vector Ser1p-DsRed in BmN cell.注：A組：綠色熒光視野；B組：紅色熒光視野；A1、B1：陽(yáng)性對(duì)照組； A2、B2：實(shí)驗(yàn)組； A3、B3：陰性對(duì)照組。(彩圖見(jiàn)圖版三)

3 討論

Ser1基因啟動(dòng)子是家蠶生物反應(yīng)器中的高效啟動(dòng)子，它一直是科研工作者關(guān)注的熱點(diǎn)。本研究獲得了家蠶品種云7ASer1基因上游調(diào)控序列，通過(guò)序列分析它具有真核生物基因啟動(dòng)子TATA box和CAAT box的特征序列，通過(guò)DsRed基因細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)說(shuō)明該序列有驅(qū)動(dòng)活性。不同家蠶品種、野桑蠶間Ser1基因上游調(diào)控序列存在多樣性[17]，可能是不同家蠶品種合成絲膠蛋白的

圖6 瞬時(shí)表達(dá)載體Ser1p-DsRed在家蠶中部絲腺中的表達(dá)Fig.6 Transient expression of recombinant vector Ser1p-DsRed in the middle silkgland of silkworm.注：A組：白光視野；B組：紅色熒光視野；A1、B1：ddH2O對(duì)照組； A2～A6、B2～B6：Ser1p-DsRed瞬時(shí)表達(dá)組。(彩圖見(jiàn)圖版三)

重要因素。啟動(dòng)子序列中-1602～+47區(qū)域?yàn)榻閷?dǎo)Ser1基因在家蠶中部絲腺特異表達(dá)的區(qū)域[18]，Ser1上游序列的比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，家蠶品種云7A同已報(bào)道序列存在422 bp的缺失，其中420 bp的缺失發(fā)生在-260～-680處，研究發(fā)現(xiàn)，已報(bào)道Ser1上游調(diào)控序列為發(fā)生缺失的區(qū)域內(nèi)存在Helitron、Bmhel-8轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子，其中Bmhel-8對(duì)啟動(dòng)子具有增強(qiáng)活性，與基因在中部絲腺特異表達(dá)無(wú)關(guān)[19]，家蠶云7A上游序列發(fā)生Bmhel-8因子的缺失，啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)活性較已報(bào)道啟動(dòng)子是否有所下降還有待驗(yàn)證。啟動(dòng)子序列中存在3個(gè)特異性蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)SA、SB和SC，絲腺因子SGF1與SA結(jié)合調(diào)控Ser1基因特異性轉(zhuǎn)錄，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)高度保守，這也暗示了兩個(gè)家蠶品種在Ser1基因轉(zhuǎn)錄方面可能具有相似的時(shí)空特異性。

家蠶核型多角體病毒BmNPV IE1啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)熒光素酶基因在家蠶細(xì)胞和幼蟲(chóng)中表達(dá)，為組成型啟動(dòng)子[20]，再者DsRed蛋白無(wú)需任何輔助因子或底物參與進(jìn)而作為良好的篩選標(biāo)記，因此該研究構(gòu)建IE1p-DsRed-SV40表達(dá)盒作為陽(yáng)性對(duì)照，IE1p-DsRed、Ser1p-DsRed瞬時(shí)表達(dá)載體在家蠶卵巢BmN細(xì)胞中觀察到了紅色熒光；BmN細(xì)胞是來(lái)源于家蠶的卵巢細(xì)胞系，缺乏絲腺專(zhuān)一的轉(zhuǎn)錄活化因子SGF1，但在細(xì)胞內(nèi)也能檢測(cè)到紅色熒光，DsRed也能在家蠶中部絲腺瞬時(shí)表達(dá)，充分說(shuō)明本研究獲得的Ser1基因的上游調(diào)控序列具有啟動(dòng)活性。瞬時(shí)表達(dá)載體IE1p-DsRed、Ser1p-DsRed中均含有A3-EGFP-SV40的表達(dá)盒，視野下存在微弱而且稀少的綠色熒光細(xì)胞，IE1p-DsRed中觀察到較強(qiáng)的紅色熒光細(xì)胞。由于Ser1p為中部絲腺特異驅(qū)動(dòng)的啟動(dòng)子，所以在家蠶前部及后部絲腺均未發(fā)現(xiàn)紅色熒光。

家蠶生物反應(yīng)器中選擇高效的啟動(dòng)子至關(guān)重要，通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子來(lái)源、啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)能力的優(yōu)化等手段來(lái)提高目的基因的表達(dá)具有重大實(shí)踐意義，本研究獲得了家蠶品種云7ASer1啟動(dòng)子，充分利用云南蠶區(qū)的優(yōu)勢(shì)家蠶品種來(lái)表達(dá)具有應(yīng)用價(jià)值的基因，將對(duì)家蠶生物反應(yīng)器工程有巨大的推動(dòng)作用，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將目的基因整合到家蠶基因組中，進(jìn)而獲得高純度、安全、經(jīng)濟(jì)的目的蛋白。

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Cloning and Activity Analysis of Promoter ofSericin1 Gene fromBombyxmoriYun 7A

ZHANG Yong-hong1, ZHU Feng1, TANG Fen-fen1, SHAO Yu-lan1, YU Bin2, BAI Xing-rong1*

1.InstituteofSericultureandApiculture,YunnanAcademyofAgriculturalScience,YunnanMengzi661101,China;2.StateKeyLaboratoryofSilkwormGenomeBiology,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China

Sericin1 gene (Ser1) of silkworm (Bombyxmori) is specifically expressed in middle silkgland, its promoter plays an important role in silkworm bioreactor. In order to learn polymorphisms of upstream regulation sequence ofSer1 gene from silkworm breed Yun 7A, we obtainedSer1 promoter sequences that had driver activity,Ser1 promoter sequence was cloned and then analyzed, the expression vector of pBac [Ser1p-DsRed-SV40+A3-EGFP] containedDsRed(red fluorescent protein gene)was driven bySer1 promoter, the vector was transferred to BmN cells to verify the promoter activity through transient transfection expression assay. Sequence alignment showed thatciselement area had been highly conservative between upstream regulation sequence of reportedSer1 andSer1 promoter sequence of Yun 7A, the other area showed absence of the genetic phenomenon of 422 bp bases; there were conservative sequences of TATA box and CAAT box located at position -24～-30 and -112～-115 respectively, the sequences of TATA box was TATAAAA; the promoter ofSer1 could driveDsRedgene, the transiently expression products could be observed successfully in the cultural BmN cells and middle silkgland. The polymorphism and driver activity ofSer1 upstream regulation sequence from Yunnan silkworm breed were analyzed in this study, so as to lay the foundation for understanding the ability difference of sericin synthetic in the different silkworm breeds and acquiring the efficient promoter.

Bombyxmori;Ser1 gene; promoter; activity analysis

2016-08-10; 接受日期：2016-09-27

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260583)；云南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)蠶桑產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(2013KJ-TX006)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)(CARS-22)資助。

張永紅，研究實(shí)習(xí)員，碩士研究生，主要從事家蠶病理研究。E-mail:zhang200503@126.com。*通信作者：白興榮，研究員，主要從事家蠶遺傳育種和家蠶病原微生物病理研究。E-mail:bxrong3@163.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.06.09