婁婷婷，趙婷，溫華蔚，鄭文杰

（天津出入境檢驗檢疫局，天津300461）

嬰兒食品中牛磺酸含量測定及其不確定度分析

婁婷婷，趙婷，溫華蔚，鄭文杰

（天津出入境檢驗檢疫局，天津300461）

利用高效液相色譜法測定嬰幼兒食品中?；撬岬暮坎⒏鶕?jù)《化學(xué)分析測量不確定度評定》和《測量不確定度評定與表示》中的有關(guān)規(guī)定對其進行測量不確定度的分析評估，最后進行標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成以及計算其擴展不確定度；嬰幼兒食品中?；撬釞z測結(jié)果為（33.85±0.94）mg/100g，k＝2，p＝95%，最低檢出限為0.016 5mg/100 g。

?；撬?；不確定度；嬰幼兒食品

?；撬幔═aurine）即β-氨基乙磺酸，又稱牛膽堿、牛膽素，在動物組織中主要以游離形式存在，是一種非蛋白質(zhì)形式的氨基酸，為嬰幼兒生長發(fā)育過程中至關(guān)重要的營養(yǎng)素[1-2]。對嬰幼兒早期大腦發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、視力發(fā)育以及鈣質(zhì)的吸收等具有非常重要的作用[3]。嬰幼兒體內(nèi)合成?；撬岬拿赶瞪形闯墒?，因此奶粉中添加接進母乳水平的?；撬崮苡行ПＵ蠇胗變旱纳眢w發(fā)育[4]。此外，牛磺酸具有特殊的生理功能，提高免疫力、緩解疲勞、調(diào)節(jié)神經(jīng)傳導(dǎo)以及抗病毒等生物活性[5]。但是補充過量的牛磺酸對身體健康則可能抑制體內(nèi)其它營養(yǎng)元素的吸收，因此我國及歐盟等均規(guī)定嬰幼兒食品中牛磺酸的含不高于3mg/100 kJ[6-7]。因此，分析測定嬰幼兒食品中?；撬岬暮繉τ谠u價嬰幼兒食品的營養(yǎng)品質(zhì)是非常有必要的。

目前，國內(nèi)外測定?；撬嶂饕椒ㄓ械味ǚ╗8]、比色法[9]、氨基酸自動分析法及高效液相色譜法[10]等。滴定法和比色法容易受到其他氨基酸的干擾，誤差相對較大；氨基酸自動分析法因價格昂貴限制使用范圍；高效液相色譜法因精確度、靈敏度較高，樣品處理比較簡單，能夠快速進行樣品分析而被廣泛地應(yīng)用。高效液相色譜法有柱前衍生和柱后衍生法，后者需要柱后衍生器等專用設(shè)備。鑒于以上測定方法優(yōu)缺點，本試驗采用柱前衍生法，以丹磺酰氯作為衍生試劑，來測定嬰幼兒蔬果輔食泥中?；撬岷?，并針對高效液相色譜法（HPLC）測定乳制品中?；撬岷康姆椒╗11]GB 5413.26-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中?；撬岬臏y定》，根據(jù)JJF 1135-2005《化學(xué)分析測量不確定度評定》和JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[12]中的有關(guān)規(guī)定對嬰幼兒輔食中?；撬岷繙y定的不確定度進行分析，為保證測定測量結(jié)果的可靠性和科學(xué)性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設(shè)備

?；撬針?biāo)準(zhǔn)品：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH；乙腈（色譜純）：迪馬科技公司；無水乙醇；丹磺酰氯（分析純）：Sigmaaldrich公司。

Waters高效液相色譜儀配2998紫外檢測器：美國Waters公司；C18色譜柱（4.6mm×250mm×5m）：迪馬科技；純水儀；分析天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；臺式高速離心機：德國Eppendorf公司。

1.2 樣品預(yù)處理

1.2.1 樣品制備

參考GB 5413.26-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中牛磺酸的測定》中前處理的方法，稱取待測樣品約2.0 g（精確到0.01 g）于50mL容量瓶中，加入40mL溫水溶解，充分混勻，置超聲波振蕩器上振蕩10min，冷卻到室溫。加1.0mL乙酸鋅溶液沉淀劑，渦旋混合后，加入1.0mL，渦旋混合，用水定容至50mL，充分混勻，試液于5 000 r/min下離心5min，取上清液備用。

1.2.2 柱前衍生

將上述上清液1mL加入到試管中，加1mL碳酸鈉緩沖液和1mL丹磺酰氯溶液，充分渦旋混合，在室溫下避光反應(yīng)2 h進行衍生（反應(yīng)過程中要搖晃幾次），然后加入0.1mL鹽酸甲胺溶液渦旋混合用來終止反應(yīng)，混合液靜置避光，沉淀完全后，取上清液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，取濾液備用。衍生物在4℃可避光保存48 h。另取一系列標(biāo)準(zhǔn)工作液各1mL，與待測試液同步進行衍生。

1.3 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（4.6mm×250mm×5m）。

流動相：乙酸鈉緩沖液（pH4.2）（10mmol/L）。稱取1.36 g乙酸鈉，加800mL水溶解，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至4.2，用水定容到1000 mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾。

流量：1.0mL/min；檢測波長：245nm；進樣量：10μL；柱溫：35℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 波長選擇

?；撬崤c單磺酰氯反應(yīng)生成的衍生物在254 nm處有最大吸收峰，采用254 nm為測定波長。

2.2 流動相配比選擇

選用乙腈與10mmol/L的乙酸鈉作為流動相，試驗證明在流速為1mL/min，隨著流動相中乙腈比例的增加，牛磺酸的出峰時間明顯提前，乙腈-0.01mol/L乙酸鈉70∶30（體積比）的流動相出峰時間為6min左右，分離效果最佳，選擇體積比為70∶30（體積比）的乙酸鈉-乙腈緩沖液作為流動相。

2.3 工作曲線

分別配置濃度為為 0、0.2、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0μg/mL?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液，進行HPLC分析，每種濃度測定2次，取平均峰面積，以?；撬岬臐舛扰c色譜峰面積來繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，所得線性回歸方程為y= 19 143x+1227，R2=0.999 7，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及各濃度疊加色譜圖見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Calibration curvesand thespectra of standard solutionsof taurine

所有標(biāo)準(zhǔn)溶液以及待測樣品的衍生化反應(yīng)時間應(yīng)保持一致。

2.4 含量計算公式

式中：X為待測樣品中?；撬岬暮?，mg/100g；c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的樣品濃度，mg/L；m為稱取樣品的質(zhì)量，g；V為待測樣品溶液體積，mL。

3 不確度評定

3.1 不確定度的來源

測定的不確定度主要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、樣品峰面積的積分、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的擬合、樣品稱量、定容體積、樣品前處理操作過程等幾個方面引入的。使用方法回收率表征方法偏倚和反復(fù)性，將其他分量歸并成實驗室偏倚分量，它們都會對測定結(jié)果的不確定度產(chǎn)生影響。

3.2 不確定度分量的計算

3.2.1 由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對不確定度

3.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對不確定度

根據(jù)?；撬針?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書提供的信息，其不確定度為0.5%，包含因子k＝2，屬B類評定，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制過程引起的不確定度

1）稱量過程中引入的不確定度

用最小刻度值為0.01mg的電子天平稱取待測樣品，其重復(fù)性已包含于回收試驗中，校準(zhǔn)天平過程中引入了獨立的不確定度分量。根據(jù)電子天平計量檢定證書提供的信息，其允許誤差極限為±0.01mg，該不確定度按均勻分布考慮，包含因子，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度可用下式計算

標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制的過程是精確稱取100.00mg牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，稱標(biāo)樣量為0.100 00 g，則其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2）配制校準(zhǔn)溶液過程中由玻璃器皿體積校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度

按照J(rèn)JG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[13]的要求，該過程使用的玻璃容器，均有相應(yīng)的最大容量允差，按矩形分布考慮，k＝。試驗中采用的100mL容量瓶（A級），按檢定證書給定其最大允許誤差為±0.10mL，按照矩形分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

其標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3）穩(wěn)定引起的玻璃器皿的不確定度

實驗室的溫度在（20±4）℃變化，20℃玻璃膨脹系數(shù)為2.5×10-5/℃，水體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，容量瓶校準(zhǔn)溫度與使用溫度不同引起的的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

由以上合成得出

因此，標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制過程的相對不確定度：

3.2.1.3 配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液過程中產(chǎn)生的不確定度評定

由牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋得到一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在配制標(biāo)準(zhǔn)工作液過程中使用的一系列玻璃量具，均有相應(yīng)的最大允差，按照J(rèn)JG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》的要求，按照矩形分布考慮，取，相對不確定度分量見表1。

表1 玻璃容器的不確定度分量Table1 Uncertainty of glassapparatus

合成不確定度為

表2 溶液配制過程中由溫度變化引起的不確定度Table2 Uncertainty of tem perature change during the p reparation of thesolution

合成的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程產(chǎn)生的不確定度評定合成為

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的相對不確定度

分別配置濃度為為0.2、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0μg/mL?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液，進行HPLC分析，每種分析測定2次，則自由度n=12，擬合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和峰面積曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)表Table3 Data of calibration curves

續(xù)表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)表Continue table3 Data of calibration curves

?；撬岬臐舛扰c色譜峰面積之間回歸方程為y= 19 143x+1 227，R2=0.999 7，其中b=19 143，a=1 227，

其中標(biāo)準(zhǔn)曲線的殘余偏差SR為：

則由擬合曲線產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度利用以下公式計算：

3.2.3 重復(fù)測定引入的不確定度

樣品經(jīng)測定6次后，峰面積分別為254404、251739、245 189、256 907、286 589、268 179。計算得到樣品溶液中牛磺酸的平均質(zhì)量濃度為13.54μg/mL。

樣品溶液峰面積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按貝塞爾公式計算：

3.2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作液與樣品液峰面積比的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)工作液與樣品液峰面積的重復(fù)性已包含于回收率的不確定度中，峰面積的偏倚主要由HPLC的校準(zhǔn)過程引入。根據(jù)HPLC的校準(zhǔn)證書，其衰減期的相對誤差為0.8%，按照均勻分布處理，峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則峰面積比的不確定度為：

3.2.5 前處理回收率

由于樣品前處理不完全或處理過程中導(dǎo)致?lián)p失或污染等，將使?；撬岵荒?00%進入到測定液中，通過對待測樣品添加標(biāo)準(zhǔn)溶液來計算回收率，單獨6次樣品添加回收率的結(jié)果分別為104.0%、95.7%、108.1%、103.2%、98.3%、106.2%。平均回收率為r= 102.6%，標(biāo)準(zhǔn)偏差s為0.046 060 2，根據(jù)A類評定，采用平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差來計算標(biāo)準(zhǔn)不確定度，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度如下式表示：

相對不確定度為：

3.3 樣品進樣引入的不確定度

3.3.1 稱樣量的不確定度評定

稱量使用的電子天平經(jīng)計量合格，根據(jù)檢定證書，其最大允許誤差±0.01mg，其置信水平99%，按正態(tài)分布考慮，包含因子k=3，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

樣品稱樣量為2.00 g，則其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.3.2 進樣引入的不確定度

HPLC進樣采用的是微量進樣器（根據(jù)證書，其為不確定度1%），按均勻分布考慮，B類評定，進樣引入的相對不確定度分量為：

3.3.3 進樣量的不確定度

采用同一進樣器進行等體積進樣，而這兩個體積量并沒有體現(xiàn)在被測量的計算公式中，但實際上是使用了兩個體積量的比值，而且兩者之間存在正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)實驗室的溫度變化不大時，可以認(rèn)為其不確定度近似相等，因此可以認(rèn)為對不確定度沒有貢獻。

3.4 由分析儀器引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

根據(jù)計量檢定證書，采用的HPLC儀器的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為3%。由進樣引起的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.5 相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

根據(jù)以上計算結(jié)果，利用此方法測定的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度可用下式進行計算：

3.6 擴展不確定度

依據(jù)JJF 1135-2005《化學(xué)分析測量不確定度評定》[14]，本試驗可采用置信概率p＝95%、包含因子k=2進行計算，則擴展不確定度為：

3.7 樣品的測定

對樣品進行相應(yīng)的前處理，得到的待測樣品溶液按照上述的分析方法進行HPLC檢測，記錄待測樣品中相應(yīng)的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，外標(biāo)法定量，經(jīng)測定，嬰兒輔食泥中?；撬岬暮繛椋?3.85±0.94）mg/ 100 g，k＝2，p＝95%。

4 結(jié)論

本試驗通過分析利用HPLC法測定樣品中?；撬岷康脑囼炦^程，對影響?；撬釡y定不確定度各分量進行評價，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合過程、樣品前處理過程等對不確定度貢獻相對較大，因此在試驗過程中應(yīng)在這幾方面注意控制，以進一步提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。經(jīng)測定，本試驗樣品中?；撬岬暮繛椋?3.85± 0.94）mg/100 g，k＝2，p＝95%。最低檢出限為0.016 5mg/ 100 g，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 7。本方法測定嬰幼兒食品中?；撬岬臐舛龋哂星疤幚聿僮骱啽?，檢測靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點，適合一般實驗室進行含量分析。

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Determ ination and Uncertainty Evaluation for Taurine in Infant Formula

LOU Ting-ting，ZHAOTing，WENHua-wei，ZHENGWen-jie
（Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

Amethod of high performance liquid chromatography was developed to detect taurine in infant food and uncertainty for determining taurine in infant formula food wasestablished to evaluate the uncertainty of determining taurineaccording to the relevant regulationsgiven inand.Finally，the standard uncertainty and the expanded uncertainty were achieved.The contentof taurine in infant food determined by HPLC was（33.85±0.94）mg/100 g，k＝2，p＝95%，the detection limitwas0.0165mg/100 g.

taurine；uncertainty；infant formula food

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.028

2015-12-23

天津檢驗檢疫局科技項目（TK079-2013,TK044-2013）

婁婷婷（1985—），女（漢），高級工程師，博士，研究方向：食品分析與檢測。