周志林，張 安，唐 君，曹清河，趙冬蘭，馬代夫,李宗蕓

(1.江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)部甘薯生物學(xué)與遺傳改良重點實驗室和，江蘇 徐州 221131；2.江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 徐州 221116)

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不同甘薯品種抗氧化脅迫鑒定及篩選

周志林1，2，張 安1，唐 君1，曹清河1，趙冬蘭1，馬代夫1,李宗蕓2

(1.江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)部甘薯生物學(xué)與遺傳改良重點實驗室和，江蘇 徐州 221131；2.江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 徐州 221116)

為建立一種適宜甘薯抗性材料快速初篩方法。以煙薯8號、商薯19等8個品種為試驗材料，分析不同品種的光氧化脅迫抗性、DPPH自由基清除活性等。結(jié)果表明：在甲基紫精(MV)介導(dǎo)的光氧化脅迫下，煙薯8號、商薯19、徐薯28的細胞膜穩(wěn)定較好，尤其煙薯8號其電解質(zhì)泄漏率最低，僅為處理前的1.6倍；光氧化脅迫下，商薯19的DPPH自由基清除活性最強，其次為煙薯8號和徐薯28；綜合表明：煙薯8號、商薯19、徐薯28具有較高的抗氧化活性。MV處理下，細胞膜穩(wěn)定性與DPPH自由基清除活性具有較高相關(guān)性(R2=0.841)。因此，可以利用MV處理下細胞膜穩(wěn)定性及DPPH自由基清除法對甘薯品種進行抗氧化能力的初步評價。

甘薯；抗氧化脅迫；甲基紫精；DPPH·

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所選試驗材料：商薯19(S19)、徐薯28(X28)、栗子香(LZX)、皖薯2(W2)、遺字138(Y138)、煙薯8(Y8)、惠雜6(H6)、湘雜9(X9)均來自國家種質(zhì)徐州甘薯試管苗庫。所有材料均定植于溫室15 cm直徑的花盆中，從頂部取第3片展開葉的葉盤為試驗材料。甲基紫精(MV)由Sigma公司生產(chǎn)。

1.2 細胞膜泄漏率的測定

取直徑為5 cm培養(yǎng)皿，每皿加0.4 %山梨醇水溶液10 mL，放置8 mm大小葉盤7個，在恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃暗培養(yǎng)12 h，測定滲出液的電導(dǎo)度(電導(dǎo)率儀 ISTEK 455C)為MV處理0 h的電導(dǎo)度，然后培養(yǎng)皿中加入1 μmol/L MV溶液50 μl，測定MV處理后12～72 h每12 h滲出液的電導(dǎo)度，最后滅菌鍋高溫處理，再測1次電導(dǎo)率，計算電解質(zhì)的泄露率(%)。詳細操作及計算方法參照Lim等[11]。

1.3 鹽脅迫下甘薯葉片光能轉(zhuǎn)化率的測定

用0.4的山梨醇基本溶液配置200 mM/L的NaCl溶液作為脅迫處理溶液，在5 mL培養(yǎng)皿中加入溶液10 mL，放置葉盤7個。25 ℃、光照處理72 h，測定光合活性(便攜式葉綠素熒光測定儀，Handy PEA, Hansatech)，具體測定及計算方法參照Raza等[12]。

1.4 清除DPPH·的能力

DPPH自由基清除試驗主要參照Padda和Picha[13](2008)，在此基礎(chǔ)上略有改動，取甘薯葉盤的甲醇提取液和0.5 mmol/L DPPH溶液按照1∶1比例混合，室溫，避光，分別在反應(yīng)0、15、30 min使用分光光度計在517 nm波長下測定光吸收值，抗氧化活性據(jù)已知標準進行計算，表達按照mgASA (Ascobic acid)/g FW(Fresh weight)，即mgASA·g-1FW。

2 結(jié)果與分析

2.1 MV處理對甘薯葉片細胞的影響

5 μmol/L MV溶液處理不同品種甘薯葉盤，隨著處理時間的增加，細胞膜的穩(wěn)定性受到了影響，電解質(zhì)的泄漏率逐漸增加(圖1)。較其它品種，栗子香(LZX)對MV處理反應(yīng)敏感，在處理的12～72 h，電解質(zhì)泄露率不斷增加，在72 h達到最大60.5 %，泄漏率為處理前的3.5倍，說明該品種對MV誘導(dǎo)的光氧化脅迫的抗性較弱。而煙薯8號(Y8)、商薯19(S19)相對其它品種細胞膜系統(tǒng)比較穩(wěn)定，雖然光氧化加劇了細胞膜的泄漏率，但是處理72 h后，這2個品種的膜泄漏率增高至處理前的1.6～1.8倍，其次為徐薯28(X28)為2.2倍，說明這些品種細胞膜比較穩(wěn)定，其耐光氧化性優(yōu)于其它品種。

2.2 鹽脅迫對甘薯葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

在200 mmol/L NaCl脅迫下，不同甘薯品種的Fv/Fm都有一定程度的下降(表1)。在細胞膜穩(wěn)定性的試驗中，耐光氧化的S19、Y8均表現(xiàn)一定程度的下降；不耐光氧化品種LZX下降的幅度稍微大一些。中間型的一些品種相對LZX下降幅度較小，規(guī)律性還不是很強。

2.3 光氧化作用下清除DPPH自由基的能力

對DPPH自由基清除活性的大小是評價植物總抗氧化能力的重要指標。光氧化處理前，各品種均具有較高清除DPPH自由基的活性，尤其Y8、S19和X28(圖2)。MV處理72 h后，各品種處理葉清除DPPH自由基的能力均下降，尤其LZX下降幅度比較大，其活性下降了約54 %，其次為W2,下降了31 %。DPPH自由基清除活性下降最小是S19，下降幅度為9 %，其次為Y8 12 %、X28 15 %。

Y8、W2、H6、S19、X9、Y138、LZX、X28分別代表煙薯8號、晥薯2號、惠雜6號、商薯19、湘雜9號、遺字138、栗子香、徐薯28圖1 MV處理下葉片細胞膜泄露率Fig.1 Relative ion leakage of cell membrane under MV treatment

表1 NaCl脅迫下甘薯葉片的葉綠素熒光參數(shù)

2.4 甘薯品種細胞膜穩(wěn)定性與抗氧化活性間的相關(guān)性

不同甘薯品種光氧化脅迫細胞膜穩(wěn)定性與DPPH自由基清除活性間具有較高相關(guān)性(R2=0.841)(圖3)。因此，可以測定MV誘導(dǎo)的光氧化脅迫下電解質(zhì)泄漏率對植物總抗氧化能力進行初步評價。

3 討論與結(jié)論

3.1 植物光氧化脅迫抗性是植物抗氧化能力評價的一種可行方法

作物在遭受到干旱、鹽堿、低溫、病蟲害等逆境脅迫時，都會因光合能力的下降而產(chǎn)生光氧化脅迫。MV作為一種良好的光氧化逆境的誘發(fā)劑，可以較好的模擬自然光氧化，用于植物的光氧化脅迫鑒定和研究[7]。在光氧化脅迫下，過氧化氫酶(CAT)活性的提高對于降低油菜光氧化脅迫，促進油菜高產(chǎn)可能起著重要作用[14]。耐光氧化性強的紫葉稻的細胞膜穩(wěn)定性較綠葉稻好，在光氧化脅迫下其細胞膜泄漏率增高的較低[15]。即耐逆性好的品種可以較好的抵御活性氧的傷害[16]。而本試驗中，低濃度MV處理后，Y8、S19的細胞膜穩(wěn)定性較好，其電解質(zhì)泄漏率增高幅度均大幅度低于其他品種；推測這兩個品種可能具有較高的抗氧化能力，應(yīng)對逆境脅迫具有較好抗性。

3.2 葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fm能否作為抗氧化評價的指標

葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fm不適宜田間條件下評估植物產(chǎn)生的光抑制與植物抗逆等的相關(guān)性，但可能適宜在室內(nèi)人工控制條件下，評估植物的抗氧化特性[17]。葉綠素熒光動力學(xué)在植物逆境生理研究中應(yīng)用較多，研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境脅迫的程度與植物體內(nèi)Fv/Fm受抑制程度呈顯著相關(guān)。并且Fv/Fm作為植物抗冷性的主要敏感指標，已應(yīng)用豇豆等植物的抗旱性鑒定[18]。但在本實驗中，在鹽脅迫下Fv/Fm比值有所下降，但是規(guī)律性還不是很強，雖然細胞膜穩(wěn)定性好的一些品種下降幅度較小，但是有一些品種仍然難以區(qū)分，可能需要下一步加大試驗材料的數(shù)量進一步探究該參數(shù)的可用性。

圖2 光氧化條件下各品種DPPH自由基清除活性Fig.2 DPPH radical scavenging activity of different sweetpotato varieties under MV treatment

3.3 DPPH清除自由基法評價植物抗氧化能力

DPPH法是一種重要的檢測天然植物提取物或化合物抗氧化活性的方法，操作簡單，重復(fù)性好[19]。本實驗針對MV處理材料，通過DPPH法評價其自由基清除活性；研究表明，S19在MV處理后其自由基清除活性下降了9 %，其次為Y8 12 %、X28 15 %，下降幅度均較低。推測這些品種較其它品種具有較高的抗氧化能力。尤其通過對細胞膜穩(wěn)定性和DPPH自由基清除活性間相關(guān)性分析表明，兩者之間具有較高相關(guān)性。因此，可據(jù)MV誘導(dǎo)的光氧化脅迫，進行細胞膜穩(wěn)定性和DPPH清除自由基活性分析，對甘薯抗氧化能力進行初步鑒定評價，下一步需加大試驗材料的數(shù)量，結(jié)合田間鑒定，完善這一室內(nèi)輔助鑒定評價甘薯抗氧化的方法。

圖3 不同甘薯品種細胞膜穩(wěn)定性與抗氧化活性間的相關(guān)性Fig.3 Relationship between ion leakage and antioxidant activities in different sweetpotato cultivars under MV-mediated oxidative stress

[1]彭長連，陳少薇，林植芳，等. 用清除有機自由基DPPH法評價植物抗氧化能力[J]. 生物化學(xué)與生物物理進展, 2000, 27(6): 658-661.

[2]謝小煥，趙 櫻，羅 薇，等. 不同甘薯品種苗期莖尖醇溶提取物清除DPPH·的行為特征差異[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013(2): 270-281.

[3]趙 櫻，謝小煥，傅玉凡，等. 甘薯苗期莖尖多酚含量對其DPPH·清除反應(yīng)的影響[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2015, 37(2): 39-45.

[4]傅茂潤，何志平，趙 雙，等. 柱前DPPH-HPLC-DAD-MS聯(lián)用快速鑒定紫薯中的抗氧化花色苷[J]. 食品工業(yè)科技, 2012(21): 125-129.

[5]胡楚嬌，王崇云，和兆榮，等. 基于DPPH法對紫莖澤蘭提取物抗氧化活性的研究[J]. 雜草科學(xué), 2013, 31(4): 9-12.

[6]周 游，宿宇婷，徐永健. 海馬骨粉酶解條件優(yōu)化及清除DPPH自由基能力測定[J]. 食品工業(yè)科技, 2015.

[7]林植芳，彭長連，林桂珠. 光氧化條件下碳代謝中間產(chǎn)物與光合電子傳遞對PSII光化學(xué)活性的調(diào)節(jié)作用[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報, 2005, 13(1): 1-7.

[8]曹樹青，徐巧婷，周紅軍，等. 利用氧化劑甲基紫精篩選擬南芥壽限延長突變體[J]. 實驗生物學(xué)報, 2003(3): 233-237.

[9]柯德森，徐志防，孫谷疇. 甲基紫精滴注法快速衡量香蕉抗氧化能力的初步試驗[J]. 園藝學(xué)報, 2003(3): 319-321.

[10]李維娜，李永光，蓋江南，等. 甲基紫精脅迫下轉(zhuǎn)GLP7基因大豆抗氧化性的初步分析[J]. 大豆科學(xué), 2013(2): 149-153.

[11]Lim S, Kim Y, Kim S, et al. Enhanced tolerance of transgenic sweetpotato plants that express both CuZnSOD and APX in chloroplasts to methyl viologen-mediated oxidative stress and chilling[J]. Molecular Breeding, 2007, 19(3): 227-239.

[12]Ahmad R, Kim M D, Back K, et al. Stress-induced expression of choline oxidase in potato plant chloroplasts confers enhanced tolerance to oxidative, salt, and drought stresses[J]. Plant Cell Reports, 2008, 27(4): 687-698.

[13]Padda M S, Picha D H. Effect of low temperature storage on phenolic composition and antioxidant activity of sweetpotatoes[J]. Postharvest Biology and Technology, 2008, 47(2): 176-180.

[14]李 俊，晁 贏，官春云，等. 甘藍型油菜幼苗對光氧化脅迫的生理響應(yīng)[J]. 中國油料作物學(xué)報, 2013(5): 551-556.

[15]彭長連，林植芳，林桂珠，等. 富含花色素苷的紫色稻葉片的抗光氧化作用[J]. 中國科學(xué)C輯:生命科學(xué), 2006(3): 209-216.

[16]王國莉，郭振飛. 甲基紫精對水稻不同耐冷品種葉綠素熒光參數(shù)的影響[J]. 武漢植物學(xué)研究, 2008(1): 81-86.

[17]陳貽竹，劉鴻先，黃林可，等. 不同角度水稻劍葉的葉綠素熒光習(xí)凡測定(簡報[J]. 植物生理學(xué)通訊, 1991, 27(2): 114-116.

[18]李國景，劉永華，吳曉花，等. 長豇豆品種耐低溫弱光性和葉綠素熒光參數(shù)等的關(guān)系[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2005(6): 359-362.

[19]韋獻雅，殷麗琴，鐘 成，等. DPPH法評價抗氧化活性研究進展[J]. 食品科學(xué), 2014(9): 317-322.

(責任編輯 李 潔)

Identification and Selection of Different Sweetpotato Cultivars in Response to Oxidative Stress

ZHOU Zhi-lin1,2，ZHANG An1，TANG Jun1，CAO Qing-he1，ZHAO Dong-lan1，MA Dai-fu1，LI Zong-yun2

(1. Xuzhou Institute of Agricultural Sciences of the Xuhuai District/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Sweetpotato，Ministry of Agriculture, Jiangsu Xuzhou 221121,China;2. School of Life Sciences,Jiangsu Normal University,Jiangsu Xuzhou 221116,China)

In order to establish a rapid method to screening resistant materials of sweetpotato,nine different varieties of sweetpotato were used as experimental material, and the DPPH radical scavenging activity and resistance to photooxidative stress of different cultivars were analyzed. The results showed that cell membrane stability of Yanshu8，Shangshu19，Xushu28 was better under MV-mediated photo-oxidative stress. Especially relative ion leakage of Yanshu8 is the lowest，only 1.6 times of contrast. Under photo-oxidative stress, the DPPH radical scavenging activity of Shangshu9 is the highest, followed by Yanshu8 and Xushu28.It is suggested that Yanshu8，Shangshu19，Xushu28 had higher antioxidant capacity. The cell membrane stability has higher correlation with the DPPH radical-scavenging activity under MV-mediated oxidative. In conclusion, the DPPH radical-scavenging activity and relative ion leakage under MV treat could be used to priliminary evaluation on the antioxidant capacity of different sweetpotato cultivars.

Sweetpotato; Antioxidative stress; Methyl viologen; DPPH·

1001-4829(2016)07-1521-04

10.16213/j.cnki.scjas.2016.07.005

2015-06-30

江蘇省自然科學(xué)基金面上項目(BK20131125)；國家甘薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-11-B-02)；農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物保護項目(2015NWB006)

周志林(1979-),男，山西孝義人，碩士，主要研究方向：甘薯種質(zhì)資源鑒定評價，E-mail：zhouzhilinting@163.com。

S531

A