邱 皓，董 靖，盧公標(biāo)，盧旻鵬△，曹春風(fēng)，王群波，張銘華△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院骨科,重慶 402160；2.山東省濟(jì)寧市人民醫(yī)院骨科 272011)

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T-CAM表面修飾n-HA/PA66復(fù)合骨修復(fù)材料修復(fù)兔橈骨骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究*

邱 皓1，董 靖1，盧公標(biāo)2，盧旻鵬1△，曹春風(fēng)1，王群波1，張銘華1△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院骨科,重慶 402160；2.山東省濟(jì)寧市人民醫(yī)院骨科 272011)

目的 探討T-CAM表面修飾納米羥基磷灰石/聚酰胺66(nano-hydroxyapatite/polyamide66,n-HA/PA66)復(fù)合骨修復(fù)材料修復(fù)兔橈骨中段骨缺損的療效。方法 選擇36只成年新西蘭大白兔，建立右橈骨中段1.5cm骨缺損模型后分為兩組：實(shí)驗(yàn)組植入T-CAM表面修飾n-HA/PA66復(fù)合骨修復(fù)材料；對照組植入n-HA/PA66。觀察術(shù)前，術(shù)后2、4、8、12周靜脈血堿性磷酸酶(ALP)值；術(shù)后4、8、12周每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死6只兔子，進(jìn)行X線片、大體標(biāo)本觀察、組織學(xué)等觀察橈骨骨缺損愈合情況。結(jié)果 所有兔子術(shù)后切口均一期愈合，無死亡，無體內(nèi)植入材料脫落。影像學(xué)及組織學(xué)結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組在術(shù)后4周就有新生骨組織，隨著時(shí)間的延長，實(shí)驗(yàn)組新骨生長速度和數(shù)量明顯優(yōu)于對照組，術(shù)后12周Lane-Sandhu法X線片和組織學(xué)評分實(shí)驗(yàn)組均高于對照組(P<0.05)；術(shù)后2周實(shí)驗(yàn)組ALP值開始升高，隨著時(shí)間的推移，兩組ALP值均升高，術(shù)后8周達(dá)最高峰，之后開始下降，在12周時(shí)接近于術(shù)前，靜脈血ALP值在術(shù)后第2、4、8周與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論T-CAM表面修飾n-HA/PA66復(fù)合骨修復(fù)材料具有促進(jìn)骨質(zhì)愈合的作用，尤其在早期修復(fù)骨缺損的效果優(yōu)于n-HA/PA66。

橈骨；堿性磷酸酶；骨折愈合；骨缺損；納米羥基磷灰石；聚酰胺66

骨缺損的修復(fù)是困擾骨科醫(yī)生的難題之一。納米羥基磷灰石/聚酰胺66(nano-hydroxyapatite/polyamide 66,n-HA/PA66)復(fù)合骨修復(fù)材料是本課題組前期開發(fā)的具有優(yōu)良的生物學(xué)性能和類骨活性的骨修復(fù)材料[1]。T-CAM黏附分子(Tetra-cell adhesion molecule)是包含RGD(arginine-glycine-aspartic acid)，PHSRN(proline-histidine-serine-arginine-asparagine)，EPDIM(glutamic acid-proline-aspartic acid-isoleucine-methionine)，YH(tyrosine-histidine)4個(gè)序列互補(bǔ)性修飾的黏附分子，能夠促進(jìn)細(xì)胞的黏附與擴(kuò)散，動物實(shí)驗(yàn)表明復(fù)合T-CAM黏附分子的脫鈣骨有良好的修復(fù)骨缺損能力[2]。本研究將T-CAM黏附分子修飾于n-HA/PA66上，制備T-CAM表面修飾n-HA/PA66復(fù)合骨修復(fù)材料，觀察其對兔橈骨中段骨缺損的修復(fù)能力，并為其應(yīng)用于臨床提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 n-HA/PA66復(fù)合骨修復(fù)材料(材料規(guī)格： 4.0 mm×15.0 mm圓柱體)。

1.2 方法

1.2.1 T-CAM表面修飾nHA/PA66復(fù)合骨修復(fù)材料的制備 按文獻(xiàn)[3]制備T-CAM黏附分子。將n-HA/PA66復(fù)合骨修復(fù)材料置入溶有一定量T-CAM黏附分子的磷酸鹽緩沖液(PBS)中浸泡24 h后室溫下風(fēng)干，然后在水提取器除去未被修飾的T-CAM，制得T-CAM表面修飾n-HA/PA66復(fù)合骨修復(fù)材料。

1.2.2 骨缺損動物模型制備及實(shí)驗(yàn)分組 4～6月齡健康成年新西蘭大白兔(由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，雌雄不限)用速眠新(3 mL/kg)麻醉后，按孟純陽等[4]的方法制作節(jié)段性右側(cè)橈骨中段骨缺損模型，缺損長度1.5 cm。將36只造模成功的新西蘭大白兔分為兩組，每組18只。其中，實(shí)驗(yàn)組植入T-CAM表面修飾n-HA/PA66復(fù)合骨修復(fù)材料(圖1)；對照組植入n-HA/PA66復(fù)合材料。所有兔子術(shù)后均分籠飼養(yǎng)，每天每只肌內(nèi)注射青霉素8×105U(分2次)，稀碘伏消毒傷口(2次/天)，連續(xù)3 d。

圖1 實(shí)驗(yàn)組術(shù)中植入材料

1.2.3 觀察指標(biāo)

1.2.3.1 一般情況觀察 術(shù)后觀察兔子的飲食、前肢功能、步態(tài)及傷口愈合情況。

1.2.3.2 血清堿性磷酸酶(ALP)測定 于術(shù)前，術(shù)后2、4、8、12 周分別抽取靜脈血檢測ALP值。觀察兩組兔子血清ALP的變化，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.3.3 影像學(xué)觀察 術(shù)后4、8、12周行兔右橈骨X線片檢查，觀察骨折愈合情況；采用Lane-Sandhu X射線評分標(biāo)準(zhǔn)[5]評估骨-材料界面骨痂形成及骨愈合情況。

1.2.3.4 大體及組織學(xué)觀察 術(shù)后4、8、12周處死兔子，將植入材料連同兩端0.5 cm正常骨組織取出，觀察橈骨骨缺損修復(fù)情況。之后將標(biāo)本置于10%福爾馬林中固定，經(jīng)脫鈣，石蠟包埋，縱行切片后，行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察新生骨組織長入材料內(nèi)情況及材料周圍新生骨組織情況。并采用Lane-Sandhu 組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)[6]評估骨缺損修復(fù)情況。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 術(shù)后1h后兔子蘇醒，可自由活動，但進(jìn)食稍差；術(shù)后3d內(nèi)所有兔子飲食均稍差，活動少；1周后兔子飲食明顯增加；所有兔子術(shù)后切口均一期愈合。

2.2 血清ALP檢測結(jié)果 術(shù)后2、4、8 周時(shí)各組ALP均較術(shù)前顯著升高，術(shù)后2周實(shí)驗(yàn)組ALP值開始升高，隨著時(shí)間的推移，兩組ALP值均升高，術(shù)后8周達(dá)最高峰，之后開始下降，在12周時(shí)接近于術(shù)前；靜脈血ALP值在術(shù)后第2、4、8周與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.3 影像學(xué)結(jié)果 術(shù)后第4周，實(shí)驗(yàn)組骨-材料界面界面模糊，可見骨痂形成，對照組材料與骨組織分界仍較清楚，有少量骨痂形成；術(shù)后第8周，實(shí)驗(yàn)組材料周圍骨痂明顯增多，材料-骨組織界面模糊，分界不清，對照組相骨痂明顯較少；術(shù)后第12周，實(shí)驗(yàn)組和對照組均可見新生骨痂包裹材料，材料-骨組織界面模糊，實(shí)驗(yàn)組材料周圍大量骨痂形成，量較對照組多。術(shù)后第12周Lane-SandhuX線片評分結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組(10.24±0.37)分，對照組(8.41±0.77)分，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.147，P=0.037)，見表2。

表1 各組血清ALP檢測結(jié)果

表2 各組Lane-Sandhu X線片評分結(jié)果，分)

2.4 組織學(xué)觀察結(jié)果 術(shù)后4周，實(shí)驗(yàn)組材料-骨界面可見纖維骨痂、新生血管組織及骨組織，對照組在材料-骨界面可見大量纖維組織、軟骨細(xì)胞及少量新生骨組織，但未見明顯新生血管組織；術(shù)后8周，實(shí)驗(yàn)組材料-骨界面可見大量新生骨組織、新鮮松質(zhì)骨及新生血管組織，對照組在材料-骨界面可見纖維組織、新生血管、骨母細(xì)胞等；術(shù)后12周，實(shí)驗(yàn)組可見大量板層骨形成，骨痂塑形完好，對照組在材料-骨界面可見大量新生骨組織、密質(zhì)骨，見圖2。術(shù)后第12周 Lane-Sandhu組織學(xué)評分結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組(11.65±0.58)分，對照組(9.33±0.26)分，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.438，P=0.031)，見表3。

圖2 術(shù)后12周骨-材料界面HE染色(×100)

表3 各組Lane-Sandhu組織學(xué)評分結(jié)果，分)

3 討 論

骨缺損的修復(fù)和重建是目前骨科研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)課題，現(xiàn)階段臨床上應(yīng)用較為廣泛的骨修復(fù)材料主要包括異體骨、自體骨和人工生物材料等。自體骨來源有限，異體骨移植可能使患者產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，也存在倫理問題和引入外源病菌、病毒的風(fēng)險(xiǎn)。這些問題與風(fēng)險(xiǎn)促使人們研制更加先進(jìn)、有效的人工骨修復(fù)材料來實(shí)現(xiàn)骨組織缺損的再生與重建。n-HA/PA66復(fù)合骨修復(fù)材料因具有良好的生物力學(xué)性能、生物相容性及生物安全性，目前已廣泛用于骨缺損的填充及修復(fù)，并取得了不錯(cuò)的臨床效果[1,5,7]。但該材料無骨誘導(dǎo)作用，早期成骨效果及材料-骨界面穩(wěn)定性較差[5,8]。

近年來，有學(xué)者提出將生物活性分子固定在人工合成材料表面進(jìn)行修飾，為種子細(xì)胞提供黏附、增殖和分化信號的生物界面[9]。目前，使用最廣泛的是含RGD序列的多肽，RGD是一類存在于多種黏附蛋白結(jié)構(gòu)中的共有基序，因此將其修飾到材料表面可增強(qiáng)成骨細(xì)胞黏附、增殖和分化，促進(jìn)hESCd-MSCs細(xì)胞黏附、增殖及骨礦物質(zhì)的合成，促進(jìn)植入物周邊新生骨形成，增強(qiáng)早期成骨標(biāo)志-ALP活性[10-14]。然而由于缺乏附屬或調(diào)節(jié)性結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致RGD肽生物活性及RGD序列的功能受限[15]。為提高生物利用度，部分學(xué)者提出在RGD序列周圍圈定足夠的功能位點(diǎn)，其中最重要的方法之一是核心基序RGD和輔助序列PHSRN的互補(bǔ)性修飾[16]。Lee等[3]發(fā)現(xiàn)EPDIM和YH互補(bǔ)性修飾能夠促進(jìn)細(xì)胞的黏附與擴(kuò)散，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步合成包含RGD，PHSRN，EPDIM，YH4個(gè)序列互補(bǔ)性修飾的T-CAM黏附分子，動物實(shí)驗(yàn)表明復(fù)合T-CAM黏附分子的脫鈣骨有良好的修復(fù)骨缺損能力。為此，作者將T-CAM黏附分子復(fù)合到n-HA/PA66材料表面進(jìn)行修飾，期望通過黏附分子表面修飾提高材料早期誘導(dǎo)成骨性能。

Park等[17]研究顯示T-CAM表面修飾的植入材料能明顯促進(jìn)兔股骨植入物周邊新生骨的形成。本研究結(jié)果顯示，動物實(shí)驗(yàn)中組織學(xué)和影像學(xué)結(jié)果表明術(shù)后實(shí)驗(yàn)組新骨生長速度和數(shù)量明顯優(yōu)于對照組，顯示n-HA/PA66材料經(jīng)T-CAM黏附分子表面修飾后具有良好的誘導(dǎo)成骨效應(yīng)。ALP的表達(dá)可反應(yīng)軟骨及骨細(xì)胞的增生、活躍程度，ALP結(jié)果提示術(shù)后2周時(shí)實(shí)驗(yàn)組ALP水平是術(shù)前的1.6倍，對照組ALP接近術(shù)前水平,說明實(shí)驗(yàn)組從術(shù)后2周開始即有成骨；4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對照組分別是術(shù)前的2.0和1.7倍，術(shù)后8周達(dá)最高峰，實(shí)驗(yàn)組和對照組分別是術(shù)前的3.4和2.6倍，之后開始下降，在12周時(shí)ALP水平接近于術(shù)前。這提示材料植入后4周骨及軟骨細(xì)胞增生活躍，8周時(shí)達(dá)最高峰，而T-CAM表面修飾n-HA/PA66復(fù)合骨修復(fù)材料的成骨效果優(yōu)于n-HA/PA66復(fù)合材料。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從X線片、大體標(biāo)本及組織學(xué)觀察，相對于n-HA/PA66復(fù)合材料，T-CAM表面修飾nHA/PA66復(fù)合骨修復(fù)材料體內(nèi)具有更好的成骨特性，尤其是在愈合早期，可滿足局部骨缺損的修復(fù)，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

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The experimental research of T-CAM surface modification nano-hydroxyapatite/polyamide 66 composite materials repair of rabbit radius bone defect*

QiuHao1,DongJing1,LuGongbiao2,LuMinpeng1△,CaoChunfeng1,WangQunbo1,ZhangMinghua1

(1.DepartmentofOrthopedics,YongchuanHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing402160,China;2.DepartmentofOrthopedics,JiningFirstPeople′sHospital,Jining,Shandong272011,China)

Objective To discuss the efficacy of T-CAM surface modification nano-hydroxyapatite/polyamide 66 (T-CAM/n-HA/PA66) composite materials on the recovery of rabbit radius bone defect.Methods A total of 36 New Zealand rabbits were artificially made to be bone defect by resecting the 1.5 cm substantia ossea with periosteum of radius,and were divided into two groups averagely depending on implanted materials:experimental group (T-CAM/n-HA/PA66),control group (n-HA/PA66).The alkaline phosphatase (ALP) of venous blood was observed at preoperative and week 2,4,8,12 postoperative.Every 6 rabbits were sacrificed on week 2,4,8,12,and the radius healing status was observed by X-ray,histology.Results No rabbit was infected or died,no implant material was dropped.Gross observation，X-ray results and histology results demonstrated that the experimental group began to have a new bone tissue at 4 weeks after the operation；with the extension of time,the experimental group′s new bone growth speed and the quantity were better than the those of control group.The Lane -Sandhu method X-ray score showed that there were significant differences between two groups (P<0.05),as well as the Lane-Sandhu method histological score.The ALP value of experimental group began to rise at two weeks postoperative;with the extension of time,ALP value of both groups increased,peaked at 8 weeks,then began to decline,lastly close to the preoperative at 12 weeks,The ALP value at 2,4 and 8 weeks were significant between two groups (P<0.01).Conclusion T-CAM/n-HA/PA66 composite materials could accelerate the healing of bone defect.the effect of repair of bone defect is better than that of n-HA/PA66 artificial bone in the early.

radius；alkaline phosphatase；fracture healing；bone defect；T-CAM nano-hydroxyapatite；polyamide 66

重慶市科委自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(cstc2012jjA10029)；重慶市永川區(qū)科委基金資助項(xiàng)目(YCSTC，2011BE5018)。 作者簡介：邱皓(1991-)，在讀碩士，主要從事骨科生物材料、脊柱外科方面研究。△

E-mail：luminpeng@126.com。

論著·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.006

R

A

1671-8348(2016)23-3185-03

2016-04-02

2016-06-23)