齊凡星 胡瑩 盧軍棟 康麗娟 李志安 張會朵

(1.保定市第一中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，河北 保定 071000；2.保定市第一中心醫(yī)院心內(nèi)三科，河北 保定 071000)

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丁苯酞對大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

齊凡星1胡瑩2盧軍棟1康麗娟1李志安1張會朵1

(1.保定市第一中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，河北 保定 071000；2.保定市第一中心醫(yī)院心內(nèi)三科，河北 保定 071000)

目的 探討丁苯酞對大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制研究。方法 選用90只SD大鼠，隨機(jī)分為給藥組、對照組和健康組，每組30只。對給藥組和對照組大鼠使用10%水合氯醛麻醉(劑量為0.5 mL/100 g)，麻醉完成后，對大鼠雙側(cè)海馬區(qū)位置進(jìn)行準(zhǔn)確定位后，將濃度為5 μL(1 μg/μL)Aβ1-42注入造模。將配置的丁苯酞與食用麻油混合配制成懸濁液。造模完成后，分別給予不同的處理方法，給藥組按75 mg/kg比例對大鼠進(jìn)行灌胃給藥，1次/d。對照組按同等比例灌胃給予生理鹽水，1次/d。健康組為正常健康組，不給予任何手術(shù)和藥物處理。取大鼠腦組織分為兩部分，一部分經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋后制得厚度約5 μm切片。采用TUNEL染色法對腦組織細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測；并使用H&E染色法觀察各組大鼠腦組織細(xì)胞；采用Western Blot法檢測各組腦組織MAPK、Erk和P38的蛋白表達(dá)水平，并使用RT-PCR法檢測MAPK、Erk和P38的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 30 d后，給藥組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡明顯少于對照組及健康組。給藥組大鼠MAPK、Erk和P38的蛋白表達(dá)水平明顯低于對照組但高于正常健康組(P<0.05)。使用RT-PCR法檢測MAPK、Erk和P38的mRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，給藥組大鼠MAPK、Erk和P38的mRNA水平明顯低于對照組但高于正常健康組(P<0.05)。對照組大鼠達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)次數(shù)與健康組比較明顯升高(P<0.05)。與對照組比較，給藥組大鼠達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)次數(shù)明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 丁苯酞對Aβ1-42處理的大鼠腦組織細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，通過抑制大鼠腦組織MAPK，Erk和P38的表達(dá)發(fā)揮作用。

阿茲海默； 凋亡； 丁苯酞； MAPK

埃爾茨海默病(alzheimer’s disease，AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶力退化，但其發(fā)病原因未能明確。丁苯酞(又稱丁基苯酞，3-n-butylphathlide,NBP)，是一類對急性缺血性腦卒中，具有顯著治療效果的新型抗腦缺血藥物，對腦細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[1]。目前為止，丁苯酞對AD疾病中神經(jīng)細(xì)胞的作用效果及機(jī)制研究相對有限，有鑒于此，本次課題針對丁苯酞對AD模型中神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用效果及機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 Taq Master Mix (SinoBio，美國)、 瓊脂糖 (Biowest)、無菌生理鹽水、無菌雙蒸水、抗磷酸化MAPK(p-MAPK)(1∶1 000;Cell Signaling，美國)，β-actin抗體(1∶5 000; Invitrogen，美國)，磷酸化MAPK(p-MAPK抗體1∶1 000;Cell Signaling,美國)。0.9%無菌生理鹽水(大冢制藥，日本)，Trizol(Invitrogen，美國)，病理切片機(jī)(leica，德國)。

1.2 實驗設(shè)備 PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad)、凝膠成像儀(Bio-Rad)、電泳儀(北京市六一儀器廠)、離心機(jī)(Eppendorf，德國)、微量移液器 (Eppendorf，德國)、海爾制冰機(jī)，Western Blot 電泳儀(Rad-Bio，美國)，-80 ℃冰箱(Thermo)，10 mL注射器，5 mL注射器(哈那好，天津)，實驗動物專用手術(shù)器械(北京醫(yī)療器械廠)，NanoDrop2000光度儀(Thermo，美國)，EP管(Eppendorff，德國)，水浴鍋(北京醫(yī)療器械廠)。

1.3 研究方法 選用90只SD大鼠，隨機(jī)分為給藥組、對照組和空白組，每組30只。對給藥組和對照組大鼠使用10%水合氯醛麻醉(劑量為0.5 mL/100 g)，麻醉完成后，對大鼠雙側(cè)海馬區(qū)位置進(jìn)行準(zhǔn)確定位后，將濃度為5 μL(1 μg/μL)Aβ1-42注入造模。將丁苯酞與食用麻油按0.1 g/12.5 mL的比例混合配制成懸濁液。造模完成后，分別給予不同的處理方法，給藥組按75 mg/kg比例對大鼠進(jìn)行灌胃給藥，1次/d。對照組按同等比例灌胃給予生理鹽水，1次/d?？瞻捉M為正常健康組，不給予任何手術(shù)和藥物處理。三組大鼠共同喂養(yǎng)30 d，第30天，對三組大鼠使用Y型電迷宮檢測各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力：電刺激參數(shù)為:電壓50～70 V，電流強(qiáng)度0.7 mA，電擊延時5 s。電迷宮實驗程序:(1) 篩選; (2) 學(xué)習(xí)記憶測試。本實驗采用隨機(jī)休息不固定訓(xùn)練次數(shù)法，所有訓(xùn)練在一個實驗日內(nèi)完成。將各組大鼠處死后，使用BPS對大鼠進(jìn)行灌流，直至流出BPS無血色為止。取大鼠腦組織分為兩部分，一部分經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋后制得厚度約5 μm切片。另一部分先置于液氮中，之后放置于-80 ℃冰箱中保存待測。采用TUNEL染色法對腦組織細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測；并使用H&E染色法觀察各組大鼠腦組織細(xì)胞；采用Western Blot法檢測各組腦組織MAPK、Erk和P38的蛋白表達(dá)水平，并使用RT-PCR法檢測MAPK、Erk和P21的mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 丁苯酞保護(hù)大鼠腦組織凋亡 TUNEL染色在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，給藥組大鼠腦組織凋亡水平明顯減低，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。400×大鼠腦組織海馬C1區(qū)神經(jīng)元TUNEL染色結(jié)果顯示，健康組見少量TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)，對照組TUNEL陽性細(xì)胞率明顯增加[(72.4±2.67) VS (5.76±0.22),P<0.01]，給藥組TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)較對照組顯著減少[(42.3±1.53) VS (72.4±2.67),P<0.01。見圖1。

圖1 大鼠腦組織海馬C1區(qū)神經(jīng)元TUNEL染色結(jié)果( 400×)

2.2 丁苯酞抑制MAPK、Erk和P38 mRNA表達(dá)水平 在給藥組中，大鼠腦組織MAPK信號通路表達(dá)水平明顯減低(P<0.05)，而Erk和P38 mRNA水平無明顯變化(P>0.05)。Erk和P38無明顯差異，但對照組MAPK水平與健康組比較明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，給藥組MAPK水平明顯減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 三組大鼠腦組織MAPK、Erk和P38 mRNA熒光強(qiáng)度比較

2.3 丁苯酞抑制MAPK、Erk和P38蛋白表達(dá)水平 進(jìn)一步，我們對三組大鼠MAPK，Erk以及P38蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測和比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三組Erk以及P38蛋白表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)，對照組大鼠MAPK水平比健康組明顯增高，而給藥組大鼠MAPK水平明顯低于對照組大鼠。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2～3。

2.4 Y-型電迷宮評價 對照組大鼠達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)次數(shù)(57.2±5.6)次。給藥組大鼠達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)次數(shù)(31.1±5.1)次。健康組大鼠達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)次數(shù)(19.7±1.6)次。對照組大鼠達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)次數(shù)與健康組比較明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，給藥組大鼠達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)次數(shù)明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

對于AD發(fā)病機(jī)制目前未能得到完整的闡述，并且提出的不同的假說，其中被學(xué)術(shù)界認(rèn)可的假說有：基因突變假說、膽堿能損傷假說、tau蛋白假說、氧化應(yīng)激假說以及細(xì)胞凋亡假說等。目前對因突變假說、膽堿能損傷假說tau蛋白假說以及氧化應(yīng)激假說研究相對較多，其中有對基因突變研究指出AD的發(fā)病與β淀粉樣前體蛋白(APP)基因、早老素-1，-2(PS-1，PS-2)基因和載脂蛋白E(ApoE)基因有著密切的相關(guān)性。膽堿能損傷假說中證實由于乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性發(fā)生降低，使得AD患者記憶、認(rèn)知等多方面能力發(fā)生損傷[2]。大腦內(nèi)tau蛋白的磷酸化平衡一旦破壞，從而對神經(jīng)元軸突的穩(wěn)定性造成影響，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)纖維發(fā)生功能性退化而誘發(fā)AD[3]。在氧化應(yīng)激假說中，相關(guān)研究證實一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)以及超氧化物歧化酶(SOD)等氧化應(yīng)激物在AD模型動物中呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)[4]。然而這些研究大多集中在分子生物或者組織中，而對神經(jīng)細(xì)胞在AD發(fā)病中的作用及其機(jī)制研究相對有限[5]。

丁苯酞(消旋-3-正丁基苯酞)，是一種與自然界存在的左旋芹菜甲素具有相同結(jié)構(gòu)，但經(jīng)過人工消旋的人工合成藥物，伊始是一類治療抗腦缺血藥物，對急性缺血性腦卒中具有顯著的治療效果[6]。丁苯酞可以有效的增強(qiáng)缺血區(qū)微血管循環(huán)和血流量、保護(hù)線粒體等功能[7]。此外，丁苯酞還可以調(diào)控腦中三磷酸腺苷(ATP)和磷酸肌酸(Pcr)的含量，對腦組織缺血部分進(jìn)行保護(hù)并改善腦部能量代謝[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，丁苯酞還可對神經(jīng)細(xì)胞胞漿內(nèi)cGMP水平，以及ChAT活性具有一定的調(diào)節(jié)作用。之前的研究[10]發(fā)現(xiàn)，丁苯酞對阿爾茨海默病動物模型具有一定的治療效果。本研究發(fā)現(xiàn)，使用丁苯酞后，大鼠神經(jīng)組織凋亡明顯減少，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。TUNEL染色結(jié)果提示，凋亡細(xì)胞明顯減少(P<0.05)，進(jìn)一步，我們檢測大鼠腦組織MAPK、Erk和P38的蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，上述蛋白在給藥組大鼠的腦組織中明顯低于對照組但高于正常健康組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。使用RT-PCR法檢測MAPK、Erk和P38的mRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，給藥組大鼠MAPK、Erk和P38的mRNA水平明顯低于對照組但高于正常健康組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。因此，我們認(rèn)為丁苯酞對腦組織細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用是通過抑制MAPK、Erk和P38的轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)揮作用的。文獻(xiàn)表明[10]，MAPK對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的肝臟星狀細(xì)胞凋亡中發(fā)揮促進(jìn)作用，此外，在肺癌中，通過促進(jìn)P38 MAPK信號通路的表達(dá)也可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡，達(dá)到治療目的[11]。本研究中，我們再次證明了，MAPK-P38信號通路也可以在大鼠腦組織凋亡中發(fā)揮作用。但是，這一結(jié)論還需要進(jìn)一步的研究數(shù)據(jù)支持，如在對照組中設(shè)置使用MAPK抑制劑，并研究其保護(hù)作用，從而進(jìn)一步說明MAPK是腦組織凋亡的主要信號通路。對照組大鼠達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)次數(shù)與健康組比較明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，給藥組大鼠達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)次數(shù)明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示丁苯酞給藥治療對改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力有一定作用。

綜上所述，我們認(rèn)為，丁苯酞對Aβ1-42處理的大鼠腦組織細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，通過抑制大鼠腦組織MAPK，Erk和P38的表達(dá)發(fā)揮作用。

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Protective effect and mechanism of butadiene on apoptosis of neutral cells in rats

QiFanxin1,HuYing2,LuJundong1,KangLijuan1,LiZhian1,ZhangHuiduo1.

1.TheSecondDepartmentofNeurology,theFirstCenterHospitalofBaodingCity,Baoding071000,China. 2.TheThirdDepartmentofCardiology,theFirstCenterHospitalofBaodingCity,Baoding071000,China.

Objective To investigate the protective effect and mechanism of butylphthalide on nerve cell apoptosis in rats. Methods 90 SD rats were randomly divided into the medication administration group, control group and the healthy group in which 30 rats in each group. The medicine group and control group were anesthetized with 10% chloral hydrate (at a dose of 0.5 mL/100 g). After successful anesthesia, bilateral hippocampal area of in rats were accurate positioned, a 5 μL (1 μg/μL) concentration of Aβ1-42was injected for molding. The configuration of butylphthalide and oil was mixed into suspension. After the model was completed, the rats were given different treatment, and the drug group was administered with 75 mg/kg for 1 time per day. The control group was given normal saline by the same ratio for 1 times a day. The healthy group was deal with the normal meal, without any operation and drug treatment. The brain tissue of rats was divided into two parts, one part was fixed, dehydrated, and embedded in paraffin, and the thickness of 5 μm was obtained. TUNEL staining was used to detect the apoptosis of brain tissue; and H&E staining was used to observe the rat brain tissue cells; Western blot was used to detect the MAPK, ERK and P38 protein expression level and RT-PCR was detected the expression level of MAPK and ERK and P38 mRNA expression levels. Results After 30d, the apoptosis of the brain tissue of rats in the administration group was significantly less than that in the control group and the blank group. The protein expression levels of MAPK, Erk and P38 were significantly lower in the control group than in the control group but higher than those in the control group (P<0.05). The P38 expression levels of MAPK, Erk and mRNA were detected by RT-PCR , and the levels of MAPK, Erk and mRNA of P38 in rats were significantly lower than those in the control group but higher than those in the normal healthy group (P<0.05). In control group, the number of standards and health group was significantly higher (P<0.05). Compared with the control group, the rats in the treatment group were significantly reduced (P<0.05). Conclusion butylphthalide has a good effect on Aβ1-42 pretreated rats who protects the apoptosis of brain tissue through the inhibition of mitogen activated protein kinase (MAPK) by mediating the expression of ERK and p38 signaling pathway.

Alzheimer's disease； Apoptosis； Dl-3n-butylphthalide； MAPK

R-332；R749.1+6

A

1000-744X(2016)11-1132-03

2016-07-19)