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        線性探針技術(shù)在貴州地區(qū)耐藥結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價值

        2016-12-22 01:00:26鄭雯琳張銘袁薇陳依江
        貴州醫(yī)藥 2016年11期
        關(guān)鍵詞:基因突變耐藥檢測

        鄭雯琳 張銘 袁薇 陳依江

        (貴州省疾病預(yù)防控制中心,貴州 貴陽 550004)

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        線性探針技術(shù)在貴州地區(qū)耐藥結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價值

        鄭雯琳 張銘 袁薇 陳依江

        (貴州省疾病預(yù)防控制中心,貴州 貴陽 550004)

        結(jié)核分枝桿菌; 線性探針; 耐藥性

        結(jié)核病是全球嚴重的公共衛(wèi)生問題之一,據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報告[1],每年有約145萬人死于該病。我國近年來結(jié)核病的發(fā)病率也日趨上升,現(xiàn)已有結(jié)核病人450萬例,且每年病死13萬例。其中耐多藥結(jié)核病是我國現(xiàn)階段結(jié)核病防控工作面臨的最大挑戰(zhàn)之一[2]。為了進一步推進耐多藥結(jié)核病防治工作,近年來我國已經(jīng)開始引進耐藥結(jié)核分枝桿菌分子生物學(xué)快速檢測技術(shù)以代替耗時的需借助于培養(yǎng)基的常規(guī)檢測方法。本研究對貴州本地200例分離培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌菌株進行檢測,與傳統(tǒng)比例法結(jié)果進行對比,探討該方法針對貴州地區(qū)的耐藥結(jié)核分枝桿菌的應(yīng)用價值。

        1 材料與方法

        1.1 研究對象 貴州羅甸200株痰培養(yǎng)陽性菌株。

        1.2 研究方法

        1.2.1 傳統(tǒng)藥物敏感性試驗 利用傳統(tǒng)藥物敏感試驗檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平、異煙肼兩種一線抗結(jié)核藥物的耐藥性,作為診斷試驗的金標準。

        1.2.2 線性探針技術(shù)提取DNA 取500 μL處理后痰標本加入1.5 mL離心管內(nèi),10 000×g 離心15 min;棄上清,加入500 μL去離子水,渦旋震蕩重懸沉淀物。10 000×g離心15 min;95 ℃水浴中孵育20 min;超聲裂解15 min。12 000×g 離心10 min,取5 μL上清液用于PCR檢測。

        1.2.3 擴增 采用德國Hain LifescienceGmbH 公司生產(chǎn)的GenoType MTBDRplus試劑盒在PCR儀上對結(jié)核桿菌DNA 模板進行擴增。擴增體系:35 μL PNM,5 μL 10×buffer,0.2 μL DNA聚合酶,2 μL MgCl2溶液,2.8 μL ddH2O,5 μL DNA模板,最終容積達到50 μL。擴增條件:95 ℃,15 min;(95 ℃,30 s,58 ℃,2 min),10個循環(huán);(95 ℃,25 s,53 ℃,40 s,70 ℃,40 s),30個循環(huán);70 ℃,8 min,4 ℃,1 h。

        1.2.4 雜交 將PCR 擴增產(chǎn)物和變性裂解液(DEN)各20 μL混勻加入雜交反應(yīng)板,孵育5 min,然后加入雜交緩沖液(HYB)1 mL,混勻,將標記好的探針試條加入槽中,在雜交儀上45 ℃孵育30 min后將雜交液徹底吸出,再加入1 mL嚴格漂洗液(STR),45 ℃雜交儀孵育15 min。在每個槽中加入1 mL按1∶100稀釋的標志物,雜交儀振動平臺上孵育30 min。再向每個槽中1∶100稀釋的底物并靜止避光孵育5~10 min。將試條取出置于吸水紙上干燥,然后粘貼在判讀表上。

        1.3 結(jié)果判讀 線性雜交技術(shù)結(jié)果試紙條共有27 個反應(yīng)條帶,分為4個區(qū)域,第一區(qū)為對照質(zhì)控帶,其他區(qū)為耐藥相關(guān)基因探針區(qū),其中第二區(qū)是利福平耐藥相關(guān)rpoB 基因探針區(qū),第三和第四區(qū)分別為異煙肼耐藥相關(guān)的KatG、inhA 基因探針區(qū),當野生條帶均顯色而突變條帶無顯色時為藥物敏感,野生條帶缺失、突變條帶顯色或不顯色均為耐藥。

        1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理,檢測結(jié)果的真實性采用敏感度和特異度對其進行評價,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 比例法藥敏結(jié)果 利福平耐藥27例,利福平敏感173例,異煙肼耐藥18例,異煙肼敏感182例。

        2.2 線性探針技術(shù)結(jié)果 利福平耐藥27例,利福平敏感173例,異煙肼耐藥18例,異煙肼敏感182例。

        2.3 兩種方法比較 兩種方法對利福平檢測結(jié)果一致的有200例,兩種方法均為耐藥的27例,均為敏感的173例; 兩種方法對異煙肼檢測結(jié)果一致的有200例,兩種方法均為耐藥的18例,均為敏感的182例。線性探針GenoType MTBDRplus方法檢測利福平耐藥的靈敏度為100%,特異度為100%,陽性預(yù)測值為1,陰性預(yù)測值為1 ; 檢測異煙肼的靈敏度為100%,特異度為100%,陽性預(yù)測值為 1 ,陰性預(yù)測值為1 。線性探針技術(shù)技術(shù)與傳統(tǒng)藥敏實驗檢測所得利福平耐藥結(jié)核病發(fā)生率、異煙肼耐藥結(jié)核病發(fā)生率和耐多藥結(jié)核病發(fā)生率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

        2.4 基因突變頻率分布 對GenoType MTBDRplus 檢測耐利福平及耐異煙肼的突變位點進行了分析,耐利福平基因突變頻率最高的是S531L(66.7%),耐異煙肼基因突變頻率最高的為 S315T1(88.9%)。見表1。

        表1 線性探針技術(shù)檢測利福平和異煙肼耐藥基因的突變頻率分布

        3 討 論

        線性探針雜交技術(shù)檢測作為分子診斷,其原理是基于對基因序列的分析而進行的結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性診斷。實驗方法與傳統(tǒng)的藥物敏感性實驗相比簡單,且檢測速度較快,目前已在很多國家使用。但有研究顯示,耐藥水平的高低會影響HAIN技術(shù)的檢測效果[3]。WHO 2014 年版《耐藥結(jié)核病規(guī)劃管理指南伙伴手冊》對藥敏試驗進行了更新,指出藥敏試驗包括了表型藥敏試驗(即傳統(tǒng)藥敏試驗) 和基因型藥敏試驗; 結(jié)核分枝桿菌對利福平的耐藥定義為表型或基因型藥敏試驗發(fā)現(xiàn)利福平耐藥[4]。說明分子檢測對耐藥結(jié)核病診斷的重要性,意味著一旦發(fā)現(xiàn)利福平基因型耐藥,就需要考慮其為耐藥結(jié)核的可能性[5]。

        本研究中,GenoType MTBDR plus 檢測利福平耐藥的靈敏度達100%,與此前國外的研究結(jié)果一致[6-7]。已有研究顯示利福平耐藥由編碼RNA聚合酶β亞單位的rpoB 基因核心區(qū)的基因突變引起。本研究檢測利福平耐藥表現(xiàn)出較高的靈敏度和特異度。由于不同地區(qū)結(jié)核分枝桿菌耐利福平的基因突變位點突變頻率均不同,本研究顯示,耐利福平基因突變頻率最高的是rpoB S531L,故提示貴州地區(qū)利福平耐藥主要以rpoB S531L 為主。異煙肼耐藥主要與katG 和inhA 基因有關(guān),katG 基因突變與高水平耐藥相關(guān), inhA 耐藥與低水平耐藥相關(guān)。本研究顯示,異煙肼耐藥主要基因突變?yōu)閗atG S315T1,提示貴州地區(qū)88.9%的耐異煙肼病例為高水平耐藥。

        [1] World Health Organization. Global tuberculosis control: WHO report 2011[R]. Geneva: World Health Organization, 2011.

        [2] 衛(wèi)生部.全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報告(2007-2008年)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2010.

        [3] World Health Organization. Compannion handbook to the WHO guidelines for the programmatic management of drug-resistant tubercuosis[R]. Geneva: World Health Organization, 2014.

        [4] 段鴻飛. WHO 2014 年版《耐藥結(jié)核病規(guī)劃管理指南伙伴手冊》解讀之六[J]. 中國防癆雜志,2015,37(6):658-659.

        [5] Causse M, Ruiz P, Gutierrez JB,et al.Evaluation of new Geno-Type MTBDRplus for detection of resistance in cultures and direct specimens of Mycobacterium tuberculosis [J].Int J Tuberc Lung Dis,2008,12(12):1456-1460.

        [6] Lacoma A, Garcia-Sierra N, Prat C, et al. GenoType MTBDRplus assay for molecular detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis strains and clinical samples [J]. J Clin Microbiol,2008,46(11):3660-3667.

        [7] Miotto P, Piana F, Cirillo DM, et al.Genotype MTBDRplus: a further step toward rapid identification of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis [J]. J Clin Microbiol, 2008,46(1):393-394.

        貴州省疾病預(yù)防控制中心基金項目(2015-E2-4)

        R52

        B

        1000-744X(2016)11-1214-02

        2016-06-08)

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