汪皖君， 管雅琳， 王雅靜， 于長申， 劉首峰， 呂鳳瓊， 王世民， 王新平

?

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用

汪皖君， 管雅琳， 王雅靜， 于長申， 劉首峰， 呂鳳瓊， 王世民， 王新平

目的 探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植對大鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，并探討其可能的機(jī)制。方法 經(jīng)體外培養(yǎng)并純化BMSCs，移植前以10 mg/L的BrdU進(jìn)行標(biāo)記。線栓法制作大鼠MCAO模型，隨機(jī)分為移植A組、B組及對照C組。在模型建立后7 d，通過尾靜脈分別將3×106個BMSCs、1×106個BMSCs移植入A、B組大鼠體內(nèi)，C組不作處理。于移植前、后分別進(jìn)行改良神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度評分(mNSS)及Morris水迷宮測試，并取大鼠腦組織行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果 移植A組與移植B組、C組比較，行為學(xué)恢復(fù)更為明顯，(P<0.01)；B、C兩組相比無顯著性差異(P>0.05)；移植A組大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力較C組明顯改善(P<0.05)。A、B組大鼠在腦損傷中心及周圍區(qū)，可見Brdu單染陽性細(xì)胞及Brdu + MAP-2、Brdu+ GFAP、Brdu+vWF、Brdu+VEGF雙染陽性細(xì)胞。結(jié)論 BMSCs經(jīng)尾靜脈移植至MCAO大鼠體內(nèi)后，可在大鼠體內(nèi)存活、分化，并促進(jìn)大鼠伸進(jìn)功能恢復(fù)。療效與移植細(xì)胞數(shù)量相關(guān)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 大腦中動脈栓； 尾靜脈； 大鼠； 細(xì)胞移植

腦梗死可導(dǎo)致多種神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，是臨床上發(fā)病率及致殘率極高的血管性疾病[1]，目前藥物治療未達(dá)到突破性的效果[2]。BMSCs具有向星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞等多種組織系統(tǒng)分化的潛能[3]，并具備易于獲得、體外培養(yǎng)能快速擴(kuò)增、可自體移植、能免疫耐受并能夠轉(zhuǎn)染和長期表達(dá)外源性基因等優(yōu)勢。本試驗通過建立大鼠MCAO模型，進(jìn)一步探討靜脈途徑移植BMSCs改善神經(jīng)功能的機(jī)制，移植的有效劑量等問題。

1 材料和方法

本研究為隨機(jī)對照動物試驗，于2012年2月～2013年2月在天津市環(huán)湖醫(yī)院細(xì)胞室和天津市環(huán)湖醫(yī)院神經(jīng)外科研究所完成。

1.1 材料

1.1.1 試劑及儀器 5，-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)、鼠抗人5’-溴脫氧尿嘧啶(BrdU)(MP MedBiochemicals公司)；兔抗人膠原纖維酸性蛋白(GFAP)多克隆抗體(北京中杉金橋)；兔抗人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)多克隆抗體(生物技術(shù)公司)；兔抗人腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)多克隆抗體、Polymer雙染檢測試劑盒、兔抗人神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)多克隆抗體(武漢博士德公司)；Morris水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所制造)

1.1.2 實驗動物 健康成年雄性SD大鼠4只，體重120～150 g，用于制備骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。健康成年雄性SD大鼠120只，體重240～260 g，用于制備大鼠大腦中動脈栓塞模型。大鼠均購于中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，動物質(zhì)量合格證號：SCXK-(軍)-2012-004。實驗過程中對動物的處置符合2009年《 Ethical issues in animal experimentation》相關(guān)動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的條例。

1.2 實驗方法

1.2.1 BMSCs的分離、培養(yǎng)和標(biāo)記 密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法分離獲取BMSCs并在移植前1 d以BrdU標(biāo)記，具體步驟見參考文獻(xiàn)[4]。

1.2.2 MCAO模型制作及分組 120只雄性SD大鼠均以體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛按0.33～0.36 ml/100 g進(jìn)行腹腔注射麻醉，使用改良Zea Longa’s線栓法阻斷左側(cè)大腦中動脈制作大腦中動脈閉塞(MCAO)局灶性腦缺血模型[5]，1 h后拔線栓再灌注。造模成功后7 d，納入實驗分組SD大鼠62只，隨機(jī)分為3組：移植A組(25只)、B組(25只)、對照C組(12只)。

BMSCs移植：在造模后7 d通過尾靜脈注射方法將含有約3×106個BMSCs的細(xì)胞懸液和1×106個BMSCs的細(xì)胞懸液各1 ml，分別經(jīng)尾靜脈注射移植入A組、B組大鼠體內(nèi)，注射后使用1 ml生理鹽水沖管[6]。C組自然恢復(fù)不做處理。移植后大鼠置于普通鼠籠中喂養(yǎng)，行清潔抗感染護(hù)理。

1.2.3 行為學(xué)評價 于大鼠移植前、移植后分別進(jìn)行mNSS評分評估神經(jīng)功能恢復(fù)情況；移植后用Morris水迷宮測試大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。由兩名熟悉mNSS評分、Morris水迷宮的非試驗人員獨立觀察記錄，最后取平均值。

1.2.4 組織學(xué)檢查 移植后7 d、14 d、30 d，在各組大鼠中均隨機(jī)選取4只模型鼠，以40 g/L多聚甲醛磷酸鹽緩沖液心臟灌注固定，斷頭取腦后置于多聚甲醛磷酸鹽固定液中24 h以上。將腦組織制作常規(guī)石蠟切片，行蘇木精-伊紅染色及免疫組化染色。

1.2.5 主要觀察指標(biāo) 于大鼠移植前、移植后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d進(jìn)行mNSS評分；于移植后14 d、28 d進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練及測試；移植后7 d、14 d、30 d腦組織行免疫組化染色，觀察有無BrdU陽性細(xì)胞，Brdu+MAP-2、Brdu+GFAP、Brdu+vWF、Brdu+VEGF免疫組化雙染陽性細(xì)胞及單染陽性細(xì)胞。

2 結(jié) 果

2.1 實驗動物數(shù)量分析 實驗選用大鼠62只，分為3組，無脫失，全部進(jìn)入結(jié)果分析。

2.2 各組大鼠mNSS評分 該評分越高，神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重，術(shù)前所有大鼠評分均為0分，移植前及移植后3 d時3組大鼠的mNSS均增高，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，隨后各組分值逐漸降低，A組分值明顯低于其它各組，差異有顯著性意義(7 d、14 d、21 d、28 dP<0.01)。B組、C組分值亦漸趨下降，取各組均數(shù)B組下降更明顯，但兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表1、圖1)。

2.3 Morris水迷宮評價結(jié)果

2.3.1 定位航行試驗 在大鼠移植后14 d，28 d定位航行試驗結(jié)果：A、B、C三組比較，A組逃避潛伏期顯著低于B、C兩組(P<0.05)，同時B、C兩組之間，逃避潛伏期無顯著差異(P>0.05)(見表2)。

2.3.2 空間探索試驗 在大鼠移植后14 d，28 d空間探索試驗結(jié)果：A、B、C三組比較，A組逃跨越平臺次數(shù)多于B、C兩組(P<0.05)，同時B、C兩組之間，跨越平臺次數(shù)無顯著差異(P>0.05)(見表3)。

2.4 組織學(xué)檢查結(jié)果

2.4.1 HE染色 本實驗為BMSCs異體移植，未使用免疫抑制劑，移植后1 m各組均未發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞及異常分化細(xì)胞存在。三組大鼠腦組織HE染色均可見梗死區(qū)域：細(xì)胞壞死、神經(jīng)纖維疏松、間質(zhì)水腫，淋巴細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬壞死組織碎片形成的泡沫細(xì)胞及吞噬細(xì)胞，損傷區(qū)周邊可見膠質(zhì)細(xì)胞增生及炎細(xì)胞浸潤，但腦室、海馬結(jié)構(gòu)相對較完整。

2.4.2 免疫組化單染結(jié)果 C組未見到BrdU陽性的細(xì)胞。A、B組可見到BrdU陽性細(xì)胞散在分布于損傷側(cè)大腦半球的損傷中心區(qū)、脈絡(luò)叢、腦室管膜周圍及血管周圍處。BrdU是標(biāo)記在培養(yǎng)的BMSCs胞核上，BrdU陽性證實移植的BMSCs可在宿主腦內(nèi)存活(如圖2)。

2.4.3 免疫組織化學(xué)雙染結(jié)果 A、B組在損傷中心區(qū)、脈絡(luò)叢、腦室管膜周圍、血管周圍處可見Brdu+MAP-2、Brdu+GFAP、Brdu+ vWF，Brdu+VEGF雙染陽性細(xì)胞，核呈紅色，胞漿呈棕色(見圖3)。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能損傷程度評分±s)

與模型組C相比*P<0.01；與模型組C相比☆P>0.05；與移植B組比較△P<0.01

表2 各組大鼠定位航行試驗比較±s)

與模型組C相比*P<0.05；與模型組C相比☆P>0.05；與移植B組比較△P<0.05

表3 各組大鼠空間探索試驗比較±s)

與模型組C相比*P<0.05；與模型組C相比☆P>0.05；與移植B組比較△P<0.05

圖1 腦損傷后不同時間點各實驗組mNSS變化曲線

圖2 BrdU×400

3 討 論

3.1 BMSCs經(jīng)尾靜脈移植后可在MCAO大鼠體內(nèi)存活、遷移并促進(jìn)其神經(jīng)功能恢復(fù) 本研究在移植組大鼠腦內(nèi)可見Brdu陽性細(xì)胞。大鼠自體不含BrdU，本研究以Brdu標(biāo)記BMSCs，在移植組大鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)BrdU陽性細(xì)胞表明移植的BMSCs可在大鼠體內(nèi)存活并向腦內(nèi)遷移。

本研究以mNSS評分評估各組大鼠神經(jīng)功能，評分越高，神經(jīng)功能缺損越重。移植后3 d，三組大鼠mNSS評分均顯著下降，且各組間比較無顯著性差異，表明移植細(xì)胞在移植后3 d內(nèi)尚不能充分發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)的作用。考慮可能與損傷早期腦內(nèi)無菌性炎癥反應(yīng)及腦水腫影響移植細(xì)胞的遷移、定植，以及移植細(xì)胞需逐漸通過自分泌及促分泌等發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)作用有關(guān)。移植第7 d，A組行為學(xué)評分顯著優(yōu)于對照組，說明移植的BMSCs已經(jīng)發(fā)揮神經(jīng)修復(fù)作用。移植后30 d，A組行為學(xué)評分明顯優(yōu)于C組，說明移植的BMSCs仍可在大鼠體內(nèi)存活并持續(xù)發(fā)揮促進(jìn)其神經(jīng)功能缺損修復(fù)的作用。

本研究通過Morris水迷宮評估大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果表明，與C組相比，A組大鼠訓(xùn)練5 d后逃避潛伏期顯著縮短，幾乎可以快速找到平臺，目的較為明確，空間學(xué)習(xí)能力顯著優(yōu)于C組，提示移植一定數(shù)量的BMSCs能改善MCAO大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

本研究中，免疫組化結(jié)果顯示經(jīng)尾靜脈途徑移植的BrdU+-BMSCs，分布于損傷側(cè)的缺血中心區(qū)、海馬、脈絡(luò)叢、室管膜周圍及血管周圍，表面移植的BMSCs可以在大鼠體內(nèi)存活并向缺血周圍組織遷移。有研究[7]發(fā)現(xiàn)BMSCs在腦內(nèi)存活和遷移的方式類似于大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，可以沿著室管膜下和胼胝體進(jìn)行遷移。

本研究中，移植組大鼠腦內(nèi)可見的Brdu+BDNF、Brdu+VEGF、BrdU+vWF雙染陽性細(xì)胞，表明移植的BMSCs不僅可在宿主腦內(nèi)存活、遷移，并可分泌神經(jīng)生長因子及促進(jìn)內(nèi)源性血管生長因子分泌[8，9]。亦有相關(guān)研究表明，移植的BMSCs可促進(jìn)宿主內(nèi)源性神經(jīng)生長因子表達(dá)[10]，從而發(fā)揮腦缺血后的神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究表明移植BMSCs對于腦梗死的治療存在很大價值，尤其是可以改善神經(jīng)功能缺損，與既往多個研究結(jié)果相同[11～13]。

3.2 BMSCs經(jīng)尾靜脈移植后促進(jìn)MCAO大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的療效可能與移植數(shù)量相關(guān) 本研究中A組大鼠mNSS評分及學(xué)習(xí)記憶能力恢復(fù)顯著優(yōu)于B組，表明細(xì)胞移植療效可能與移植的BMSCs的數(shù)量相關(guān)，移植細(xì)胞數(shù)量需達(dá)到一定閾值方可發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)作用?？紤]與尾靜脈移植較立體定向移植等其他移植方式，距損傷中心相對較遠(yuǎn)且需通過血腦屏障等，消耗相對較多，故移植數(shù)量在一定范圍內(nèi)可顯著影響療效。

3.3 MCAO大鼠經(jīng)尾靜脈移植BMSCs安全性評估 本研究未應(yīng)用免疫抑制劑，在BMSCs同種異體移植后30 d，仍可見BMSCs存活于宿主體內(nèi)，說明BMSCs免疫原性較低，可以與移植宿主較好的相容。與本研究類似，Scheibe等[14]在MCAO造模后6 h經(jīng)靜脈途徑移植BMSCs至同種小鼠體內(nèi)，之后用流式細(xì)胞技術(shù)觀察移植后的免疫反應(yīng)，結(jié)果顯示炎性反應(yīng)水平與對照組幾乎等同。

4 結(jié) 論

本研究證明，經(jīng)尾靜脈途徑移植BMSCs至MCAO大鼠體內(nèi)后，其可在大鼠體內(nèi)存活、分化，并促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，考慮機(jī)制可能與移植的BMSCs促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌有關(guān)。BMSCs的療效與數(shù)量有關(guān)，與1×106相比，3×106有較好的療效。同種異體移植BMSCs是安全的，整個實驗過程中未發(fā)現(xiàn)明顯免疫排斥反應(yīng)及腫瘤形成。但本實驗觀察時間相對較短，其遠(yuǎn)期效果及安全性等尚需進(jìn)一步研究。

[1]Wessel MJ，Zimerman M，Hummel FC. Non-invasive brain stimulation：an interventional tool for enhancing behavioral training after stroke[J]. Front Hum Neurosci，2015，5(9)：265.

[2]Gomis M，Dávalos A. Recanalization and reperfusion therapies of acute ischemic stroke：what have we learned，what are the major research questions，and where are we headed[J]? Front Neurol，2014，11(5)：226.

[3]Peng T，Zhu G，Dong Y，et al. BMP4：a possible key factor in differentiation of auditory neuron-like cells from bone-derived mesenchymal stromal cells[J]. Clin Lab，2015，61(9)：1171-1178.

[4]Zhang J，Li Y，Zhang ZG，et al. Bone marrow stromal cells increase oligodendrogenesis after stroke[J]. Cereb Blood Flow Metab，2009，29(6)：1166-1174.

[5]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke，1989，20：84-91.

[6]Yarygin KN，Kholodenko IV，Konieva AA，et al. Mechanisms of positive effects of transplantation of human placental mesenchymal stem cells on recovery of rats after experimental ischemic stroke[J]. Bull Exp Biol Med，2009，148(6)：862-868.

[7]Li Y，Hua XM，Hua F，et al. Are bone marrow regenerative cells ideal seed cells for the treatment of cerebral ischemia[J]? Neural Regen Res，2013，8(13)：1201-1209.

[8]Li N，Wang P，Ma XL，et al. Effect of bone marrow stromal cell transplantation on neurologic function and expression of VEGF in rats with focal cerebral ischemia[J]. Mol Med Rep，2014，10(5)：2299-2305.

[9]Bao X，Wei J，F(xiàn)eng M，et al. Transplantation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after cerebral ischemia in rats[J]. Brain Res，2011，1367：103-113.

[10]Shichinohe H，Ishihara T，Takahashi K，et al. Bone marrow stromal cells rescue ischemic brain by trophic effects and phenotypic change toward neural cells[J]. Neurorehabil Neural Repair，2015，29(1)：80-89.

[11]路 蔚. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠MCAO的實驗研究[D]. 天津醫(yī)科大學(xué)，2008：64.

[12]管雅琳，孔繁明，王世民，等. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞立體定向移植治療大鼠脊髓損傷[J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14(14)：2549-2555.

[13]劉慧純，張培培，王世民，等. 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠腦缺血損傷[J]. 中國組織工程研究，2012，16(19)：3471-3475.

[14]Scheibe F，Ladhoff J，Huck J，et al. Immune effects of mesenchymal stromal cells in experimental stroke[J]. Cereb Blood Flow Metab，2012，32(8)：1578-1588.

a：Brdu+MAP-2×200 b：Brdu+GFAP×400 c：Brdu+vWF×200 d：Brdu+VEGF×400

圖3 腦損傷后14 d，2個移植組大鼠損傷處可見Brdu+MAP-2、Brdu+GFAP、Brdu+vWF、Brdu+VEGF雙染陽性細(xì)胞

Intravenous bone marrow-derived mesenchymal stem cells for the treatment of ischemia-reperfusion injury in rats

WANG Wanjun，GUAN Yalin，WANG Yajing，et al.

(Department of Neurological Rehabilitation of Tianjin Huanhu Hospital，Tianjin 300010，China)

Objective BMSCs were isolated in vitro and purified. Methods 10 mg/L BrdU was used for labeling before BMSCs transplantation. SD rats were used to establish the middle cerebral artery ischemia-reperfusion model with modified suture method. The models were randomly divided into transplantation group A、transplantation groupB and control groupC. 7 days after injury，rats in group A were given 3×106BMSCs，and in group B were given 1×106BMSCs. Rats in the model group were left intact. Results Aafter transplantation of the BMSCs，group A’s recovery of the neurological deficit is was more apparently than group C and group B (P<0.01). There was no significant difference between group B and group C (P>0.05). Double-staining cells of immunohistochemistry could be found at the center of damage and surrounding of it. BrdU+cells and Immunohistochemical double staining positive cells were seen in group A and group B. BMSCs transplanted through vena caudalis can could survive and differentiate in the host brain. Conclusion BMSCs transplanted through vena caudalis can survive and differentiate in the host brain damage region. BMSCs transplantation is able to improve the neural function of cerebral ischemia injured rats. The efficacy is related to the number of BMSCs.

Bone marrow-derived mesenchymal stem cells； MCAO； Vena caudalis transplantation； SD rats； Cell transplantation

1003-2754(2016)11-1017-04

2016-07-10；

2016-10-21

天津市科學(xué)技術(shù)委員會資助項目(No. 11JCZDJC19400)；天津市衛(wèi)生局立項課題(No. 09KZ41)

[天津市腦系科中心醫(yī)院(環(huán)湖醫(yī)院)神經(jīng)康復(fù)科，天津 300010]

王新平，E-mail：wangxinpingtj@sina.com

R743

A