劉 祎， 徐 運(yùn)， 曹 翔

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二氫楊梅素抑制脂多糖誘導(dǎo)后BV2細(xì)胞HMGB1的核質(zhì)轉(zhuǎn)位和釋放

劉 祎， 徐 運(yùn)， 曹 翔

目的 探索二氫楊梅素(Ampelopsin，AMP)對脂多糖(LPS)刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞BV2高遷移率族蛋白B1(HMGB1)核質(zhì)轉(zhuǎn)位和釋放的影響。方法 不同濃度的二氫楊梅素(10 μmol/L，30 μmol/L，50 μmol/L)聯(lián)合LPS處理BV2細(xì)胞，用Elisa法檢測HMGB1的分泌水平；細(xì)胞核質(zhì)分離方法檢測HMGB1核/質(zhì)轉(zhuǎn)位；免疫共沉淀檢測HMGB1磷酸化的表達(dá)情況；免疫印跡檢測JAK2、STAT3磷酸化水平。結(jié)果 不同濃度的二氫楊梅素顯著抑制了LPS引起的BV2細(xì)胞HMGB1釋放，減少了LPS誘導(dǎo)的HMGB1由細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位。免疫共沉淀和免疫印跡結(jié)果表明：二氫楊梅素可減少HMGB1磷酸化水平，抑制LPS誘導(dǎo)的JAK2-STAT3信號通路激活。結(jié)論 二氫楊梅素可以抑制LPS介導(dǎo)的BV2細(xì)胞HMGB1的轉(zhuǎn)位和釋放，其主要機(jī)制可能是通過降低HMGB1的磷酸化以及抑制JAK2-STAT3信號途徑。

二氫楊梅素； 脂多糖； BV2細(xì)胞； 高遷移率族蛋白B1

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)固有的免疫效應(yīng)細(xì)胞，在缺血性卒中后炎癥反應(yīng)起著十分重要的作用[1，2]。病理?xiàng)l件下，小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增加并開始活化，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞通過釋放白細(xì)胞介素(interleukin，IL)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、趨化因子(chemokine)和神經(jīng)生長因子(nervegrowthfactor，NGF)等細(xì)胞因子發(fā)揮細(xì)胞毒性效應(yīng)，導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷[3，4]。大量研究證實(shí)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，可以減輕炎癥因子對神經(jīng)組織的損傷，因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，將成為一種有效治療缺血性卒中的策略。高遷移率族蛋白B1(High mobility group protein box 1，HMGB1)是一種高度保守的細(xì)胞核內(nèi)非組蛋白，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。核內(nèi)的HMGB1能穩(wěn)定核小體，參與DNA修復(fù)、DNA重組等生命活動(dòng)，然而分泌到胞外的HMGB1可通過激活其他炎癥介質(zhì)，放大炎癥反應(yīng)，加劇缺血性腦損傷。臨床研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在腦缺血后表達(dá)量明顯升高并持續(xù)數(shù)周，其升高程度與腦缺血程度呈正相關(guān)[5]。在大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)動(dòng)物模型和氧糖剝奪(oxygen glucose deprivation，OGD)細(xì)胞模型中，HMGB1表達(dá)水平也出現(xiàn)增高[6～8]，并且與腦缺血程度有一定相關(guān)性。顱內(nèi)注射HMGB1特異性抗體則顯著減少大鼠腦的梗死面積，降低血腦屏障損害[9]。因此，抑制HMGB1的激活可能成為缺血性卒中患者更為有效的治療手段。二氫楊梅素(Ampelopsin，AMP)是從蛇葡萄屬多年野生藤本植物莖葉中提取出來的有效成分，具有抗腫瘤、抗脂質(zhì)過氧化、保肝護(hù)肝等作用[10，11]。目前，對二氫楊梅素的抗炎機(jī)制研究較少，有文獻(xiàn)報(bào)道了其對RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞株早期炎癥因子的影響[12]，然而對于二氫楊梅素是否可以減輕小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的晚期炎癥因子HMGB1的釋放，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。在本研究中，我們利用BV2細(xì)胞，探究二氫楊梅素對脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)HMGB1釋放的抑制作用，并探討其潛在作用機(jī)制，尋找缺血性卒中的潛在臨床治療手段。

1 材料和方法

1.1 試劑 二氫楊梅素(CAS號27200-12-0，純度98%)、LPS購自美國Sigma公司，BV2細(xì)胞株購買自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。HMGB1和磷酸化絲氨酸(serine)抗體購于Abcam公司，JAK2、STAT3、p-JAK2和p-STAT3抗體均購自美國Cell Signaling公司，GAPDH、Lamin B、細(xì)胞核質(zhì)分離試劑盒購于巴傲得生物科技有限公司。CCK-8試劑盒購自碧云天公司。HMGB1檢測Elisa試劑盒購于武漢華美生物試劑公司。蛋白A/G偶聯(lián)的瓊脂糖磁珠購自Millipore公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) BV2細(xì)胞用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的高糖DMEM完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每天換液，每2 d傳代1次，實(shí)驗(yàn)使用均為對數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞活性 將BV2細(xì)胞以每孔4×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，待細(xì)胞生長過夜貼壁后，與不同濃度二氫楊梅素(10 μmol/L，30 μmol/L，50 μmol/L)共孵育24 h，然后每孔加入10 μl CCK-8工作液，37 ℃孵育2 h，于450 nm波長下檢測光密度值。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附(Elisa)法檢測HMGB1含量 將BV2細(xì)胞接種于12孔板中，待細(xì)胞生長過夜貼壁，用不同濃度的二氫楊梅素(10 μmol/L，30 μmol/L，50 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞2 h，繼而用LPS(500 ng/ml)刺激或不刺激細(xì)胞18 h，收取細(xì)胞培養(yǎng)液上清，3000 r/min離心10 min去除細(xì)胞碎片。釋放的HMGB1表達(dá)水平用雙抗夾心法測定，具體的操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品，確定樣品中HMGB1的含量。

1.5 細(xì)胞核質(zhì)分離 將藥物處理的細(xì)胞用PBS(4 ℃)洗滌2遍，棄去PBS后加入細(xì)胞質(zhì)裂解液(RLA)，冰上孵育20 min，3000 r/min離心15 min，所得上清液為胞質(zhì)蛋白。利用RLA洗滌沉淀，反復(fù)3次后，加入核裂解液(RIPA)，冰上孵育20 min，每隔5 min渦旋振蕩30 s，12500 rpm/min離心15 min，上清液為核蛋白。

1.6 免疫印跡與免疫共沉淀 將藥物處理的細(xì)胞用預(yù)冷PBS(4 ℃)洗滌2遍，棄去PBS后加入細(xì)胞裂解液(含蛋白酶抑制劑)冰上裂解30 min，接著用細(xì)胞刮板將細(xì)胞完全刮下，4 ℃，12500 r/min離心15 min，吸取上清蛋白。500 mg總蛋白中加入5 μg HMGB1抗體進(jìn)行免疫共沉淀分析，然后在旋轉(zhuǎn)混合器4 ℃過夜孵育，次日加入10%體積的預(yù)處理的蛋白 A/G 偶聯(lián)的瓊脂糖磁珠，旋轉(zhuǎn)混合器4 ℃孵育3 h，6000 r/min離心5 min，收集沉淀，利用細(xì)胞裂解液洗滌沉淀3次，最后利用上樣緩沖液打斷目的蛋白與磁珠之間的二硫鍵，得到上清蛋白。

每組樣品取等量蛋白上樣，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳約2 h后100 V恒壓120 min轉(zhuǎn)膜，接著用5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃一抗孵育過夜。次日用含0.05%Tween-20的TBS溶液洗膜3次，再用相應(yīng)種屬來源的二抗室溫孵育1 h，TBST清洗3次，化學(xué)發(fā)光法顯影，用Image J圖像分析系統(tǒng)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 低濃度的二氫楊梅素對BV2細(xì)胞活性無顯著影響 細(xì)胞活性的檢測結(jié)果如表1所示，與對照組相比，1～50 μmol/L的二氫楊梅素對BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活性影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但是高濃度的二氫楊梅素(80 μmol/L和100 μmol/L)顯著降低了BV2細(xì)胞活性。因此，本實(shí)驗(yàn)所用的劑量在50 μmol/L范圍內(nèi)。

2.2 二氫楊梅素抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞HMGB1的釋放 Elisa實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPS能顯著引起B(yǎng)V2細(xì)胞HMGB1的釋放，而不同濃度二氫楊梅素預(yù)處理組HMGB1的釋放明顯低于LPS刺激組，并且抑制效應(yīng)呈濃度依賴性(見圖1)。

2.3 二氫楊梅素抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞HMGB1的核/質(zhì)轉(zhuǎn)位 核質(zhì)分離的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(見圖2)，LPS刺激BV2細(xì)胞12 h，大量的HMGB1蛋白由細(xì)胞核轉(zhuǎn)位至細(xì)胞質(zhì)，而二氫楊梅素預(yù)處理組的BV2細(xì)胞，細(xì)胞核內(nèi)的HMGB1蛋白含量明顯高于LPS組，而轉(zhuǎn)位至細(xì)胞質(zhì)的HMGB1含量顯著低于LPS組，說明二氫楊梅素有效的抑制了LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞HMGB1的核/質(zhì)轉(zhuǎn)位。

2.4 二氫楊梅素抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞HMGB1的磷酸化 免疫共沉淀的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著LPS刺激時(shí)間的延長，HMGB1自身的磷酸化水平也隨之增高，4 h磷酸化水平達(dá)到最高點(diǎn)，而二氫楊梅素預(yù)處理顯著抑制了HMGB1的磷酸化(見圖3)。

2.5 二氫楊梅素抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞JAK2-STAT3信號通路激活 LPS刺激BV2細(xì)胞后，JAK2、STAT3磷酸化增加，用二氫楊梅素預(yù)處理BV2細(xì)胞2 h，然后用LPS處理1 h，免疫印跡結(jié)果顯示，二氫楊梅素組細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3水平明顯下調(diào)(見圖4)。

表1 二氫楊梅素對BV2細(xì)胞活性的影響

與對照組比較，*P<0.05 ，**P<0.01

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖1 二氫楊梅素抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞HMGB1釋放

與LPS組比較，**P<0.01

圖2 二氫楊梅素抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞HMGB1的核/質(zhì)轉(zhuǎn)位

圖3 二氫楊梅素抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞HMGB1的磷酸化

與對照組比較，**P<0.01；與LPS組比較，##P<0.01

圖4 二氫楊梅素對LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞JAK2-STAT3信號通路激活的影響

3 討 論

從發(fā)現(xiàn)HMGB1至今已有30余年的歷史，因其分子質(zhì)量小，在SDS-PAGE電泳時(shí)泳動(dòng)速度快而得名。Wang等首次發(fā)現(xiàn)HMGB1是內(nèi)毒素血癥的炎性介質(zhì)，與IL-1β、TNF-α這些經(jīng)典的早期炎癥因子相比，有表達(dá)高峰晚且持續(xù)時(shí)間長的特點(diǎn)[13]。近來的研究發(fā)現(xiàn)：HMGB1可以直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，擴(kuò)大MCAO大鼠的梗死面積，并且加劇神經(jīng)功能損傷[14，15]。臨床研究顯示，腦缺血患者血漿HMGB1水平顯著高于對照組，與缺血性卒中嚴(yán)重程度以及1年時(shí)功能轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[16]。利用HMGB1的單克隆抗體或者干擾RNA能顯著減少M(fèi)CAO模型大鼠的腦損傷[9]。因此，充分了解HMGB1在腦缺血中的作用機(jī)制，尋找可靠有效的HMGB1抑制劑，有望為缺血性卒中的治療帶來新的方向。

小膠質(zhì)細(xì)胞是介導(dǎo)神經(jīng)炎癥最主要的細(xì)胞，同時(shí)也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)第一道免疫防線，過度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋放包括HMGB1在內(nèi)的大量炎性因子，導(dǎo)致神經(jīng)元壞死與凋亡，引發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)損傷[3，17]。體外OGD細(xì)胞模型研究中還發(fā)現(xiàn)，HMGB1能由神經(jīng)元分泌，繼而通過識(shí)別小膠質(zhì)細(xì)胞上的HMGB1受體激活小膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)一步促進(jìn)并加重缺血再灌注損傷[15]。BV2細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后能夠生成NO等炎癥因子，激活NF-κB信號通路，能與T細(xì)胞、神經(jīng)元相互作用[18]。

二氫楊梅素是一種具有藥用價(jià)值的黃酮類物質(zhì)，近年的研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗氧化、解酒護(hù)肝、抗病原微生物、抗炎等藥理作用，在LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中，其通過抑制IκB磷酸化、NF-κB的核轉(zhuǎn)運(yùn)抑制炎癥反應(yīng)[12]。本研究主要探討了二氫楊梅素對LPS誘導(dǎo)后BV2細(xì)胞HMGB1核/質(zhì)轉(zhuǎn)位及釋放的作用，并對其可能的機(jī)制進(jìn)行了探究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素能抑制LPS誘導(dǎo)的HMGB1釋放，并且抑制效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴性。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1的核/質(zhì)轉(zhuǎn)位是其由細(xì)胞釋放到胞外的前提，實(shí)驗(yàn)中我們利用核質(zhì)分離觀察二氫楊梅素對HMGB1轉(zhuǎn)位的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素能夠抑制HMGB1從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位。研究指出，HMGB1的轉(zhuǎn)位和釋放以自身磷酸化為前提[19]，同時(shí)Youn等發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中磷酸化的HMGB1不能自由的入核[20]。我們進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，二氫楊梅素的預(yù)處理能顯著減少LPS誘導(dǎo)后BV2細(xì)胞HMGB1的磷酸化水平。研究證實(shí)JAK2-STAT3信號途徑參與HMGB1的釋放，該通路的抑制劑AG490被證實(shí)具有減少HMGB1從巨噬細(xì)胞中釋放的能力[21，22]，我們進(jìn)一步檢測了JAK2-STAT3信號通路的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素可抑制LPS激活的JAK2-STAT3信號通路。這些結(jié)果說明，二氫楊梅素可以抑制LPS誘導(dǎo)后BV2細(xì)胞HMGB1核/質(zhì)轉(zhuǎn)位和釋放，其潛在機(jī)制可能與HMGB1的磷酸化以及JAK2-STAT3信號通路有關(guān)。

本研究初步證實(shí)二氫楊梅素預(yù)處理能抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞HMGB1的釋放，提示二氫楊梅素具有抗神經(jīng)炎癥的作用。通過潛在機(jī)制的探究，為臨床治療缺血性卒中的神經(jīng)炎性反應(yīng)提供了一定的理論依據(jù)。本研究只涉及BV2細(xì)胞的體外研究，在動(dòng)物模型上的進(jìn)一步探討將是我們未來研究的重點(diǎn)。

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Inhibitory effects of ampelopsin on translocation and secretion of HMGB1 in BV2 microglial cells induced by LPS

LIU Yi，XU Yun，CAO Xiang.

(Department of Neurology，Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School，Nanjing，Jiangsu 210008，China)

Objective To investigate the effects of ampelopsin (AMP) on the nuclear/cytosolic translocation and secretion of high mobility group box1 (HMGB1) in BV2 cells induced by lipopolysaccharide (LPS). Methods Different concentrations of ampelopsin (10 μmol/L，30 μmol/L，50 μmol/L) were added to LPS-treated BV2 cells. The secretion level of HMGB1 was examined by specific Elisa assays. We further investigated whether ampelopsin could block HMGB1 translocation from nuclear to cytoplasm during LPS treatments. The effect of ampelopsin on HMGB1 phosphorylation was detected by co-immunoprecipitation. The expression of phosphorylated JAK2 and STAT3 were detected by Western blotting. Results Ampelopsin at the dose of 50 μmol/L markedly attenuated HMGB1 secretion after LPS treatment. The levels of nuclear HMGB1 were decreased and HMGB1 was accumulated in the cytoplasm after LPS. However，ampelopsin treatment obviously inhibited nucleus to cytoplasm translocation of HMGB1.Co-immunoprecipitation results showed that ampelopsin pretreatment blocked HMGB1 phosphorylation. Western blotting revealed that ampelopsin significantly down-regulated the phosphorylation of JAK2-STAT3 pathway in LPS-stimulated BV2 cells. Conclusion Pretreatment with ampelopsin before LPS suppressed HMGB1 secretion from activated microglia and its nuclear/cytosolic translocation through interfering with both JAK2/STAT3 signaling pathways and HMGB1 phosphorylation.

Ampelopsin； Lipopolysaccharide； BV2 cells； High mobility group box1

1003-2754(2016)11-0969-04

2016-09-15；

2016-10-04

國家自然科學(xué)基金(No. 81230026)；南京大學(xué)中央高?；究蒲许?xiàng)目(No. 021414380132)；江蘇省博士后科研資助計(jì)劃(No. 1601009C)

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 南京 210008)

曹 翔，E-mail：xiangcao1988@163.com

R966

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