白羊 章永壘 鄒有土 黃奮飛 陳勝亮 阮卡 葛平輝 馬燕玲王明灶 陳星

（未名生物醫(yī)藥有限公司，廈門 361009）

重組人βNGF在大腸桿菌中的可溶表達、純化及活性鑒定

白羊 章永壘 鄒有土 黃奮飛 陳勝亮 阮卡 葛平輝 馬燕玲王明灶 陳星

（未名生物醫(yī)藥有限公司，廈門 361009）

旨在大腸桿菌中可溶表達重組人神經(jīng)生長因子（Recombinant human β nerve growth factor，rhβNGF），并對表達產(chǎn)物進行分離純化和生物學活性鑒定。成功擴增hNGF β亞基基因，將其克隆入pMAL-c2X表達載體，構建了hβNGF-MBP的大腸桿菌表達體系并進行誘導表達，表達產(chǎn)物經(jīng)純化后以Factor Xa酶切去除麥牙糖結合蛋白（MBP），Western blot鑒定后以TF-1細胞法檢測生物學活性。結果顯示，pMAL-c2X-hβNGF經(jīng)酶切和測序證實構建正確，25℃、180 r/min、0.5 mmol/L IPTG誘導下可溶表達hβNGF-MBP融合蛋白。hβNGF-MBP經(jīng)Factor Xa酶切后可去除MBP標簽，SDS-PAGE分析純化的hβNGF位于13 kD左右，純度可達95%。Western blot鑒定為hβNGF，結果表明，比活約為1×106U/mg。在大腸桿菌中成功可溶表達hβNGF，并具有較高的生物學活性。

人神經(jīng)生長因子；大腸桿菌；可溶表達；生物學活性

神經(jīng)生長因子（Nerve growth factor，NGF）是最早被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，是具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突起生長雙重生物學功能的一種神經(jīng)細胞生長調(diào)節(jié)因子，其對多種細胞特別是中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的調(diào)控作用［1］。NGF具有重要的臨床價值，目前已被廣泛用于中樞以及周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中，還具有抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)人免疫系統(tǒng)、促進傷口修復等非神經(jīng)系統(tǒng)方面的作用［2，3］。NGF包含α、β、γ三個亞基，其中β亞基具有完整的NGF生物學活性，目前臨床使用的NGF主要來源于小鼠頜下腺提取的鼠βNGF（mβNGF）［4］。與mβNGF相比，重組人βNGF（rhβNGF）具有易獲得、高產(chǎn)率、高活性、成本低廉與無免疫原性等特點，建立高效、穩(wěn)定的hβNGF重組表達系統(tǒng)具有重要的臨床意義和商業(yè)價值［5］。

大腸桿菌是最廣泛應用于表達各種外源基因的表達系統(tǒng)，其重組表達NGF多以包涵體形式獲得，獲得具有活性的NGF需要進行復雜的變性、復性操作，且活性較低，不利于大規(guī)模工業(yè)化過程［6-9］。麥芽糖結合蛋白（Maletose-binding protein，MBP）是大腸桿菌中麥芽糖積累途徑中的一種關鍵蛋白質(zhì)，MBP具有強助溶作用，將其與外源蛋白融合表達可顯著提高外源蛋白的可溶表達，從而簡化技術步驟，提高外源蛋白活性［10，11］。但目前，尚未有成功利用MBP重組表達可溶NGF的報道。因此，本研究擬利用基因工程手段將hβNGF通過自帶MBP的pMAL-c2X質(zhì)粒載體重組在大腸桿菌中，構建一種成熟、穩(wěn)定、高效的表達系統(tǒng)，從而獲得大量具有天然活性的rhβNGF。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 大腸桿菌E. coli TOP10、BL21（DE3），北京全式金生物技術有限公司；質(zhì)粒pMAL-c2x，Novagen公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 限制性內(nèi)切酶、T4連接酶，F(xiàn)ermentas公司；PCR反應試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司；凝血酶因子Xa試劑盒，Novagen公司；兔抗NGF IgG、羊抗兔IgG， Chemicon公司；NGF國際標準品（NIBSC 93/556，10 000 U/支）；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

美譜達UV-1200可見分光光度計；GS2 PCR儀；Bio-Rad Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)；SANYO MPR-1410層析冷柜；?KTA Purifier 100蛋白純化系統(tǒng)；BECKMAN COULTER Avanti J-26XP離心機；BECKMAN MICROFUGE 22R微量臺式離心機。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)GenBank中hβNGF基因序列（118 aa），以本實驗室保存的人神經(jīng)生長因子cDNA序列為模板，利用上下游引物擴增NGF成熟肽編碼基因。引物為mbp-hβNGF-F：AGGGAAGGAGTTCATCCCATCCCATCTTCCAC（下劃線為Xmn I酶切位點），mbp-hβNGF-R：CCAAGCTTTCATCTCACAGCCTTCCTGCTGAG（下劃線為Hind III酶切位點），引物由TaKaRa公司合成。

1.2.2 目的基因的克隆和表達工程菌的構建 PCR擴增目的基因，膠回收目的基因片段。利用限制性內(nèi)切酶Xmn I和Hind III對預插入目的片段的原核表達載體pMAL-c2X分別進行雙酶切，膠回收酶切后目的片段用T4 DNA Ligase將純化后的酶切產(chǎn)物與原核表達載體進行連接反應，將構建好的融合表達載體（pMAL-c2X-hβNGF）首先轉化到E.coli TOP10中，挑選的單菌落培養(yǎng)液進行菌液PCR檢測。提取質(zhì)粒DNA進行限制性酶切的鑒定，挑取酶切鑒定正確的質(zhì)粒進行測序，將鑒定正確的pMAL-c2X-hβNGF的重組質(zhì)粒轉化到大腸桿菌 BL21（DE3）表達菌株中。

1.2.3 目的蛋白誘導表達 用滅菌接菌環(huán)刮取-80℃凍存的甘油菌，劃線于瓊脂板上，在37℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)過夜，活化菌株。挑取單菌落接種于20 mL液體LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL Amp）中，37℃，300 r/min條件下振蕩培養(yǎng)約10-12 h。按1∶50的比例轉接于新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，37℃，300 r/min條件下振蕩培養(yǎng)至OD600≈0.8（約2.0-2.5 h）。分別在25℃和37℃兩個溫度下，轉速均為180 r/min，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導表達11 h。

1.2.4 表達產(chǎn)物的純化 離心收集菌體，以10 mL蛋白提取緩沖液重懸200 mL LB培養(yǎng)菌體，在冰水浴中進行超聲波破碎。4℃，12 000 r/min離心20min，收集上清，并用0.45 μm濾膜過濾。用MBP Trap HP（1 mL，5 mL）親和柱于?KTA Purifier 100蛋白純化系統(tǒng)進行純化，純化過程在4℃低溫層析柜中進行，分管收集洗脫液，檢測蛋白純度，SDSPAGE分析各組分。Factor Xa（4℃，16 h）切割親和層析獲得的hβNGF-MBP，然后用Superdex-7510/300GL凝膠過濾分離純化酶切后的hβNGF，SDS-PAGE分析純化后蛋白純度。

1.2.5 表達產(chǎn)物的Western blot鑒定 SDS-PAGE 電泳后，將膠在Transfer buffer中平衡30 min，15 V恒壓轉35 min（電流約75 mA）；用TBST洗膜3次，再在室溫下用封閉液封閉1 h；TBST洗膜后用一抗（兔抗NGF IgG）4℃孵育過夜；TBST洗膜后，加入酶標二抗（羊抗兔IgG-HRP）孵育2 h；TBST洗膜后加入底物（魯米諾）發(fā)光拍照。

1.2.6 生物學活性檢測 參照《2015版中國藥典》采用TF-1法測定神經(jīng)生長因子生物學活性［12］。TF-1細胞株用完全培養(yǎng)液于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，傳代后24-36 h用于生物學活性測定。在加有標準品溶液和供試品溶液100 μL的96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入細胞懸液100 μL（細胞濃度6×104個/mL），于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)72 h。每孔加入MTS溶液20 μL，于37℃、5% CO2條件下孵育3 h。將96孔細胞培養(yǎng)板放入酶標儀，以550 nm為參比波長，在波長490 nm處測定吸光度，以四參數(shù)回歸計算法處理實驗數(shù)據(jù)。

2 結果

2.1 hβNGF基因擴增產(chǎn)物的鑒定

hβNGF編碼基因序列的擴增結果如圖1所示。hβNGF成熟肽共118 aa，編碼序列共354 bp，加上15 bp的酶切識別位點和保護堿基共369 bp。擴增條帶大小符合預期。

2.2 pMAL-c2X-hβNGF表達載體的構建及鑒定

4個單菌落的培養(yǎng)物經(jīng)PCR驗證均為陽性克隆，表明NGF成熟肽編碼序列已經(jīng)插入到載體中（圖2）。進一步培養(yǎng)重組菌提取pMAL-c2X-hβNGF重組質(zhì)粒，也進行Xmn I和Hind III雙酶切鑒定，結果（圖3泳道4）顯示，在500 bp與250 bp之間可見酶切下來的NGF片段。對最終結果進行測序鑒定，測序結果與天然序列進行比對，確定序列插入正確且不存在突變或移碼。

圖1 hβNGF基因PCR產(chǎn)物檢測

圖2 陽性轉化子的PCR鑒定

圖3 pMAL-c2X-hβNGF質(zhì)粒的雙酶切鑒定

2.3 hβNGF-MBP的重組表達

在不同的溫度下重組表達hβNGF，結果如圖4所示。泳道1和泳道2對比可以明顯看出，利用該系統(tǒng)可以重組表達hβNGF-MBP，蛋白大小約56 kD符合預期；從泳道3和泳道4可知，37℃條件下，hβNGF-MBP基本以包涵體的形式表達；對比泳道3和泳道6可知，在25℃條件下，可獲得hβNGF-MBP的可溶性表達。

圖4 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測

2.4 hβNGF-MBP的純化

將超聲破碎的上清過MBP親和層析柱，以10 mmol/L 麥芽糖洗脫。結果（圖5）顯示，對比泳道1和泳道2，上清液有大量可溶性表達的MBP融合蛋白，洗脫獲得了純度較高的融合蛋白。

圖5 hβNGF-MBP純化的SDS-PAGE檢測

2.5 hβNGF-MBP酶切

純化獲得的hβNGF-MBP融合蛋白的緩沖液中僅含有10 mmol/L麥芽糖，可以直接利用Factor Xa去除MBP標簽。分別以0、0.5、2和8 U Factor Xa在25℃水浴條件下酶切約50 μg hβNGF-MBP 16 h，結果（圖6）顯示，0.5 U的Factor Xa切割效果與2 U和8 U Factor Xa的效果相當，切割下來的MBP標簽和hβNGF見圖中箭頭所指處。后續(xù)利用凝膠層析進行二次純化，效果較好，SDS-PAGE（圖7）分析顯示，hβNGF位于13 kD左右，灰度掃描指出純度達95%以上。以mNGF為對照，對表達產(chǎn)物進行Western blot分析，結果（圖8）顯示，重組產(chǎn)物與mNGF有一致的條帶，說明這重組子能有效表達hβNGF蛋白。

圖6 hβNGF-MBP標簽去除的SDS-PAGE檢測

圖7 純化得到hβNGF的DS-PAGE檢測

2.6 hβNGF的生物學活性檢測

以NGF國際活性標準品為對照，采用TF-1細胞法檢測hβNGF的活性，四參數(shù)回歸計算法處理檢測數(shù)據(jù)。結果（圖9）顯示，hβNGF的EC50約為2ng/mL，比活約為1×106U/mg，與活性標準品相當，說明hβNGF具有較高的活性。

圖8 hβNGF的Western blot鑒定

圖9 hβNGF活性檢測的量效曲線

3 討論

大腸桿菌表達系統(tǒng)是基因表達技術中應用最早和最廣泛的經(jīng)典表達系統(tǒng)，其重組表達目的蛋白具有很多的優(yōu)點，但其表達效率受到多種因素制約，特別是會形成不溶的包涵體，造成純化工藝繁瑣，蛋白活性受到影響［13，14］。包涵體形成的主要機制在于蛋白的合成速度過快，沒有足夠的時間進行正確的折疊，或者胞內(nèi)的還原環(huán)境不利于形成二硫鍵［15］。MBP作為一種分子伴侶，能有效阻止融合蛋白的折疊中間肽之間聚集沉淀，從而實現(xiàn)蛋白的可溶表達［16］。pMAL-c2X是一種自帶MBP基因的質(zhì)粒載體，將目的基因重組進pMAL-c2X載體可以獲得目的蛋白-MBP融合蛋白的可溶表達，目前已經(jīng)在多種目的蛋白的重組表達中應用。如劉中祿等［17］將人工合成的Tα1序列插入到pMAL-c2X質(zhì)粒載體中構建pMAL-c2X-Tα1融合表達質(zhì)粒，再插入大腸桿菌中進行表達，該菌株能有效表達可溶Tα1-MBP融合蛋白，融合蛋白占菌體蛋白的33.6%。宋琳琳等［18］以帶CTP基因序列的上游引物擴增Ub-HBcAg，將PCR產(chǎn)物克隆到pMAL-c2X質(zhì)粒載體并插入大腸桿菌BL21（DE3）中，誘導表達并以親和層析法純化融合蛋白，結果表明CTP-Ub-HBcAg原核表達載體并成功可溶表達，且能有效純化。

在本研究中，我們利用pMAL-c2X表達載體，構建了hβNGF-MBP的大腸桿菌表達體系并進行誘導表達，成功獲得了hβNGF-MBP融合蛋白的可溶表達。研究表明，融合蛋白的可溶表達需要適當降低蛋白的表達速度，如吳敬君等［19］以大腸桿菌重組表達肝素黃桿菌硫酸軟骨素酶AC-MBP融合蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，MBP融合蛋白在普通發(fā)酵條件下仍主要以包涵體的形式表達，通過降溫（15℃）才能實現(xiàn)融合蛋白的可溶表達。熊志紅等［20］以大腸桿菌重組表達另一種分子伴侶SUMO與hβNGF融合蛋白的研究中也發(fā)現(xiàn)，表達的融合蛋白依然以包涵體的形式存在。本研究中hβNGF-MBP融合蛋白在普通發(fā)酵條件下也主要以包涵體的形式表達，只有在低溫（25℃）、低轉速（180 r/min）、低IPTG添加量（0.5 mmol/L）的情況下能獲得可溶性表達，與上述研究的結論相似?？扇鼙磉_的hβNGF-MBP經(jīng)酶切、純化后，能獲得純度95%且經(jīng)Western blot鑒定的hβNGF，其比活高達1×106U/mg，生物學活性顯著高于目前市售的mβNGF產(chǎn)品［21］，從而為rhβNGF的規(guī)模化生產(chǎn)提供重要的技術基礎。

4 結論

本研究成功擴增hNGF β亞基基因，將其克隆入pMAL-c2X表達載體，構建了hβNGF-MBP的大腸桿菌表達體系，在低溫、低轉速、低IPTG條件下誘導表達獲得hβNGF-MBP融合蛋白的可溶表達，通過MBP親和層析、Xa酶切、凝膠層析，獲得了高純度（＞95%）、高活性（比活約為1×106U/mg）的hβNGF。

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（責任編輯 馬鑫）

Soluble Expression，Purification and Activity Assay of Recombinant Human βNGF Expressed in Escherichia coli

BAI Yang ZHANG Yong-lei ZOU You-tu HUANG Fen-fei CHEN Sheng-liang RUAN Ka GE Ping-hui MA Yan-ling WANG Ming-zao CHEN Xing
（Sinobioway Biomedicine Co.，Ltd.，Xiamen 361009）

The goal of this work is to express the recombinant human nerve growth factor（rhβNGF）in Escherichia coli in soluble form，to separate and purify the expressed products，and to determine the biological activity. First，hβNGF gene was amplified and then inserted into expression vector pMAL-c2X，then E. coli expression system of hβNGF-MBP was constructed and induced for expression. Further，the MBP in purified expressed products was cleaved by Factor Xa enzyme，after identified by Western blot，the biological activity was examined by TF-1 method. The results showed that enzyme digestion and sequencing confirmed that the recombinant plasmid pMAL-c2X-hβNGF was constructed correctly，hβNGF-MBP was secretory expressed under 2℃，180 r/min and 0.5 mmol/L IPTG induction. MBP tag in hβNGF-MBP was removed by Factor Xa digestion，and the purified hβNGF via SDS-PAGE was about 13 kD with the purity over 95%. The protein was identified as hβNGF by Western blot. The biological activity test showed that the specific activity was about 1×106U/mg. Overall，recombinant hβNGF was successfully expressed in E. coli in soluble form with high biological activity.

human nerve growth factor；Escherichia coli；soluble expression；biological activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.023

2016-03-23

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2011ZX09401-017）

白羊，男，碩士，研究方向：生物醫(yī)藥研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化；E-mail：alamo1985@163.com

陳星，女，碩士，研究方向：生物醫(yī)藥研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化；E-mail：amable24@163.com