張彬 王長利

（天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院肺部腫瘤科 國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心 天津市腫瘤防治重點實驗室，天津 300060）

端粒長度檢測方法及其應用

張彬 王長利

（天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院肺部腫瘤科 國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心 天津市腫瘤防治重點實驗室，天津 300060）

人類的衰老與腫瘤的發(fā)生是影響人壽命的重要因素，幾十年來的研究表明端粒長度的變化在這兩個進程中扮演了極其重要的角色，因此熟知分析端粒長度的方法就顯得非常重要。目前，有多種端粒長度檢測的方法，包括端粒末端限制性片段分析（terminal restriction fragment，TRF），定量PCR（qPCR），熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）和單鏈端粒長度分析（single telomere length analysis，STELA）等。但每種方法都有適用的范圍，在研究和應用過程中需要熟知各種方法的原理、優(yōu)勢和局限，從而選擇合適的檢測方法，才能達到我們的研究目的，解決具體問題。因此將對目前常用的端粒長度檢測方法進行綜述。

端粒長度；端粒末端限制性片段分析；定量PCR；熒光原位雜交；單鏈端粒長度分析

端粒是真核染色體末端一段特殊的結構，由端粒重復序列和端粒結合蛋白組成。端粒能夠防止染色體末端的降解、融合和重排，從而在維持染色體的完整性和穩(wěn)定性上起重要作用［1-3］。人類二倍體細胞有46條染色體92個端粒，序列是由富含G的短雙鏈重復序列TTAGGG串聯(lián)組成，雙鏈區(qū)長度一般在0.5-20 kb。其中富含G堿基的一條鏈在3'末端比其互補鏈多出100-200 bp核苷酸，形成一條突出的3'單鏈DNA。這條突出的端粒單鏈DNA被反折插入到端粒DNA的雙鏈區(qū)，從而使染色體DNA終止于一種T型環(huán)（T-Loop）結構，將末端端粒DNA與細胞內環(huán)境隔絕，端粒作為染色體的保護性帽來防止DNA損傷信號對染色體末端的識別［4，5］。鄰近端粒重復序列的區(qū)域被稱作亞端粒（sub-telomere）區(qū)，目前亞端粒的功能并不完全清楚［6］。

由于DNA聚合酶不能完整的復制染色體的末端（DNA復制問題），幾乎所有的正常人體細胞會隨著細胞分裂出現(xiàn)端粒逐漸縮短并最終引發(fā)細胞復制性衰老，端粒是細胞衰老的分子鐘［7］。一部分喪失關鍵細胞周期檢測點功能的細胞會躍過細胞復制性衰老繼續(xù)分裂最終進入危機期。這個時期的極少數(shù)細胞獲得了端粒酶活性，并且繼續(xù)分裂轉化為腫瘤細胞。端粒在人類的衰老與腫瘤的發(fā)生進程中扮演了極其重要的角色，端粒重復序列的長度的變化決定著細胞的命運。因此，端粒長度檢測是端粒生物學研究中的重要實驗方法。此外，端粒長度檢測在衰老疾病和腫瘤中也具有重要診斷價值［8-11］。就目前而言，最常用的端粒長度檢測方法包括：端粒末端限制性片段分析（terminal restriction fragment，TRF），定量PCR（qPCR），熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）和單鏈端粒長度分析（single telomere length analysis，STELA）。但每一種檢測方法都有其獨有的特點，我們有必要對端粒長度的檢測方法進行比較分析，了解每種方法的優(yōu)勢和局限及適用范圍，以便于在研究時選擇合適的端粒長度檢測方法。

1 端粒末端限制性片段分析（terminal restriction fragment，TRF）

端粒末端限制性片段分析是最早最經(jīng)典的端粒長度檢測的方法，此方法也被認為是端粒長度檢測的金標準。此方法是評估群體細胞的平均端粒長度。根據(jù)端粒序列特異且重復的特性，用一組缺乏端粒識別位點的頻繁切割限制性內切酶（如Hinf I和Rsa I）消化基因組DNA，基因組DNA被消化成短片段，端粒DNA不被切割以較長的片段保留。不同長度的DNA消化產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上分離，用端粒DNA特異的探針通過Southern blotting方法檢測端粒長度［12，13］。不同長度的端粒產(chǎn)生彌散的信號（圖1），通過軟件與已知分子量DNA 梯度條帶比較來評估平均端粒長度，通過標準化參照樣本來修正實驗之間的“膠效應”。

用此方法來檢測端粒長度時，提取的基因組DNA的完整性對定量端粒長度十分重要，DNA降解會導致對端粒長度評估的不準確，因此提取過程要注意不要污染核酸酶，存儲時要分裝避免反復凍融。此方法的優(yōu)勢是不需要特殊的設備，經(jīng)濟，易于操作，錯誤相對較小，是評價其他新的端粒長度檢測技術的標準方法。TRF目前仍是端粒生物學研究最常用的端粒長度檢測方法。TRF 的局限在于需要的DNA量多，另外由于短端粒與探針結合的效率不高，TRF對檢測較短的端粒是不敏感的，而最短的端粒很可能在誘發(fā)DNA損傷中具有重要作用［14］。此外，這種方法檢測的端粒包含了亞端粒DNA，因此有可能過多評估端粒長度。

圖1 腫瘤細胞端粒末端限制性片段分析

2 定量PCR（quantitative PCR，qPCR）

為了克服分析端粒長度需要DNA量多的局限，PCR為基礎的端粒長度檢測方法得以研發(fā)，應用較廣泛的是2002年Cawthon［15］報道的qPCR和之后改進的MMqPCR方法［16］。用與端粒C鏈和G鏈都能退火但與其他堿基不匹配的引物通過PCR擴增端粒，前兩個循環(huán)用低溫退火使引物與端粒DNA模板配對產(chǎn)生端粒產(chǎn)物，其余循環(huán)用高溫退火確保僅擴增前兩個循環(huán)得到的端粒產(chǎn)物（抑制引物和端粒DNA模板退火和引物二聚體產(chǎn)生）。端粒擴增產(chǎn)物（T）的量與另一管中擴增的單拷貝基因的量（S）進行比值來對端粒長度定量。然而在配制T反應管和S反應管溶液時，由于吸取體積產(chǎn)生的誤差可能降低檢測的精確性。2009年Cawthon［16］改進了這種方法使端粒和單拷貝基因在同一管中完成擴增，此方法稱為MMqPCR方法。改進的MMqPCR方法使得來源于不同質量的DNA樣本可以比較，而且端粒和單拷貝基因本身擴增效率的差異可以用比值來控制。2011年O'Callaghan 和 Fenech［17］也對qPCR方法進行了改進稱為aTL qPCR，這種方法使用標準曲線，標準曲線是根據(jù)一系列14拷貝TTAGGG序列（84 bp長）稀釋值繪制的，可以評估樣本端粒堿基對的長度。

qPCR同樣需要高質量的DNA，但需要的DNA量很少（ng）。另外，這種方法比較經(jīng)濟，需要的設備容易獲得（定量PCR儀），并且可以用于高通量檢測，適用于臨床診斷和流行病學等大規(guī)模樣本研究?；赑CR的端粒長度檢測方法已經(jīng)對GERA（genetic epidemiology research on adult health and aging）隊列研究中的約100 000例唾液DNA樣本進行了端粒長度檢測，并分析了端粒長度與年齡的相關性［18］。這項研究是迄今為止最大樣本量的相對端粒長度分析。qPCR的局限是需要擴增對照基因，而擴增的對照基因在基因組中是獨特的，其拷貝數(shù)的變異和染色體的復制會改變基因拷貝數(shù)，從而顯著改變T/S值。因此，qPCR法只適合用于二倍體和核型穩(wěn)定的細胞和樣本，轉化細胞系和腫瘤組織樣本是不適合的。此外，與TRF一樣只能評估平均端粒長度，而且樣本內和樣本間的差異還是比較高的，不同實驗室得出的結果相差很大。TRF方法變異系數(shù)是1.74%，qPCR方法的變異系數(shù)是6.45%，說明qPCR法分析端粒長度的精確性和穩(wěn)定性不高。

3 定量熒光原位雜交（quantitative fluorescence in situ hybridization，Q-FISH）

Q-FISH是用熒光標記的（CCCTAA）3肽核酸探針與分裂中期細胞的變性端粒DNA重復序列雜交，熒光信號可以被檢測，通過軟件與已知端粒長度的標準品比對來分析端粒長度［19，20］。Q-FISH能檢測每條染色體上的端粒長度，Q-FISH還能檢測極短端粒重復序列（＜0.5 kb）的末端和端粒融合事件。分裂中期Q-FISH分析不僅能評估不同染色體端粒的差異也能分析無端粒染色體不穩(wěn)定的頻率。這種方法可以研究多種背景下的端粒生物學，對于檢測細胞量較少的細胞端粒長度也是比較好的方法。局限是不能檢測衰老細胞、不分裂細胞和高度畸變細胞的端粒，對檢測低有絲分裂指數(shù)的細胞型也是很困難的。隨后又研究了改進的方法分裂間期（Interphase）Q-FISH，這種方法能夠分析來源于分裂間期血細胞和組織切片細胞的端粒長度，通過端粒探針熒光信號和中心體探針信號的比值分析端粒長度［21］。這種方法的優(yōu)勢在于對組織切片進行Q-FISH分析能同時獲得端粒長度和病理學特征的信息。但是，組織切片可能不含有完整的胞核，此外分裂間期Q-FISH不能分析每個染色體端粒長度和無端粒染色體，得出的也是平均端粒長度。

自動化高通量Q-FISH（HT Q-FISH）適用于大樣本的研究。如Canela等［22］用HT Q-FISH的方法檢測了198例健康人外周血淋巴細胞的端粒，發(fā)現(xiàn)了年齡、性別和地理區(qū)域對端粒長度的影響。Tengumnuay等［23］用HT Q-FISH的方法檢測了間充質干細胞的端粒長度，通過檢測間充質干細胞的端粒長度能夠評估細胞復制能力從而篩選適合用于治療的間充質干細胞。但HT Q-FISH檢測精確性和內在的重復性是有限的。

4 流式熒光原位雜交（flow cytometry and flow fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)low FISH）

Flow FISH是用熒光標記的（CCCTAA）3肽核酸探針與懸浮細胞雜交，端粒熒光信號用流式細胞儀分析［24］。Flow FISH能夠精確檢測每個細胞的平均端粒長度，能夠用于檢測經(jīng)流式分離的細胞亞群（根據(jù)大小、抗體標記等）的端粒長度。Flow FISH因此廣泛用于檢測不同亞型造血細胞的端粒長度，后來通過使用半自動96孔板形式，F(xiàn)low FISH適用于更高通量的檢測，并且具有較好的重復性。

Flow FISH是第一個應用于臨床診斷的端粒長度檢測方法，如輔助診斷患有先天角化不良的病人［25，26］，這種方法也為推斷細胞中端粒信號的3維分布提供了一種手段。Flow FISH也比較適合血液中不同類型亞群細胞端粒長度分析，自動化的多色Flow FISH是目前最快最敏感的檢測人血液中粒細胞、T細胞、B細胞和天然殺傷細胞（NK）平均端粒長度的方法。目前已有商品化的Flow FISH試劑盒用于檢測體外擴增的NK細胞端粒長度，評估NK細胞的活性，用于腫瘤免疫治療。但是Flow-FISH要求完整的細胞核，粒細胞在體外制備不穩(wěn)定，而在體內半衰期也極短，如果檢測粒細胞的端粒長度，就要求迅速處理樣本。這也限制了其在流行病學研究的應用。Flow FISH的局限是檢測的也是平均端粒長度，對技術要求比較高，耗時且不易操作。

5 單鏈端粒長度分析（single telomere length analysis，STELA）

所有端粒末端都有富含G的3'單鏈突出，以突出的3'單鏈為模板退火并連接一個接頭到端粒的5'末端，以接頭引物和一條染色體上特異亞端粒引物擴增單個染色體端粒單鏈區(qū)。但不是所有端粒末端都有合適的用于設計亞端粒引物的序列，因此這種方法僅適合于幾個特征性染色體末端如XpYp、2p、11q、12q 和 17p［27］。STELA的優(yōu)勢是能通過少量樣本精確分析端粒長度，pg級的DNA就足夠用于分析，亞端粒引物的完整堿基是已知的，并且在細胞、樣本和個體間是比較穩(wěn)定的，因此分析的端粒長度比較精確。此法不需要特殊設備，能夠分析單個端粒，可以清楚分析自然縮短和異?？s短的端粒動態(tài)，也能夠分析不分裂的衰老細胞。非常適合于檢測異常短的端粒，而短端粒往往誘發(fā)衰老和產(chǎn)生融合。但STELA方法需要具備單分子PCR技術經(jīng)驗，對技術操作要求較高，操作過程比較耗時。盡管能檢測單個染色體末端端粒長度的微小改變，但不能代表細胞整體端粒長度狀態(tài)，也不適合分析較長的端粒（＞20 kb，如小鼠）。STELA是一種低通量的端粒長度檢測方法，不適合臨床應用。

6 基于全基因組測序（WGS）的端粒長度分析

隨著二代測序技術的發(fā)展和測序成本的下降，WGS在研究和臨床中的應用越來越廣泛。最近，WGS數(shù)據(jù)已經(jīng)被用于分析端粒長度［28，29］。端粒是基因組上的特殊生物學元件，WGS能夠捕獲端粒序列信息，通過生物信息學軟件可以分析WGS數(shù)據(jù)中端粒含量和長度。Parker等［30］用235個兒科腫瘤的WGS數(shù)據(jù)分析了腫瘤中端粒DNA含量的改變，提示在腫瘤進展過程中檢測端粒DNA的改變可能用于臨床診斷?；赪GS的端粒長度分析方法與qPCR法有較好的一致性，然而與TRF法一致性較差。由于WGS數(shù)據(jù)本身分析起來就十分復雜，WGS數(shù)據(jù)分析方法對端粒長度的預測會有較大影響。此外，WGS法依賴于細胞單倍體的已知染色體數(shù)，正常健康細胞單倍體染色體數(shù)是23，但腫瘤細胞通常是非整倍體。因此如果細胞倍數(shù)未知，基于WGS的端粒長度分析方法并不精確。

7 結語

表1 端粒長度檢測方法對比

對比分析這些端粒長度檢測方法（表1），我們可以看出并沒有任何一種單一的方法可以精確、簡單、快速的檢測端粒長度，因此端粒長度檢測方法的選擇需要根據(jù)具體的科學問題。TRF檢測的是平均端粒長度，檢測不到端粒的微小改變，從而不適合用于高精確度端粒長度分析，但仍是端粒長度分析方法的金標準及最常用方法之一。這種方法已經(jīng)廣泛應用于基礎研究、臨床研究和流行病學研究，基礎研究通常檢測培養(yǎng)的細胞或組織端粒長度，臨床研究和流行病學研究通常檢測外周血淋巴細胞的端粒長度。如果有大規(guī)模的樣本需要進行高通量檢測，例如流行病研究及臨床大樣本的端粒長度篩查，qPCR是比較好的選擇，qPCR用于流行病學研究有簡便、經(jīng)濟、高通量，DNA用量少等優(yōu)勢，但不適用于總體樣本數(shù)量少和精確度要求高的檢測。Flow FISH比qPCR更精確，更適用于臨床檢驗［31］。Q-FISH和STELA適合于小量樣本的實驗研究，它們需要的DNA很少（＜100 pg），樣本量較少較珍貴時可選擇這兩種方法。此外，這兩種方法高度精確，能檢測單個染色體異常短的端粒，從而適于基本端粒生物學問題的精細研究，但目前還不適用于流行病學研究?；赪GS的端粒分析方法是在二代測序技術快速發(fā)展和大量樣本W(wǎng)GS數(shù)據(jù)已知情況下新出現(xiàn)的方法，目前還存在很多問題，其應用還需進一步的探索。

端粒在衰老和腫瘤研究中是極為引人注目的，但就目前而言，沒有任何一種端粒檢測方法是通用的。在特定的實際應用或科學研究中，沒有選擇合適的端粒長度分析方法很可能導致錯誤的發(fā)現(xiàn)或阻礙其應用前景，因此必須根據(jù)實際需要而選擇最合適的端粒長度檢測方法。當然，由于目前每種方法都有一定的局限，同一樣本不同實驗室間檢測數(shù)據(jù)存在較大的差異［32］，這就要求我們對端粒長度檢測方法進行不斷的完善和創(chuàng)新，相信端粒檢測方法學的創(chuàng)新將會推動端?；A和流行病學研究及臨床應用的極大進展。

［1］Blackburn EH. Structure and function of telomeres［J］. Nature, 1991, 350：569-73.

［2］Blackburn EH. Switching and signaling at the telomere［J］. Cell, 2001, 106：661-73.

［3］Lu W, Zhang Y, Liu D, et al. Telomeres-structure, function, and regulation［J］. Experimental Cell Research, 2013, 319：133-41.

［4］Griffith JD, Comeau L, Rosenfield S, et al. Mammalian telomeres end in a large duplex loop［J］. Cell, 1999, 97：503-514.

［5］Sfeir A, de Lange T. Removal of shelterin reveals the telomere endprotection problem［J］. Science, 2012, 336：593-597.

［6］Mefford HC, Trask BJ. The complex structure and dynamic evolution of human subtelomeres［J］. Nature Reviews Genetics, 2002, 3：91-102.

［7］Blackburn EH. Telomere states and cell fates［J］. Nature, 2000, 408：53-56.

［8］Cawthon RM, Smith KR, O'Brien E, et al. Association between telomere length in blood and mortality in people aged 60 years or older［J］. Lancet, 2003, 361：393-395.

［9］Heaphy CM, Meeker AK. The potential utility of telomere-related markers for cancer diagnosis［J］. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2011, 15：1227-1238.

［10］Weischer M, Nordestgaard BG, Cawthon RM, et al. Short telomere length, cancer survival, and cancer risk in 47102 individuals［J］. Journal of the National Cancer Institute, 2013, 105：459-468.

［11］Seow WJ, Cawthon RM, Purdue MP, et al. Telomere length in white blood cell DNA and lung cancer：a pooled analysis of three prospective cohorts［J］. Cancer Research, 2014, 74：4090-4098.

［12］Kimura M, Stone RC, Hunt SC, et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths［J］. Nature Protocols, 2010, 5：1596-1607.

［13］Mender I, Shay JW. Telomere Restriction Fragment（TRF）analysis［J］. Bio-Protocol, 2015, 5（22）：e1658.

［14］Hemann M, Strong MA, Hao LY, et al. The shortest telomere, not average telomere length, is critical for cell viability and chromosome stability［J］. Cell, 2001, 107：67-77.

［15］Cawthon RM. Telomere measurement by quantitative PCR［J］. Nucleic Acids Research, 2002, 30：e47.

［16］Cawthon RM. Telomere length measurement by a novel monochrome multiplex quantitative PCR method［J］. Nucleic Acids Research, 2009, 37：e21.

［17］O'Callaghan NJ, Fenech M. A quantitative PCR method for measuring absolute telomere length［J］. Biological Procedures Online, 2011, 13：3.

［18］Lapham K, Kvale MN, Lin J, et al. Automated assay of telomerelength measurement and informatics for 100, 000 subjects in the genetic epidemiology research on adult health and aging（GERA）cohort［J］. Genetics, 2015, 200：1061-1072.

［19］Slijepcevic P. Telomere length measurement by Q-FISH［J］. Methods in Cell science：an Official Journal of the Society for in Vitro Biology, 2001, 23：17-22.

［20］Ferlicot S, Youssef N, Feneux D, et al. Measurement of telomere length on tissue sections using quantitative fluorescence in situ hybridization（Q-FISH）［J］. The Journal of Pathology, 2003, 200：661-666.

［21］Narath R, Lorch T, Greulich-Bode KM, et al. Automatic telomere length measurements in interphase nuclei by IQ-FISH［J］. Cytometry Part A：the Journal of the International Society for Analytical Cytology, 2005, 68：113-120.

［22］Canela A, Vera E, Klatt P, et al. High-throughput telomere length quantification by FISH and its application to human population studies［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007, 104：5300-5305.

［23］Toutain J, Prochazkova-Carlotti M, Horovitz J, et al. Evaluation of Quantitative Fluorescence in situ hybridization for relative measurement of telomere length in placental mesenchymal core cells［J］. Gynecologic and Obstetric Investigation, 2016, 81：54-60.

［24］Baerlocher GM, Vulto I, de Jong G, et al. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres（flow FISH）［J］. Nature Protocols, 2006, 1：2365-2376.

［25］Alter BP, Baerlocher GM, Savage SA, et al. Very short telomere length by flow fluorescence in situ hybridization identifies patients with dyskeratosis congenita［J］. Blood, 2007, 110：1439-47.

［26］Alter BP, Rosenberg PS, Giri N, et al. Telomere length is associated with disease severity and declines with age in dyskeratosis congenita［J］. Haematologica, 2012, 97：353-359.

［27］Britt-Compton B, Rowson J, Locke M, et al. Structural stability and chromosome-specific telomere length is governed by cis-acting determinants in humans［J］. Human Molecular Genetics, 2006, 15：725-733.

［28］Ding Z, Mangino M, Aviv A, et al. Estimating telomere length from whole genome sequence data［J］. Nucleic Acids Research, 2014, 42：e75.

［29］Lee M, Napier CE, Yang SF, et al. Comparative analysis of whole genome sequencing-based telomere length measurement techniques［J］. Methods, 2016, S1046-2023（16）-30263-8.

［30］Parker M, Chen X, Bahrami A, et al. Assessing telomeric DNA content in pediatric cancers using whole-genome sequencing data［J］. Genome Biology, 2012, 13：R113.

［31］Gutierrez-Rodrigues F, Santana-Lemos BA, Scheucher PS, et al. Direct comparison of flow-FISH and qPCR as diagnostic tests for telomere length measurement in humans［J］. PLoS One, 2014, 9：e113747.

［32］Martin-Ruiz CM, Baird D, Roger L, et al. Reproducibility of telomere length assessment：an international collaborative study［J］. International Journal of Epidemiology, 2015, 44：1673-1683.

（責任編輯 馬鑫）

Methods of Measuring Telomere Length and Its Application

ZHANG Bin WANG Chang-li
（Department of Lung Cancer, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, National Clinical Research Center for Cancer，Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Tianjin 300060）

Aging and tumor are the two main factors influencing human longevity. Many studies have proved that telomere play important roles in these progresses. Thus, it is critical to familiarize with assay methods of telomere length. The most commonly used methods include telomere restriction fragment（TRF）length analysis, quantitative PCR（qPCR）, fluorescent in situ hybridization（FISH）and single telomere length analysis（STELA）. However, each method has the scope of application, in the process of research and application, we have to understand the principle of each method, its advantages and disadvantages, then we may choose the appropriate detection method to achieve the aim of our study and solve specific issues. The commonly used detection methods of telomere length are summarized here.

telomere length；TRF；qPCR；FISH；STELA

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.012

2016-09-06

天津市抗癌重大專項（12ZCDZSY15400）

張彬，女，助理研究員，研究方向：端粒與腫瘤；E-mail：binzh1028@163.com

王長利，男，教授，研究方向：肺癌；E-mail：wangchangli309@163.com