劉國圣 張大樂

（河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，開封 475000）

功能性分子標(biāo)記在小麥育種中的應(yīng)用

劉國圣 張大樂

（河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，開封 475000）

功能標(biāo)記是根據(jù)與表型緊密相關(guān)的功能基因內(nèi)部特定區(qū)域的多態(tài)性序列，利用關(guān)聯(lián)分析、表達(dá)譜分析、RNA干擾和QTL作圖等方法開發(fā)而出的一種新型顯性分子標(biāo)記，此類標(biāo)記可以對不同遺傳背景下目標(biāo)等位基因的有無作直接、快速的判定。簡單介紹了功能標(biāo)記的概念及特點(diǎn)，著重探討功能標(biāo)記作為一種輔助育種手段在小麥育種中的應(yīng)用及其開發(fā)前景，以期為相關(guān)分子標(biāo)記的開發(fā)提供參考。

小麥；分子標(biāo)記；功能基因；輔助育種

遺傳標(biāo)記（genetic marker）是指在遺傳分析上用作標(biāo)記基因的方法，它可追蹤染色體或染色體某一節(jié)段以及某一個(gè)基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性，具有可遺傳性和可識(shí)別性的特征。遺傳標(biāo)記主要包括形態(tài)標(biāo)記（morphological maker）、細(xì)胞標(biāo)記（cytological maker）、生化標(biāo)記（biochemical maker）和分子標(biāo)記（molecular maker）［1］。由于前3種遺傳標(biāo)記可標(biāo)記的位點(diǎn)少并且受外界環(huán)境因素的影響比較大，因而在實(shí)際應(yīng)用中分子標(biāo)記是遺傳分析上較為普遍采用的方法。

分子標(biāo)記是繼形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記之后發(fā)展起來的一種較為理想的遺傳標(biāo)記，它是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映［2，3］。分子標(biāo)記具有較大的優(yōu)越性，如大多數(shù)分子標(biāo)記為共顯性，對隱性性狀的選擇十分便利；基因組變異極其豐富，分子標(biāo)記的數(shù)量幾乎是無限的；檢測手段簡單、迅速等。在過去的幾十年中，利用SSR（simple sequence repeats）、RFLP（restriction fragment length polymorphism）、AFLP（amplified fragment length polymorphisms）、RAPD（random amplified polymorphic DNA）和DArT（diversity arraystechnology）等標(biāo)記已構(gòu)建了一些攜帶重要基因染色體區(qū)域的分子標(biāo)記圖譜［4］。

然而，由于這些遺傳標(biāo)記與目標(biāo)基因具有一定距離，其預(yù)測值取決于標(biāo)記與目標(biāo)基因在特定群體中的連鎖程度，隨著繁殖代數(shù)增加，遺傳距離加大，其連鎖關(guān)系打破的概率會(huì)逐漸上升，使分子標(biāo)記輔助選擇的準(zhǔn)確性下降。相比之下，通過開發(fā)與表型相關(guān)的功能基因序列形成的功能標(biāo)記已成為DNA分子標(biāo)記的熱點(diǎn)，該標(biāo)記為顯性標(biāo)記，是分子育種中標(biāo)記輔助選擇的理想標(biāo)記。本文通過對功能標(biāo)記作為輔助育種手段在小麥中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為相關(guān)分子標(biāo)記的開發(fā)提供參考。

1 功能標(biāo)記（functional makers，F(xiàn)Ms）的概念

Andersen 等將功能標(biāo)記定義為基于與表型性狀緊密相關(guān)的功能基因內(nèi)部的多態(tài)性序列而開發(fā)的分子標(biāo)記［5］。相比隨機(jī) DNA 分子標(biāo)記（基于基因組中隨機(jī)多態(tài)性位點(diǎn)開發(fā)的標(biāo)記）和與目的基因連鎖的分子標(biāo)記（基于基因與基因之間的多態(tài)性位點(diǎn)開發(fā)的標(biāo)記），功能標(biāo)記直接反映作物的表型性狀。功能標(biāo)記的特點(diǎn)可以歸為以下幾點(diǎn)：（1）可準(zhǔn)確的檢測、鎖定目標(biāo)基因；（2）遺傳效應(yīng)值更加可靠；（3）能準(zhǔn)確反應(yīng)功能性等位基因的遺傳變異［6］。

功能標(biāo)記開發(fā)的首要條件是明確與作物表型性狀緊密相關(guān)的功能基因，目前關(guān)于基因功能鑒定的方法是根據(jù)相似功能基因之間的序列同源性推測表達(dá)序列可能具有的功能。另外，表達(dá)譜分析等高通量的檢測方法、RNA干擾、T-DNA轉(zhuǎn)座子、轉(zhuǎn)座子基因標(biāo)簽（插入突變體），QTL作圖、蛋白質(zhì)數(shù)量位點(diǎn)（protein quantityloci，PQLs）、激活標(biāo)記及病毒誘導(dǎo)基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）等也是鑒別功能基因的重要方法。目前，根據(jù)功能標(biāo)記開發(fā)的兩種有效策略：關(guān)聯(lián)分析方法和建立近等位基因系群體，可將功能標(biāo)記分為直接性功能標(biāo)記和間接性功能標(biāo)記。目前，已開發(fā)和利用最多的是直接性功能標(biāo)記。

1.1 間接性功能標(biāo)記（indirect functional marker，IFM）

功能性分子標(biāo)記開發(fā)的前提條件是多態(tài)性的等位基因序列。間接性功能標(biāo)記是一種以連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，是通過鑒定群體內(nèi)的目標(biāo)性狀與遺傳標(biāo)記的關(guān)聯(lián)性而獲得的［8］，一個(gè)群體內(nèi)不同座位等位基因之間的非隨機(jī)關(guān)聯(lián)被稱為連鎖不平衡。關(guān)聯(lián)性由關(guān)聯(lián)分析法計(jì)算得到，這種方法只在統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)方面提供了基因序列與目標(biāo)性狀之間關(guān)聯(lián)性的證據(jù)，具體的基因序列的多態(tài)性和目標(biāo)性狀的關(guān)系還需要直接類型的功能性分子標(biāo)記進(jìn)行證明。

1.2 直接性功能性分子標(biāo)記（direct functional maker，DFM）

直接性功能標(biāo)記是通過直接比較近等基因系中功能基因序列差異開發(fā)的，其中的等位功能基因序列可以通過同源重組（homologous recombination，HR）和定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)（targetinginduced local lesions in genomes，TILLING） 獲 得。TILLING技術(shù)具有快速、有效地鑒定和定向篩選突變的優(yōu)點(diǎn)［9］，通過借助高通量的檢測手段，可以對轉(zhuǎn)基因或化學(xué)誘變等途徑獲得的近等基因系進(jìn)行點(diǎn)突變的鑒定。由于化學(xué)誘變會(huì)產(chǎn)生大量的點(diǎn)突變，并且檢測單個(gè)點(diǎn)突變?nèi)匀槐容^困難，因而可以將經(jīng)過化學(xué)誘變的單株與其對照親本回交轉(zhuǎn)育，使其遺傳背景恢復(fù)到對照種水平構(gòu)建近等基因系。利用化學(xué)誘變構(gòu)建近等基因系并結(jié)合TILLING技術(shù)是目前最有效的檢測等位功能基因單核苷酸多態(tài)性的方法，由這種開發(fā)策略得到的功能性分子標(biāo)記被稱為直接類型功能性分子標(biāo)記。然而，由這種策略開發(fā)的直接性功能標(biāo)記費(fèi)用相對較高，目前通常采用的方法是首先通過關(guān)聯(lián)分析篩選候選功能基因，然后再利用獲得的近等基因系對等位功能基因序列直接比對，根據(jù)差異的核苷酸位點(diǎn)開發(fā)直接性功能標(biāo)記。

2 功能性分子標(biāo)記在中國小麥育種的應(yīng)用

小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一，全球有超過40%的人口以小麥為主食［11］。功能標(biāo)記作為一種新型的DNA分子標(biāo)記可以快速、準(zhǔn)確地檢測小麥品種資源所攜帶的基因，有效地提高后代選擇的準(zhǔn)確性［12，13］，從而縮短育種年限，加快育種步伐。目前，在小麥育種中已經(jīng)開發(fā)的功能標(biāo)記主要應(yīng)用在種質(zhì)資源純度鑒定、生長發(fā)育、抗病蟲、抗逆及品質(zhì)改良等方面（表1）。

表1 小麥中已開發(fā)功能標(biāo)記的目標(biāo)基因

續(xù)表

2.1 在小麥抗病性中的應(yīng)用

小麥條銹病是一種在世界范圍內(nèi)普遍流行的氣傳性病害，嚴(yán)重威脅小麥生產(chǎn)，而我國又是世界最大的小麥條銹病流行區(qū)，條銹菌生理小種的高度變異是造成該病流行的重要原因。伍玲等［52］根據(jù)與Lr34/Yr18/Pm38緊密連鎖的STS標(biāo)記csLV34和基于該基因第11外顯子等位變異開發(fā)了5對功能標(biāo)記 cssfr1-cssfr5，利用這6對功能標(biāo)記csLV34以及cssfr1-cssfr5對273個(gè)CIMMYT小麥品系的檢測結(jié)果和田間驗(yàn)證結(jié)果一致性為 96.7%，表明功能標(biāo)記csLV34和cssfr1-cssfr5 可準(zhǔn)確鑒定小麥的白粉病、葉銹病和條銹病，可應(yīng)用于小麥抗病育種。Liu等［54］克隆了3個(gè)與白粉病和條銹病相關(guān)基因PTaRtL、TaSBL和TaHLRG的完整ORF序列，并將PTaRtL和TaSBL的表達(dá)定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞核上。根據(jù)TaHLRG基因序列開發(fā)了一個(gè)功能標(biāo)記THR1，利用缺體-四體系將TaHLRG定位在小麥的6A染色體上。ANOVA分析結(jié)果驗(yàn)證了TaHLRG與小麥條銹病成株抗性的相關(guān)性。在對白粉病表現(xiàn)有成株抗性的DH群體白農(nóng)64/京雙16和F2：3群體魯麥21/京雙16中，TaHLRG可分別解釋抗、感表型變異的9.3%-9.7%和11.9%-20.5%。在對條銹病表現(xiàn)有成株抗性的F2：3群體Strampelli/輝縣紅中，TaHLRG基因可以解釋表型變異的11.8%-22.5%。

目前，利用功能性分子標(biāo)記研究條銹菌生理小種與抗病基因之間的關(guān)系已取得較大進(jìn)展，能較好地揭示抗病性內(nèi)在的分子機(jī)理，這對于抗條銹小麥品種培育以及條銹病防治具有重要意義。

2.2 在小麥抗逆性中的應(yīng)用

干旱是限制農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要逆境因子之一，我國人均的水資源占有量不足世界人均的1/4，且水資源的時(shí)空分布極不均勻。我國的小麥主產(chǎn)區(qū)大部分在干旱、半干旱地區(qū)，因而選育和推廣抗旱小麥品種、尋找與抗旱相關(guān)的基因，并開發(fā)特異性的分子標(biāo)記是促進(jìn)小麥生產(chǎn)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展的重要途徑。由于鐵結(jié)合蛋白（ferritin，F(xiàn)er）參與干旱脅迫應(yīng)答反應(yīng)，所以開發(fā)Fer基因抗旱相關(guān)的分子標(biāo)記可為抗旱小麥品種選育提供依據(jù)。鞠麗萍等［44］通過比對2個(gè)抗旱性強(qiáng)與2個(gè)抗旱性弱的小麥品種，在1A染色體上的鐵結(jié)合蛋白基因（TaFer-A1）基因序列上，發(fā)現(xiàn)TaFer-A1基因的第1個(gè)內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)有3個(gè)連續(xù)堿基的TCT缺失和插入，根據(jù)該變異位點(diǎn)開發(fā)出共顯性分子標(biāo)記 FerA1-intr1，并利用150 份抗旱性不同的小麥品系對該功能標(biāo)記進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明該標(biāo)記與小麥抗旱性密切相關(guān)。

硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）是植物體內(nèi)的一類多功能蛋白，參與光合作用中的電子傳遞、被氧化蛋白質(zhì)的修復(fù)、體內(nèi)活性氧的清除等生理代謝［13］。張帆等［46］選用旱地小麥品種晉麥47為試驗(yàn)材料，獲得了普通小麥硫氧還蛋白（Trx）超家族的1個(gè)新基因TaNRX，通過測序比較TNRX基因組全序列的差異，設(shè)計(jì)了4對顯性互補(bǔ)STS標(biāo)記（Tnrxa-1、Tnrxb-1、Tnrxa-2及 Tnrxb-2），并將TaNRX基因劃分為與抗旱相關(guān)的兩種等位變異TNrx-a與TNrx-b，分子標(biāo)記檢測為TNrx-a基因型群體后代和品種（系）的整體平均相對發(fā)芽率明顯高于TNrx-b基因型，說明開發(fā)的4個(gè)STS標(biāo)記可以進(jìn)行小麥抗旱性鑒定篩選，表明TNRX基因在小麥調(diào)控干旱脅迫的生理適應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用。

轉(zhuǎn)錄因子TaDREB1是受多種非生物脅迫誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)的調(diào)節(jié)基因，在小麥感受逆境脅迫后的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著重要的作用。Wei等［57］以4份六倍體小麥、3份普通小麥的二倍體野生近緣種和1份普通小麥的四倍體野生近緣種、1套以中國春為背景的缺四體和2個(gè)小麥遺傳作圖群體為材料，用直接測序的方法分析了TaDREB1基因的SNPs，并據(jù)此設(shè)計(jì)了一對可以穩(wěn)定檢測RIL群體雙親（Opata85和W7984）之間TaDREB1等位基因SNP的特異引物P40，利用該標(biāo)記將TaDREB1基因定位于3BS，位于Xfam61和Xfba91之間。并用缺四體和Southern雜交予以驗(yàn)證。

TaPP2Aa為小麥抗旱相關(guān)蛋白磷酸酶結(jié)構(gòu)亞基基因，因此開發(fā)功能標(biāo)記并作圖可為分子標(biāo)記輔助選擇抗逆育種提供依據(jù)。王智蘭等［45］以154份小麥種質(zhì)資源材料組成的自然群體、4個(gè)遺傳作圖群體、小麥野生近緣種和一套中國春缺四體為材料，將小麥抗旱候選基因TaPP2Aa定位在小麥第5同源染色體群上，其中TaPP2A-D基因開發(fā)的功能標(biāo)記定位區(qū)間及其鄰近區(qū)間檢測到一個(gè)抗逆性狀的QTL；在5B染色體的標(biāo)記區(qū)間檢測到分別控制穗長和株高的QTL，在其鄰近區(qū)間檢測到株高。株高旱脅迫系數(shù)和株高抗旱指數(shù)3個(gè)性狀共享的QTL區(qū)間。

蔗糖非發(fā)酵相關(guān)蛋白激酶家族2（sucrose nonfermentingl-related protein kinase2，SnRK2）參與逆境條件下植物體內(nèi)逆境信號傳遞和能量代謝，在抵御非生物脅迫和調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育等方面發(fā)揮重要的作用。張照貴等［55］利用中國春缺體-四體系將TaSnRK2.10定位到小麥第4同源群上，并根據(jù)TaSnRK2.10-4A基因序列1 907 bp處的序列差異開發(fā)了功能標(biāo)記TaSnRK2.10-4A-CAPS，將該功能標(biāo)記與128份材料的農(nóng)藝性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明，TaSnRK2.10-4A的兩種單倍型（Hap-4A-H和Hap-4A-L）的千粒重、株高和穗長在所有的環(huán)境條件下均達(dá)到了顯著差異。

目前，在小麥抗逆性方面已經(jīng)挖掘出不少基因，初步建立起了基因與小麥抗逆作用之間的關(guān)系，但對小麥抗性研究主要集中在抗性機(jī)理和遺傳分析及影響因素等方面，而通過分離克隆小麥的抗性相關(guān)基因，對其進(jìn)行基因功能分析及自身調(diào)控研究，進(jìn)而通過分子育種培育抗性小麥的文章還比較少。

2.3 在小麥品質(zhì)改良中的應(yīng)用

面粉顏色是決定小麥品質(zhì)的重要指標(biāo)，對面條及其它相關(guān)制品品質(zhì)有重要影響。小麥籽粒中的多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性、黃色素含量（kernel yellow pitmen）和籽粒顏色是影響面制品顏色性狀的重要指標(biāo)。多酚氧化酶是導(dǎo)致面制品在加工過程中發(fā)生酶促褐變的主要原因，黃色素含量過高將導(dǎo)致面粉黃度增加，同時(shí)面粉的白度降低，紅色籽粒小麥在磨粉時(shí)會(huì)隨著出粉率的升高造成鼓星混雜使面粉色澤變差，因此合適的酚氧化酶活性、黃素含量和籽粒顏色對小麥品質(zhì)具有重要意義。Sun等［14］和王曉波等［15］分別根據(jù)2A和2D染色體上PPO基因序列開發(fā)了籽粒PPO活性的共顯性功能標(biāo)記：PP018和STS01，可以區(qū)分2A和2D染色體上PPO基因的等位變異（PPO-2Aa1/bl，PPO-2Da2/b2），為深入了解中國小麥PPO基因的等位類型及其分布提供了可能。He等［24，25］克隆了普通小麥及其近緣種2A和2D染色體上PPO基因的全序列，并根據(jù)PPO-D1位點(diǎn)等位變異開發(fā)了一對互補(bǔ)的顯性標(biāo)記PP016和PP029，通過對217份中國冬小麥材料的檢測，確定了該互補(bǔ)標(biāo)記與PPO活性的相關(guān)性。以中優(yōu)9507/CA9632 DH群體為材料，將PP016與PP029被定位在2D染色體的長臂上，并與該區(qū)域的主效QTL共分離。

Wei等［18］以TaPod-A1基因的兩個(gè)等位變異（TaPod-A1a和TaPod-A1b）為依據(jù)，開發(fā)了一對顯性互補(bǔ)的功能標(biāo)記POD-3A1和POD-3A2。POD-3A1在TaPod-A1a的材料中僅能擴(kuò)增出291 bp的片段，與低POD活性相關(guān)。POD-3A2也只能在TaPod-A1b型的材料中擴(kuò)增出766 bp的片段，與高POD活性相關(guān)。利用此功能標(biāo)記POD-3A1和POD-3A2檢測281份來白3個(gè)麥區(qū)的小麥材料，不同麥區(qū)不同基因型的POD活性差異均達(dá)到5%顯著水平。此外，還利用豆麥/石4185RIL群體的214個(gè)品系對標(biāo)記進(jìn)行了驗(yàn)證，4個(gè)環(huán)境下不同基因型的POD活性差異達(dá)到1%顯著水平；同時(shí)QTL的分析結(jié)果表明QPod. caas-3AL即是TaPod-A1。因此，顯性互補(bǔ)的標(biāo)記POD-3A1和POD-3A2可有效地用于小麥POD活性的遺傳改良。

八氫番茄紅素合成酶（Psy）基因影響小麥谷物的黃色素（YP）含量，并與最終用途產(chǎn)品的質(zhì)量有關(guān)。周渭皓等［75］為研究我國小麥面粉色澤形成的分子機(jī)理，利用功能標(biāo)記YP7A、YP7A-2、YP7B-1、YP7B-2、YP7B-3、YP7B-4、YP7D-1和 YP7D-2對來自我國甘肅省的62份春小麥主栽品種Psy1位點(diǎn)的等位變異類型進(jìn)行了檢測，并對其黃色素含量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，擁有Psy-Ala、Psy-B1c和Psy-Dla基因型組合的小麥品種黃色素含量顯著高于其他基因型組合，而擁有Psy-Alb、Psy-Blc和Psy-Dla。基因型組合的小麥品種黃色素含量顯著低于其他基因型組合，為我國春小麥面粉色澤的遺傳改良提供重要信息。董長海等［29］克隆了與黃色素含量緊密相關(guān)的基因（TaPds-A1、TaPds-B1、TaLcye-B1和TaLcye-D1），針對TaPds-B1位點(diǎn)的2個(gè)等位變異TaPds-B1a和TaPds-B1b，開發(fā)了相應(yīng)的顯性標(biāo)記YP4B-1和YP4B-2；針對TaLcye-B1位點(diǎn)的等位變異TaLcye-B1a和TaLcye-B1b，開發(fā)了一個(gè)顯性標(biāo)記YP3B-1；針對TaZds-A1位的等位變異TaZds-A1a和TaZds-A1b開發(fā)了共顯性標(biāo)記YP2A-1，并可解釋11.30%的表型變異，TaZds-A1a基因型與低黃色素含量相關(guān)，而TaZds-A1b基因型與高黃色素含量相關(guān)。胡蘿卜素脫氫酶（Zds）影響小麥面制品色澤品質(zhì)的關(guān)鍵酶，Zhang等［27］根據(jù)TaZds-D1基因在染色體2DL的等位基因TaZds-D1a和TaZds-D1b的差異，開發(fā)了功能標(biāo)記YP2D-1。QTL分析證明這個(gè)標(biāo)記與小麥黃色素含量連鎖，并且對表型的貢獻(xiàn)率為18.4%。用該功能標(biāo)記檢測了71個(gè)DH群體，也證明它與黃色素含量有關(guān)，同時(shí)又用近300個(gè)小麥栽培品種（系）驗(yàn)證了該標(biāo)記的適用性。

小麥成熟期穗發(fā)芽是一種世界性的自然災(zāi)害，不僅影響產(chǎn)量，且嚴(yán)重惡化小麥的加工品質(zhì)和種用價(jià)值，給世界及我國各主要小麥產(chǎn)區(qū)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失?；騎amyb10屬于MYB家族的一種轉(zhuǎn)錄因子，決定著小麥種皮的顏色，同時(shí)對穗發(fā)芽杭性也具有一定影響。Yang等［63］依據(jù)普通小麥Vp1基因在穗發(fā)芽抗性與敏感品種中的差異開發(fā)出一個(gè)與穗發(fā)芽抗性相關(guān)的STS共顯性標(biāo)記Vp1B3，該標(biāo)記在抗性品種中擴(kuò)增出845 bp和569 bp的片段，在感性品種中擴(kuò)增出652 bp的片段，這一標(biāo)記更適合于白粒品種的穗發(fā)芽抗性篩選。Zhang等［22，70］以水稻控制籽粒休眠和籽粒大小的基因OsSdr4和OsGS3為候選基因，克隆小麥同源基因TaSdr和TaGS?；赥aSdr-A1基因643位點(diǎn)的SNP，開發(fā)了CAPS標(biāo)記Sdr2A，用此標(biāo)記檢測44份中國小麥品種，不同TaSdr-A1等位基因間發(fā)芽指數(shù)（GI）平均值差異不顯著。根據(jù)TaSdr-B1基因-11位點(diǎn)的SNP開發(fā)了CAPS標(biāo)記Sdr2B，可解釋表型變異的7.8%、6.4%和8.7%。根據(jù)TaGS-D1基因第2內(nèi)含子中40 bp的InDel，開發(fā)了1個(gè)共顯性標(biāo)記GS7D，最高可解釋千粒重表型變異的14.6%，解釋粒長表型變異的6.8%。

另外，在小麥品質(zhì)改良育種中，蛋白含量及其種類也是決定小麥品質(zhì)的重要因素。在六倍體小麥中，Slade 等［76］利用TILLING 技術(shù)在 800 個(gè)個(gè)體組成的 EMS 誘變?nèi)后w中鑒定出 246 個(gè) Waxy 基因的等位變異，其中 1/3 的Waxy 基因位點(diǎn)為功能失活突變體，這在一定程度上為低直鏈淀粉含量小麥功能標(biāo)記的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。李冰［71］用二倍體和四倍體小麥對普通小麥品種中的TaGDH1基因的gDNA序列進(jìn)行所屬染色體組劃分，分為A、B和D組。根據(jù)A組TaGDH1的gDNA序列其中一種單倍型，開發(fā)了一種InDel分子標(biāo)記，命名為TaGDH1a-InDel。利用中國春缺體-四體體系和“泰農(nóng)18×臨麥6號”RIL群體將這個(gè)標(biāo)記定位到5A染色體上，該標(biāo)記與SNP標(biāo)記Ku-c47168-562連鎖，距離為2.1 cM。該研究開發(fā)的標(biāo)記有助于GDHl在小麥中功能的研究以及TaGDHl基因型的鑒別，為今后結(jié)合5A上已知產(chǎn)量性狀相關(guān)QTL研究TaGDH1基因功能奠定了基礎(chǔ)。王昊龍等［43］克隆了抗性淀粉含量不同的小麥品種（系）中淀粉分支酶SBEⅡa基因、SBEⅡb基因和SBEⅡa基因啟動(dòng)子序列，根據(jù)SBEⅡb基因ORF2248和2302等位位點(diǎn)AHG的突變產(chǎn)生的差異，設(shè)計(jì)了AS-PCR特異性引物2248A8、2248A9、224853和2302A8、2302S4和224855。AS-PCR結(jié)果顯示，2248A8、2248A9和共用引物224853的互補(bǔ)選擇可以作為SBEⅡb基因2248位點(diǎn)上A/G的有效鑒定。230254、230255及共用引物2302A8的互補(bǔ)選擇可以作為SBEⅡb基因2302位點(diǎn)上A/G的差異鑒定。4對引物的相互補(bǔ)充利用可以有效地用于小麥抗性淀粉含量分子標(biāo)記輔助選擇，為后期小麥高抗性淀粉含量品種（系）的篩選工作提供一種便利的手段。

目前，雖然已經(jīng)有70個(gè)左右的關(guān)于小麥加工品質(zhì)功能標(biāo)記開發(fā)和驗(yàn)證，大大促進(jìn)了小麥的品質(zhì)育種進(jìn)程，但與高產(chǎn)育種相比，品質(zhì)育種則進(jìn)展相對較慢，主要原因是品質(zhì)性狀優(yōu)良的基因資源總體較為缺乏，以后應(yīng)加強(qiáng)優(yōu)良種質(zhì)資源的篩選來加快品質(zhì)育種的進(jìn)程。

2.4 在小麥農(nóng)藝性狀培育中的應(yīng)用

在小麥農(nóng)藝性狀培育，千粒重是高產(chǎn)育種重要目標(biāo)性狀之一。劉亞男等［72］以控制水稻穗型結(jié)構(gòu)OsDepl為候選基因，采用同源克隆方法克隆了普通小麥TaDepl基因。根據(jù)TaDep1-A1和TaDepl-B1位點(diǎn)不同等位變異的SNP和InDel開發(fā)了3對顯性互補(bǔ)標(biāo)記（70A1/A2R和82A1/A2R；95A2/A1R和96A2/A1R；95B3/2R和96B3/2R）和1個(gè)共顯性標(biāo)記（dep19），可以準(zhǔn)確鑒別不同等位基因；用這些標(biāo)記對4個(gè)群體和430多份小麥品種進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)不同基因型的株高、穗長、小穗數(shù)、穗節(jié)間和千粒重均沒有顯著差異，即小麥的TaDepl基因與產(chǎn)量相關(guān)性狀沒有顯著關(guān)聯(lián)。其中，可準(zhǔn)確區(qū)分TaDep1-B1c與TaDepl-Bla、TaDepl-Blb和TaDepl-B1d的 共顯性標(biāo)記Dep 19是根據(jù)第5外顯子上一個(gè)30 bp的InDel開發(fā)的。

雷夢林等［73］以六倍體普通小麥及其以野生近緣種的二倍體和四倍體為材料，克隆出小麥DREB轉(zhuǎn)錄因子基因W16 的DNA序列，利用DH群體親本（旱選10號和魯麥14）W16的單核苷酸多態(tài)性，開發(fā)了CAPS和AS-PCR（1728F/R）標(biāo)記，利用該標(biāo)記在154份六倍體普通小麥材料構(gòu)成的自然群體中進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，W16的3種單倍型分別與單株穗數(shù)、穗粒數(shù)、每穗小穗數(shù)和籽粒飽滿度關(guān)聯(lián)。其中HapⅡ?yàn)樵黾訂沃晁霐?shù)和籽粒飽滿度的優(yōu)良單倍型，HapⅢ為提高穗粒數(shù)的優(yōu)良單倍型。呂廣德等［47］克隆到了一個(gè)抗旱基因（TaOSCA1.4），通過中國春缺體-四體系將該基因定位到小麥第一部分同源群上。根據(jù)TaOSCA1.4-1B的SNP（4253bp A-C）位點(diǎn)開發(fā)成CAPS標(biāo)記（TaOSCA1.4-1B-CAPS），將該功能標(biāo)記與134份小麥品種（系）組成的自然群體12個(gè)環(huán)境調(diào)查數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明，TaOSCA1.4的兩種單倍型Hap-1B-A與Hap-1B-C的總小穗數(shù)（TSS）和株高（PH）在不同的個(gè)體環(huán)境中達(dá)到了極顯著差異，單倍型Hap-1B-C比Hap-1B-A多0.70個(gè)小穗，株高矮3.23 cm，并且該基因?qū)敳坎挥∷霐?shù)、穗粒數(shù)和產(chǎn)量都有一定的影響。

SAP是一類具有A20/AN 1鋅指結(jié)構(gòu)域的抗逆相關(guān)蛋白，Chang等［74］基于TaSAP1-A1啟動(dòng)子區(qū)3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)InDel5-1810、SNP-2606和InDel39-1637開發(fā)了3個(gè)分子標(biāo)記，分別命名為T7AM5、T7AM2606和T7AM39。其中T7AM5和T7AM2606是CAPS標(biāo)記，T7AM39是等位基因特異PCR標(biāo)記。關(guān)聯(lián)分析表明3個(gè)分子標(biāo)記T7AM5、T7AM2606和T7AM393與5個(gè)農(nóng)藝性狀顯著關(guān)聯(lián)，包括穗長、穗下節(jié)長、每穗總小穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重。

基于大麥的光周期調(diào)控基因TaC09基因核酸序列，冉從福等［67］利用同源克隆技術(shù)在小麥中克隆了其同源基因TaC09，以序列在距CCT結(jié)構(gòu)域22 bp內(nèi)含子差異為依據(jù)設(shè)計(jì)了分子標(biāo)記rF/R，利用中國春缺-四體材料將其定位于小麥1A染色體，命名為TaC09-1A，根據(jù)基因TaC09等位變異開發(fā)了共顯性分子標(biāo)記F/R，在不同小麥品種中擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)具有堿基插入突變的品種普遍為春性品種，抽穗及開花相對于未突變品種較早，冬性品種未發(fā)現(xiàn)突變，該標(biāo)記與小麥冬春性密切關(guān)聯(lián)，可輔助鑒定品種冬春習(xí)性。

迄今為止，重要農(nóng)藝性狀如株高、光周期反應(yīng)、春化作用、粒重和耐逆境的基因已經(jīng)開發(fā)了30個(gè)左右功能標(biāo)記并在小麥育種中應(yīng)用。由于農(nóng)藝性狀與品質(zhì)性狀相比更易描述，它們的田間表現(xiàn)可以直接選擇，所以在育種中農(nóng)藝性狀的功能標(biāo)記不如品質(zhì)性狀的標(biāo)記使用廣泛。

2.5 在小麥種質(zhì)資源中的應(yīng)用

傳統(tǒng)小麥基因鑒定方法，技術(shù)要求較高，影響因素多，實(shí)際操作有局限性，尤其在鑒定和篩選含兩個(gè)以上基因的材料時(shí)更為復(fù)雜，難以準(zhǔn)確區(qū)分基因的具體歸屬和涉及的基因數(shù)目。利用與功能標(biāo)記追蹤基因，可使目的基因的鑒定擺脫上述因素帶來的困難且結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。Yang 等［20］發(fā)現(xiàn)大粒小麥TaGW2-6A 基因序列在第 8 外顯子 977 bp處相比于中國春有一個(gè)T 堿基缺失，這一堿基的缺失導(dǎo)致了TaGW2 基因編碼的氨基酸發(fā)生變化并應(yīng)用此位點(diǎn)多態(tài)性開發(fā)的 AS-PCR分子標(biāo)記可有效鑒定蘭考小麥和中國春雜交后代品系。陳杰等［62］在粗山羊草中克隆了3個(gè)新的等位基因，分別命名為Tamybl0-D1c、Tamyb10-D1d和Tamybl0-D1e，根據(jù)這3個(gè)等位基因序列之間的差異設(shè)計(jì)了兩對共顯性的功能標(biāo)記DD3和DD5。用DD3和DD5對110參試的粗山羊草進(jìn)行分子檢測，試驗(yàn)結(jié)果表明：新疆地區(qū)粗山羊草材料的Tamybl0基因型較為豐富，有Tamyb10-D1c、Tamyb10-D1d和Tamyb10-D1e 3種變異類型。而黃河中游地區(qū)（河南和陜西）的粗山羊草材料的Tamybl0基因型較為單一，只有Tamyb10-D1d一種變異類型。利用DD3和DDS擴(kuò)增出的目的片段條帶清晰，穩(wěn)定性好，可以直接用于粗山羊草Tamybl0基因的標(biāo)記輔助選擇。張麗等［77］為建立長穗偃麥草（Lophopyrum elongatum）Ee染色體組特異的分子標(biāo)記，以普通小麥（Triticum aestivum L.）中國春、中國春-長穗堰麥草二體代換系和附加系為材料，利用獲得的STS（STS318、STS241、STS116和STS182）標(biāo)記對5個(gè)長穗堰麥草居群和8個(gè)小麥品種進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，這些STS標(biāo)記在長穗堰麥草居群中能檢測到，但在其它小麥背景中檢測不到。說明這些標(biāo)記可以用于小麥-長穗堰麥草異源附加系和代換系中長穗堰麥草遺傳物質(zhì)的檢測。

3 展望

DNA分子標(biāo)記技術(shù)的開發(fā)是近年來分子生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，雖然分子水平遺傳標(biāo)記的發(fā)展和利用只有短短的20多年，但它已被廣泛應(yīng)用于遺傳育種中。開發(fā)分子標(biāo)記的目的是為了進(jìn)行生物種質(zhì)資源鑒定、品種改良及相關(guān)遺傳基礎(chǔ)研究。

建立分子標(biāo)記輔助育種體系可大幅度提高動(dòng)植物品種改良的效率和定向性，縮短育種周期和降低育種成本。功能性分子標(biāo)記的這種通過對基因序列的擴(kuò)增而與表達(dá)序列緊密連鎖的特性使其可被廣泛而高效地應(yīng)用于高密度圖譜的構(gòu)建、QTL檢測、基因定位、圖位克隆及分子標(biāo)記輔助育種等［10］。

功能性分子標(biāo)記的開發(fā)首先需要鑒定出群體中與表型相關(guān)的功能基因的功能性基序的序列，具有明確基因功能的基因分離是功能性分子標(biāo)記開發(fā)的前提。盡管小麥中已有許多功能基因可以用來開發(fā)功能性分子標(biāo)記，但迄今為止，小麥中也僅有20個(gè)左右的控制農(nóng)藝性狀的基因被分離出來，比如抗病性基因中的Lr10、Lr21和Pm3等，谷物品質(zhì)基因中的Pina、Pinb、A2*和Bx7/Bx17等。對小麥中不同群體連鎖不平衡程度的信息量的掌握很有限，更多基因并未明確注釋功能。另外，得到注釋的也是其生物學(xué)意義大于其農(nóng)藝性狀意義的，遠(yuǎn)不能滿足農(nóng)藝性狀意義的功能。因此，在進(jìn)行FMs開發(fā)以前不僅要深入研究基因及序列的功能，對所有控制農(nóng)藝性狀上同一位點(diǎn)的全部等位基因都需要檢測與鑒定。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

The Application of the Functional Molecular Marker in Wheat Breeding

LIU Guo-sheng ZHANG Da-le
（School of Life Science，Henan University，Kaifeng 475000）

Based on the polymorphic sequence of a particular area in a functional gene closely related to phenotype, functional marker is a novel dominant molecular marker developed by correlation analysis, spectrum analysis, RNA interference and QTL mapping method, etc. Using these functional markers, whether or not the target allele from different genetic backgrounds exist can be directly and rapidly determined. In this work, the concept and characteristics of functional markers are briefly introduced, mainly exploring the application and prospect of functional markers as an assistant means in wheat breeding, in order to provide reference for the development of related molecular markers

wheat；molecular marker；functional gene；assistant breeding

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.003

2016-03-23

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31401379），河南省青年骨干教師項(xiàng)目（2015GGJS-019）

劉國圣，男，研究方向：植物科學(xué)與技術(shù)；E-mail：15515228983@163.com

張大樂，男，副教授，研究方向：小麥遺傳育種；E-mail：zhangdale97@126.com