王佳媚,章建浩

(1.海南大學(xué) 食品學(xué)院,海南 海口 570228;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院,江蘇 南京 210095;3.江蘇省常熟市屹浩食品包裝材料科技有限公司,江蘇 常熟 215500)

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不同作用條件對(duì)納米二氧化鈦光催化抑菌效果的影響

王佳媚1,章建浩2,3*

(1.海南大學(xué) 食品學(xué)院,海南 海口 570228;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院,江蘇 南京 210095;3.江蘇省常熟市屹浩食品包裝材料科技有限公司,江蘇 常熟 215500)

研究了不同作用條件對(duì)納米二氧化鈦光催化抑菌效果的影響。結(jié)果顯示:當(dāng)納米二氧化鈦濃度增加時(shí)其對(duì)大腸桿菌(Escherichiacoli)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaerginosa)的抑菌作用呈先升高后降低的趨勢(shì),最佳濃度值為0.4 g/L;光照強(qiáng)度越高,初始菌液濃度越低,納米二氧化鈦的光催化抑菌效果越好;在相同實(shí)驗(yàn)條件下,納米二氧化鈦對(duì)大腸桿菌的抑菌效果優(yōu)于對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌效果。

納米二氧化鈦;光催化;大腸桿菌;銅綠假單胞菌；抑菌效果

目前,納米抗菌包裝是國(guó)際上抗菌包裝研究的熱點(diǎn)[1-4],多種金屬氧化物成為研究的熱點(diǎn)材料,如納米二氧化鈦[1]、ZnO[5]、CuO[6]。納米二氧化鈦的存在形式有銳鈦型、金紅石型和板鈦型,前兩者的存在形態(tài)非常穩(wěn)定,是被研究最多的兩種形式。納米二氧化鈦經(jīng)紫外光照射后,電子發(fā)生躍遷,并進(jìn)一步生成活性自由基,從而具有氧化及抑菌活性。

納米二氧化鈦與薄膜材料結(jié)合制得復(fù)合膜,已經(jīng)被證明對(duì)果蔬等產(chǎn)品中的微生物具有抑菌作用。用納米二氧化鈦與PVC混合,研制出的復(fù)合膜可有效延長(zhǎng)富士蘋(píng)果的保存期[7]。將二氧化鈦或納米氧化硅粒子的復(fù)合保鮮液涂抹在枇杷表面,有效減少了腐敗率[8]。Chawengkijwanich C等[1]研究發(fā)現(xiàn)納米二氧化鈦涂膜包裝材料在處理180 min后使大腸桿菌的數(shù)量減少3 cfu/mL,其抑菌效果取決于UVA強(qiáng)度、光源種類(lèi)等因素,與粒子的大小無(wú)關(guān)。二氧化鈦?zhàn)鳛橐环N安全、無(wú)毒、低價(jià)、容易制得的物質(zhì),其光催化抑菌活性受到廣泛關(guān)注,在抗菌包裝材料中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)于納米二氧化鈦在不同作用條件下,對(duì)雞肉源微生物的光催化抑菌作用的研究很少。本文以UVA光照強(qiáng)度、二氧化鈦濃度、細(xì)菌濃度等為主要影響因素,研究了不同作用條件對(duì)納米二氧化鈦光催化抑菌效果的影響。

1 材料與方法

1.1 納米二氧化鈦光催化抑菌反應(yīng)裝置

光催化抑菌反應(yīng)實(shí)驗(yàn)采用自制光催化裝置在密閉箱體中進(jìn)行。反應(yīng)裝置主要由磁力攪拌器、紫外燈和無(wú)菌燒杯組成。將反應(yīng)溶液和催化劑加入無(wú)菌燒杯中,再將無(wú)菌燒杯放在磁力攪拌器上,用紫外燈(UVA)從上面垂直照射,光照強(qiáng)度根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行設(shè)定調(diào)節(jié)。使用數(shù)顯照度計(jì)直接測(cè)定光照強(qiáng)度。

1.2 反應(yīng)菌液制備

用接種環(huán)分別挑取少量大腸桿菌(Escherichiacoli)K12和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaerginosa)菌落，接種至無(wú)菌胰蛋白大豆肉湯(TSB)中,分別在適宜溫度下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h。取培養(yǎng)好的新鮮菌液50 mL,以5000g的轉(zhuǎn)速離心10 min,去掉上層液體培養(yǎng)基,用無(wú)菌PBS清洗菌體兩次,保證徹底除去培養(yǎng)基。再使用50 mL無(wú)菌PBS重新懸浮細(xì)菌體,所得菌懸液備用。

1.3 光催化抑菌實(shí)驗(yàn)

用無(wú)菌蒸餾水將納米二氧化鈦配制成所需濃度的懸浮液；取45 mL納米二氧化鈦懸浮液與5 mL菌懸液至250 mL無(wú)菌燒杯中,然后將燒杯放在磁力攪拌器上,置于紫外燈下照射處理,處理過(guò)程中持續(xù)攪拌,每隔一段時(shí)間取樣檢測(cè)。

1.4 細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)方法

對(duì)取出的樣品用無(wú)菌PBS溶液進(jìn)行10倍系列梯度稀釋,選擇相鄰的3個(gè)梯度進(jìn)行計(jì)數(shù)培養(yǎng),計(jì)算菌落數(shù)量，觀察其變化。

分別取100 μL系列濃度的稀釋菌液在胰蛋白大豆培養(yǎng)基(TSA)上進(jìn)行涂布；將涂布均勻的平板置于適宜溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間(銅綠假單胞菌在25 ℃下培養(yǎng)48 h,大腸桿菌K12在37 ℃下培養(yǎng)24 h),然后對(duì)平板上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

計(jì)算各處理多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值,使用Origin 9.0進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)分析,使用SAS 8.2進(jìn)行方差分析(ANOVA)及多方差檢驗(yàn)(Tukey’s multiple range test,P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米二氧化鈦濃度對(duì)大腸桿菌和銅綠假單胞菌的光催化抑菌效果的影響

由圖1可見(jiàn)：納米二氧化鈦對(duì)大腸桿菌和銅綠假單胞菌的光催化抑菌作用趨勢(shì)是基本一致的,在同一濃度下隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng),納米二氧化鈦對(duì)兩種細(xì)菌的抑制效果均逐漸增強(qiáng),活菌的濃度逐漸降低；在相同的照射時(shí)間條件下，不同濃度的二氧化鈦對(duì)兩種細(xì)菌的抑制作用均表現(xiàn)為0.4 g/L處理>0.8 g/L處理>0.2 g/L處理>對(duì)照(CK)。但在相同濃度、相同照射時(shí)間條件下，納米二氧化鈦對(duì)大腸桿菌的光催化抑菌效果要強(qiáng)于對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌效果，例如在照射150 min時(shí)，0.4 g/L的納米二氧化鈦導(dǎo)致大腸桿菌的活菌數(shù)量比值(C/C0)低于10-4,而引起的銅綠假單胞菌的C/C0值低于10-3。總之，0.4 g/L的納米二氧化鈦在照射處理150 min時(shí)對(duì)兩種細(xì)菌均具有最好的抑制效果。

多重差異比較結(jié)果表明：不同濃度的納米二氧化鈦對(duì)大腸桿菌的抑制作用均顯著強(qiáng)于對(duì)照的(P<0.05)；在照射30 min時(shí)不同納米二氧化鈦濃度處理間對(duì)大腸桿菌的抑制作用差異不顯著;在照射60～90 min時(shí),0.2 g/L的納米二氧化鈦對(duì)大腸桿菌的抑制作用顯著低于0.4 g/L和0.8 g/L的(P<0.05);在照射120～150 min時(shí),0.4 g/L和0.8 g/L處理間的抑制作用差異不明顯,但兩者都顯著強(qiáng)于0.2 g/L處理和對(duì)照的。不同濃度的納米二氧化鈦對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用在照射30 min時(shí)無(wú)顯著差異；在照射60～150 min過(guò)程中, 0.2 g/L納米二氧化鈦的抑菌作用顯著低于0.4 g/L和0.8 g/L處理的(P<0.05)。

A：大腸桿菌； B：銅綠假單胞菌。光照強(qiáng)度為800 μW/cm2,菌液初始濃度為108 cfu/mL。

2.2 光照強(qiáng)度對(duì)大腸桿菌和銅綠假單胞菌的光催化抑菌效果的影響

圖2顯示在不同光照強(qiáng)度下納米二氧化鈦對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用趨勢(shì)與大腸桿菌相似,都隨著光照強(qiáng)度的升高而增大。在照射30 min之內(nèi)納米二氧化鈦對(duì)兩種細(xì)菌的抑制作用均較弱；此后隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制作用明顯加強(qiáng)；當(dāng)光照強(qiáng)度為600 μW/cm2時(shí),經(jīng)納米二氧化鈦?zhàn)饔?50 min后大腸桿菌和銅綠假單胞菌的活菌數(shù)量比值均下降至10-2左右。

當(dāng)光照強(qiáng)度為600 μW/cm2時(shí), 0.4 g/L的納米二氧化鈦對(duì)大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抑制作用均顯著(P<0.05)低于高強(qiáng)度處理組的；當(dāng)光照強(qiáng)度為1000 μW/cm2時(shí),照射150 min時(shí)大腸桿菌和銅綠假單胞菌的活菌數(shù)量比值分別為10-5和10-4左右,而當(dāng)光照強(qiáng)度為800 μW/cm2時(shí),大腸桿菌和銅綠假單胞菌的活菌數(shù)量比值分別為10-4和10-3左右。

A：大腸桿菌； B：銅綠假單胞菌。二氧化鈦濃度為0.4 g/L,菌液初始濃度為108 cfu/mL。

2.3 菌液初始濃度對(duì)大腸桿菌和銅綠假單胞菌的光催化抑菌效果的影響

從圖3可以看出：當(dāng)菌液初始濃度為108cfu/mL時(shí),納米二氧化鈦對(duì)大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抑制作用趨勢(shì)一致,在照射150 min內(nèi)細(xì)菌濃度幾乎呈直線下降,其中大腸桿菌的濃度最終下降至104cfu/mL左右,而銅綠假單胞菌的濃度僅降至106cfu/mL左右。當(dāng)菌液初始濃度為107cfu/mL時(shí),大腸桿菌的濃度在照射150 min時(shí)降至102cfu/mL左右，而銅綠假單胞菌的濃度在前120 min呈快速降低,在120 min后下降速率明顯減弱,在150 min時(shí)濃度降至103cfu/mL左右；當(dāng)菌液初始濃度為106cfu/mL時(shí),大腸桿菌的濃度迅速降低,在120 min后濃度低于102cfu/mL，而銅綠假單胞菌的濃度變化類(lèi)似于菌液初始濃度為107cfu/mL時(shí)的,在150 min時(shí)濃度下降至102cfu/mL左右。上述結(jié)果表明，菌液初始濃度越低，0.4 g/L的納米二氧化鈦對(duì)大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抑制作用越強(qiáng)。

A：大腸桿菌； B：銅綠假單胞菌。光照強(qiáng)度為800 μW/cm2,二氧化鈦濃度為0.4 g/L。

3 討論

3.1 納米二氧化鈦濃度對(duì)其光催化抑菌作用的影響

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，納米二氧化鈦對(duì)大腸桿菌和銅綠假單胞菌產(chǎn)生相同的抑菌效果所需時(shí)間相近,對(duì)大腸桿菌的抑制速度比銅綠假單胞菌快30 min。此結(jié)果與之前的報(bào)道[9-10]相似。納米二氧化鈦的作用濃度有最適值,即在一定濃度范圍內(nèi)隨著二氧化鈦濃度的增加,其對(duì)細(xì)菌的作用增強(qiáng),當(dāng)超過(guò)某一濃度時(shí),作用減弱。本研究中二氧化鈦的適宜濃度為0.4 g/L。這與Grieken等[9]報(bào)道的結(jié)果一致,他們發(fā)現(xiàn)：納米二氧化鈦懸浮液在0.02～0.50 g/L濃度范圍內(nèi),隨著濃度增加,納米二氧化鈦對(duì)微生物的抑制作用增強(qiáng)；納米二氧化鈦懸浮液在低濃度 (0.05 g/L)下抑制102cfu/mL大腸桿菌生長(zhǎng)需要240 min;而當(dāng)濃度為0.20 g/L時(shí),其抑制106cfu/mL大腸桿菌生長(zhǎng)僅需180 min。光催化抑菌作用的催化劑適宜濃度與實(shí)驗(yàn)條件(照射燈的類(lèi)型、反應(yīng)器形狀)等有關(guān),而與所用的目標(biāo)菌種關(guān)系不大[11]。因?yàn)楣獯呋磻?yīng)過(guò)程比較復(fù)雜,反應(yīng)過(guò)程中的影響因素較多,任一個(gè)因素的變化都可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同。

當(dāng)納米二氧化鈦濃度增加時(shí),反應(yīng)體系中的二氧化鈦分子數(shù)量增多,吸收的光子數(shù)量增加,產(chǎn)生的自由基數(shù)量增加,從而可以提高抑菌效果。當(dāng)二氧化鈦濃度過(guò)高時(shí),會(huì)產(chǎn)生屏蔽效應(yīng)[12]。高濃度的納米二氧化鈦在細(xì)菌體表面形成大面覆蓋陰影,阻礙光線通過(guò)；此外,產(chǎn)生的活性電子——空穴對(duì)在短時(shí)間內(nèi)不能與微生物作用,就會(huì)自動(dòng)結(jié)合[12]。另外，過(guò)低濃度的納米二氧化鈦不足以吸收全部光子,產(chǎn)生的自由基數(shù)量有限,因而抑菌效果差。

3.2 光照強(qiáng)度對(duì)納米二氧化鈦抑菌作用的影響

光照強(qiáng)度影響整個(gè)光催化過(guò)程中納米二氧化鈦的抑菌效果,隨著光照強(qiáng)度的增加抑菌效果增加[13]。當(dāng)光照強(qiáng)度降低時(shí),導(dǎo)致納米二氧化鈦表面產(chǎn)生的自由基數(shù)量減少,對(duì)細(xì)菌的抑制效果降低。Rincón等[13]認(rèn)為抑菌率隨催化劑用量的增加而增加,當(dāng)光照強(qiáng)度為1000 W/m2時(shí),增加納米二氧化鈦用量會(huì)影響光催化抑菌效果,因?yàn)橐志饔眯枰銐驎r(shí)間才能達(dá)到效果,并非菌體受到自由基攻擊之后立即達(dá)到抑菌效果。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)光照強(qiáng)度增大時(shí),納米二氧化鈦對(duì)細(xì)菌的抑制作用增強(qiáng)。這與之前關(guān)于二氧化鈦在水溶液中對(duì)大腸桿菌和E.faecalis抑制的報(bào)道結(jié)果[9]一致。當(dāng)光照強(qiáng)度升高時(shí),可利用的光能增大,納米二氧化鈦可吸收的光子增多,產(chǎn)生的自由基數(shù)量增多[14],從而增強(qiáng)對(duì)細(xì)菌的抑制效果。這可能也與光催化抑菌活性和氫氧自由基濃度間的線性關(guān)系有關(guān)[15]。在本研究中光照強(qiáng)度對(duì)兩種菌種的光催化作用影響趨勢(shì)一致,這可能與大腸桿菌和銅綠假單胞菌同屬G-菌、兩者的細(xì)胞結(jié)構(gòu)相同有關(guān)。

3.3 菌液初始濃度對(duì)納米二氧化鈦抑菌作用的影響

在本實(shí)驗(yàn)中，隨著菌液初始濃度的增大,納米二氧化鈦對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生相同抑制效果所需的時(shí)間增加。此結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果[16-18]一致。圖3中高濃度與低濃度處理間細(xì)菌濃度變化曲線的斜率無(wú)顯著差異,說(shuō)明反應(yīng)速率常數(shù)隨菌液初始濃度的增加而減低。Grieken等[9]認(rèn)為光催化抑菌的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)與催化劑濃度和光照能量有關(guān),但是反應(yīng)速率與菌液初始濃度相關(guān)。

細(xì)菌的生長(zhǎng)速度也會(huì)影響納米材料對(duì)細(xì)菌的光催化效果。生長(zhǎng)速度快的細(xì)菌相對(duì)于生長(zhǎng)速率慢的菌株而言可能對(duì)納米材料更敏感[19]。生長(zhǎng)速率慢的細(xì)菌對(duì)納米粒子有較高的耐性,可能與其“抗壓基因”的表達(dá)有關(guān)[20]。因此,納米材料的抑菌作用隨使用菌株的不同而存在差異。

4 結(jié)論

納米二氧化鈦對(duì)大腸桿菌和銅綠假單胞菌均具有良好的光催化抑菌效果,在相同條件下對(duì)兩種細(xì)菌的作用趨勢(shì)一致，但對(duì)大腸桿菌的抑制作用強(qiáng)于對(duì)銅綠假單胞菌的。納米二氧化鈦濃度增加對(duì)大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抑菌作用均呈先升高后降低的趨勢(shì),最佳濃度值為0.4 g/L。光照強(qiáng)度越高,菌液初始濃度越低,越有利于增強(qiáng)二氧化鈦的抑菌效果。

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(責(zé)任編輯:黃榮華)

Photocatalytic Disinfection Effect of Nano-TiO2on Bacteria under Different Conditions

WANG Jia-mei1, ZHANG Jian-hao2,3*

(1. College of Food Science and Technology, Hainan University, Haikou 570228, China; 2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 3. Changshu Yihao Food Packaging Material Technology Limited Company in Jiangsu Province, Changshu 215500, China)

The photocatalytic disinfection effect of nano-TiO2on 2 species of bacteria under different conditions was researched. The results indicated that the disinfection effect of nano-TiO2on bothEscherichiacoliandPseudomonasaerginosawas increased first and then decreased when the concentration of nano-TiO2was increased, and it showed the best disinfection effect at 0.4 g/L. To increase the light intensity, and to reduce the initial concentration of bacteria were helpful to increasing the disinfection effect of nano-TiO2. Under the same conditions, nano-TiO2had a better photocatalytic disinfection effect onE.colithanP.aerginosa.

Nano-TiO2; Photocatalysis;E.coli;P.aerginosa; Disinfection effect

2016-06-02

海南大學(xué)科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(kyqd1560);國(guó)家中小企業(yè)創(chuàng)新基金項(xiàng)目(JSA9ED6Q);江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目(C X(15)1049);江蘇省國(guó)際合作項(xiàng)目(BZ2014034);國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目“納米涂膜保鮮包裝材料的研究與開(kāi)發(fā)”(2015 BAD16B05-05)。

王佳媚(1984─),女,講師,主要從事肉類(lèi)加工與貯藏保鮮方向的研究。*通訊作者:章建浩。

TQ134.11

A

1001-8581(2016)11-0054-05