吳智春，于華蕓，季旭明，歐陽兵

山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355

晚期自發(fā)性高血壓大鼠肝腎陰虛證候特征評價

吳智春，于華蕓，季旭明，歐陽兵

山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355

目的 觀察晚期自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）的證候特征。方法 取12月齡健康雄性SHR大鼠10只設為證候組（SHR組），同齡雄性Wistar-Kyoto大鼠10只設為對照組（WKY組）。采用大鼠辨證方法學，將四診信息轉(zhuǎn)化為具有同等意義的一般行為學指標，觀察實驗大鼠午后肛溫、舌色、抓力、學習記憶能力、血清雌二醇（E2）和睪酮（T）水平等，并進行比較分析。結果 與WKY組比較，SHR組大鼠午后肛溫較高，舌色偏紅，前爪抓握能力及肌力較差，學習記憶能力減退，血清T水平偏低，E2/T比值較高，基本符合肝腎陰虛證的表現(xiàn)。結論 晚期SHR具有肝腎陰虛證候特征。

病證結合；動物模型；肝腎陰虛；自發(fā)性高血壓大鼠

自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertension rat，SHR）具有穩(wěn)定的高血壓遺傳性，與人類高血壓的病程演變相似，其癥狀、體征及生化指標等隨周齡增長而變化[1]，在不同的發(fā)展階段其中醫(yī)證候特征也是穩(wěn)定均一的[2]，通過觀察其病理特征、癥狀和體征等探討其中醫(yī)證候特征，有助于建立符合中醫(yī)特征的病證結合動物模型。本實驗采用大鼠辨證方法學，通過代以定量或半定量的同等意義觀察方法和測試指標，將四診信息轉(zhuǎn)化為一般的行為學指標，對晚期SHR進行辨證分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

SPF級雄性12月齡Wistar-Kyoto大鼠（WKY大鼠，體質(zhì)量410～470 g）和SHR（體質(zhì)量340～370 g）各10只，北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK（京）2006-0009。WKY大鼠作為SHR同種系正常對照組（WKY組），SHR設為證候組（SHR組）。

1.2 主要試劑與儀器

雌二醇（E2）、睪酮（T）羅氏配套試劑。MD3000型大鼠血壓心率測定儀，淮北正華科技有限公司；MC-142L型電子體溫計，歐姆龍大連有限公司；電子秤，北京六一儀器廠；YP600型電子天平，上海精科天平儀器廠；E601型全自動電化學發(fā)光分析儀，瑞士羅氏公司。

1.3 一般狀況觀察和測定

觀察大鼠活動、毛發(fā)色澤，測定飲水量、大小便、體質(zhì)量等；測量安靜、清醒狀態(tài)下大鼠尾動脈收縮壓，取連續(xù)3次平均值，16:00時開始測量肛溫。

1.4 舌色觀察分析

參照文獻[3]將麻醉大鼠置于暗室，用數(shù)碼相機攝取舌象。攝像時采用統(tǒng)一固定的內(nèi)光源，大鼠舌及數(shù)碼相機放置位置及攝影角度均固定。應用Image Pro Plus 6.0醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)提取每只大鼠舌象的舌尖、舌中、舌根3部分的Density red、Density green、Density blue值，并分別取平均值（Density mean）后進行分析。

1.5 抓力測定

網(wǎng)屏為50 cm×40 cm網(wǎng)帶，網(wǎng)眼為l cm×l cm，網(wǎng)板左右和上方均用25 cm高木板框邊，網(wǎng)屏距地面高度為80 cm，下方鋪以12 cm厚海綿。先將網(wǎng)屏水平放置，將大鼠放置其上，然后緩緩地將其一端抬高，在2 s內(nèi)將此網(wǎng)屏變成垂直位，保持5 s，觀察大鼠是否會從網(wǎng)屏上下來或用前爪抓握住網(wǎng)屏，從而評價前爪抓握能力及肌力情況。評分標準分為4個等級。0分：前爪握住網(wǎng)屏達5 s，不會掉落；1分：暫時握住網(wǎng)屏，滑落一段距離，但未掉落；2分：在5 s內(nèi)掉落；3分：網(wǎng)屏轉(zhuǎn)動即刻掉落。

1.6 Morris水迷宮定位航行實驗

采用Morris水迷宮定位航行實驗對大鼠空間學習記憶能力進行評估。Morris水迷宮裝置參照文獻[4]，選用大鼠通用型圓桶，水池直徑120 cm，在圓桶上緣設等距東、西、南、北4個標記點，將水面和水桶分成4個象限。實驗時水桶加水至37 cm，水溫控制在23～25 ℃，水內(nèi)添加墨汁，使其呈黑色不透明狀。先將大鼠放入水池中進行自由游泳訓練2 min，使其熟悉環(huán)境。每日于固定時間段，每個時間段訓練4次歷時5 d。實驗時將高度為35 cm、直徑為8 cm的平臺設置于東北象限，將大鼠首先由遠離平臺的西南象限入水[5]，然后分別由其他3個象限入水，至其找到平臺，記錄其找到平臺的時間（逃避潛伏期），并在臺上停留2 min。如果120 s未能找到，則將其放在平臺上2 min，潛伏期記錄為120 s。每日以大鼠4次訓練潛伏期平均值作為大鼠當日學習成績。

1.7 血清雌二醇、睪酮檢測

10％水合氯醛0.35 mL/100 g大鼠腹腔注射麻醉，腹腔靜脈取血，分離血清，電化學發(fā)光法檢測血清E2和T，計算E2/T比值。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，組間比較采用t檢驗，等級資料采用秩和檢驗；Morris水迷宮定位航行實驗潛伏期數(shù)據(jù)采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析[6-7]，若不滿足球?qū)ΨQ假設，則用Greenhouse-Geisser方法進行校正，若分組因素和時間因素存在交互效應，則進一步做單獨效應分析；在單獨效應分析中，同一時間點上2組間進行t檢驗或t'檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般狀況比較

與WKY組比較，SHR組大鼠毛發(fā)蓬亂，色發(fā)黃而無光澤，脫落較多，爪肉墊瘦削、色紅少光澤，尿色偏黃，糞便顆粒較小、質(zhì)地較干；與WKY組比較，SHR組大鼠血壓升高、肛溫偏高、體質(zhì)量降低（P＜0.01）。結果見表1。

表1 2組大鼠血壓、肛溫和體質(zhì)量比較（±s）

表1 2組大鼠血壓、肛溫和體質(zhì)量比較（±s）

注：與WKY組比較，**P＜0.01

組別只數(shù) 血壓/mm Hg 肛溫/℃ 體質(zhì)量/g WKY組10 136.50±11.38 34.21±0.79 440.94±29.47 SHR組10 222.47±20.64**35.19±0.51**353.69±15.23**

2.2 舌色比較

SHR組大鼠舌象Density red值顯著高于WKY組大鼠（P＜0.05），Density mean、Density green和Density blue值組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。表明SHR組大鼠舌色較WKY組偏紅。

表2 2組大鼠舌色分析比較（±s）

表2 2組大鼠舌色分析比較（±s）

注：與WKY組比較，*P＜0.05

組別只數(shù)Density mean Density red Density green Density blue WKY組10 86.6±7.2 117.4±10.4 70.5±6.5 71.9±7.0 SHR組10 93.4±8.7 128.5±13.0*75.7±6.6 75.9±7.4

2.3 抓力比較

WKY組和SHR組大鼠網(wǎng)屏訓練評分比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），SHR組評分較高，見表3。表明SHR大鼠的前爪抓握能力及肌力較差。

表3 2組大鼠網(wǎng)屏訓練評分比較（只）

2.4 空間學習記憶能力測評

首先通過球?qū)ΨQ檢驗判斷重復測量數(shù)據(jù)之間是否存在相關性。檢驗結果顯示P＝0.027，不滿足球?qū)ΨQ假設，說明5次重復測量數(shù)據(jù)間存在高度相關性。之后分析采用Greenhouse-Geisser方法進行校正。結果表明，不同時間潛伏期差異有統(tǒng)計學意義（F＝11.359，P＜0.01），WKY組和SHR組F值分別為251.542和217.253（P＜0.01）；WKY組和SHR組逃避潛伏期均隨時間降低（F＝7.219，P＜0.05）。時間和分組交互作用差異無統(tǒng)計學意義（F＝1.152，P＞0.05），表明時間因素的作用不隨分組的不同而不同。從各時間點看，第3日和第4日，SHR組逃避潛伏期較WKY組長（P＜0.05），見表4。綜合分析各項結果表明SHR大鼠學習記憶能力減退。

表4 2組大鼠不同時間點逃避潛伏期比較（±s，s）

表4 2組大鼠不同時間點逃避潛伏期比較（±s，s）

注：a表示時間主效應的F值、P值；b表示組別主效應的F值、P值；c表示時間和組別之間交互效應的F值、P值

組別 只數(shù) 第1日 第2日 第3日 第4日 第5日 Sum F值 P值WKY組 10 30.6±10.1 17.8±12.1 11.9±7.6 11.6±4.2 10.8±3.5 16.5±10.9 251.542 0.000 SHR組 10 29.2±15.9 24.2±9.4 21.1±8.2*19.6±9.9*12.6±2.1 21.3±11.2 217.253 0.000 Sum 29.9±13.0 21.0±10.9 16.5±9.0 15.6±8.5 11.7±2.9 11.359a0.000at值/F值 0.235 -1.328 -2.600 -2.344 -1.411 7.219b1.152c0.334cP值 0.817 0.201 0.018 0.031 0.175 0.015b

2.5 血清雌二醇、睪酮檢測結果

SHR組大鼠血清T濃度低于WKY組（P＜0.01），E2/T比值高于WKY組（P＜0.05），組間比較血清E2濃度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果見表5。

表5 2組大鼠血清E2和T濃度比較（±s）

表5 2組大鼠血清E2和T濃度比較（±s）

注：與WKY組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 只數(shù) E2/（pmol/L） T/（nmol/L） E2/T WKY組 10 96.42±20.95 6.89±2.77 16.25± 8.08 SHR組 10 94.60±19.06 3.91±1.38**27.78±12.31*

3 討論

SHR與人類高血壓的發(fā)病最為相似，是目前研究原發(fā)性高血壓最為理想的動物模型，可分為3個時期：高血壓前期（5～7周齡）、早期（4～7月齡）、晚期（12～14月齡）。有學者認為，SHR存在證候的自然發(fā)生和演變[8]，不同發(fā)展階段有不同的癥狀和體征，通過辨證可表現(xiàn)為不同的證型，從而建立最大可能模擬中醫(yī)臨床實際、且符合臨床病理生理過程的高血壓病證結合動物模型。

高血壓病屬中醫(yī)“眩暈”“頭痛”等范疇。其中醫(yī)病因病機較為復雜，在不同病期有著不同的證候表現(xiàn)。初起病位在肝，實證為主，多見肝陽偏亢、肝火上炎；病程遷延日久，及至中晚期，影響心、腎，則多見虛證。對高血壓證型統(tǒng)計分析研究，發(fā)現(xiàn)高血壓的主體特點是以肝陽上亢或肝腎陰虛為基本特點[9]，在其病變過程中，證型表現(xiàn)有從明顯的肝陽上亢證向肝腎陰虛轉(zhuǎn)化的趨勢[10]。臨床資料亦顯示，高血壓患者有青壯年時期以肝火上炎、肝陽上亢為主，中老年時期以肝腎陰虛為主的表現(xiàn)[11]。

結合高血壓病中醫(yī)病因病機及證候演變規(guī)律，本研究顯示，晚期SHR可能以肝腎陰虛為多見。我們前期文獻研究發(fā)現(xiàn)，腰膝酸軟、脈弦細、陰虛發(fā)熱、舌紅少苔、健忘為高血壓病肝腎陰虛證的核心癥狀[12]。本研究采用與SHR源自同一種群且不具備高血壓特征的WKY大鼠為對照，以網(wǎng)屏實驗評分表現(xiàn)大鼠抓握能力，反映腰膝酸軟；以午后肛溫觀察是否有陰虛發(fā)熱表現(xiàn)；以Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期評價記憶能力；應用Image pro plus醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)軟件，客觀觀察和分析大鼠舌色，對晚期SHR大鼠的中醫(yī)證候特征進行研究分析。

實驗結果顯示，與同齡WKY大鼠比較，SHR血壓較高，高血壓病診斷明確。此外發(fā)現(xiàn)SHR毛發(fā)蓬亂、發(fā)黃而無光澤、脫落較多，尿液顏色偏黃，糞便顆粒較小、質(zhì)地較干，爪肉墊瘦削色紅少光澤。提示晚期SHR有較明顯的腎虛和火熱爍津的表現(xiàn)。SHR大鼠午后肛溫高于WKY組，舌象Density red顯著高于WKY組大鼠，提示可能存在陰虛發(fā)熱和舌紅的表現(xiàn)。網(wǎng)屏訓練結果顯示，SHR組評分顯著高于WKY組，說明SHR前爪抓握能力及肌力較差，提示可能存在腰膝酸軟癥狀。Morris水迷宮定位航行實驗結果顯示，WKY組和SHR組5 d逃避潛伏期比較差異有統(tǒng)計學意義，SHR組逃避潛伏期較長，表明SHR學習記憶能力減退，提示出現(xiàn)健忘癥狀。

肝腎陰虛證病理組織學基礎研究表明，內(nèi)分泌腺機能紊亂是肝腎陰虛過程中的一個重要環(huán)節(jié)，血清T和E2水平有助于指導原發(fā)性高血壓的中醫(yī)臨床辨證分型和治療，亦有臨床研究顯示，肝腎陰虛型高血壓患者血液T和E2濃度降低，可能與肝腎陰虛者陰液不足有關[13]。為進一步了解晚期SHR肝腎陰虛證候特點，本研究還檢測了實驗大鼠血清E2和T水平。結果發(fā)現(xiàn)，SHR組血清T濃度低于WKY組，E2/T高于WKY組，組間比較血清E2濃度無明顯差異。這可作為對晚期SHR肝腎陰虛證型特點的有效補充。

綜上，晚期SHR有陰虛發(fā)熱、腰膝酸軟、健忘和舌紅等肝腎陰虛證的典型表現(xiàn)，其中醫(yī)證候特征可初步辨識為肝腎陰虛證。

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Evaluation of the Characteristics of Liver-kidney Yin Deficiency Syndrome in Late Stage of

Spontaneously Hypertension Rats

WU Zhi-chun, YU Hua-yun, JI Xu-ming, OUYANG Bing (Shandong

University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

Objective To observe the characteristics of liver-kidney yin deficiency syndrome in late stage of spontaneously hypertension rats (SHRs). Methods Ten 12-month-old healthy male SHRs were put into syndrome observer group (SHR group), while ten male WKY rats with the same age were set as control group (WKY group). Syndrome differentiation method on rats was employed to transform the four-diagnostic information into general behavior indexes with the same significance. The afternoon anal temperature, tongue color, holding power, ability of learning and memory, serum estradiol and testosterone level were observed, compared and analyzed. Results Compared with the WKY group, rats in the SHR group had higher afternoon anal temperature, redder tongues, poorer strength and claw holding power and their ability of learning and memory was retarded; the level of serum estradiol was lower; the ratio of estradiol to testosterone was higher. All of these were largely in line with deficiency of live-kidney yin syndrome. Conclusion SHRs in late stage show characteristics of liver-kidney yin deficiency syndrome.

combination of disease and syndrome; animal model; liver-kidney yin deficiency; SHRs

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.016

R228

A

1005-5304(2016)03-0058-04

中國博士后科學基金面上項目（2011M501162）；山東省高等學校科技計劃項目（J11LF07）

歐陽兵，E-mail：doctoroy@126.com

（2015-05-29）

（2015-07-21；編輯：華強）