丁世洪，劉兵，趙淑偉，李義清，李萬(wàn)忠

1.濰坊醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053；2.昌樂(lè)縣中醫(yī)院，山東 濰坊 262400

香椿子多糖提取工藝及體外抗氧化活性研究

丁世洪1，劉兵1，趙淑偉2，李義清1，李萬(wàn)忠1

1.濰坊醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053；2.昌樂(lè)縣中醫(yī)院，山東 濰坊 262400

目的 優(yōu)選香椿子多糖提取工藝條件，初步確定其體外抗氧化活性。方法 以香椿子多糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，提取時(shí)間、選擇料液比、提取次數(shù)為考察因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選提取工藝；采用總還原力法、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法測(cè)定香椿子多糖抗氧化能力。結(jié)果 香椿子多糖水提工藝優(yōu)化條件為液料比1∶12，提取120 min，提取3次。香椿子多糖具有一定還原能力，對(duì)DPPH自由基（DPPH·）具有較好清除能力，隨多糖濃度增加清除能力增強(qiáng)，并對(duì)曲線進(jìn)行了方程擬合。結(jié)論 該工藝簡(jiǎn)便可行、穩(wěn)定可靠，適合香椿子多糖提取的小試研究。香椿子多糖具有一定的抗氧化活性。

香椿子多糖；提取工藝；抗氧化

香椿是一種資源豐富、用途廣泛、成本低廉、藥食兩用的植物，具有較好開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。香椿子系楝科植物香椿的果實(shí)。據(jù)《四川中藥志》記載，香椿子性溫、味辛苦，無(wú)毒，入肝、肺經(jīng)，具祛風(fēng)、散寒、止痛功效，主治風(fēng)寒感冒、心胃氣痛、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛等。香椿子中含有酚類、鞣質(zhì)、生物堿、皂苷、甾體、萜類、揮發(fā)油、多糖等成分[1-4]。植物來(lái)源多糖具有抗氧化、降血糖、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力、抗衰老、抗疲勞等生物活性[5-6]。為了更好地開(kāi)發(fā)和利用香椿子資源，本研究初步探討香椿子多糖提取工藝及體外抗氧化活性，為香椿子深入開(kāi)發(fā)和生物活性評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

紫外分光光度計(jì)UV-800A型（上海元析儀器公司）；電子分析天平EL204（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；超聲波清洗儀PS-30（深圳市深華泰超聲洗凈設(shè)備有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52系列（上海亞榮生化儀器廠）；精密電熱恒溫三用水箱HH600-2B（上海比朗儀器有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱101-1AB（天津市泰斯特儀器有限公司）；KDM型調(diào)溫電熱套（山東鄄城創(chuàng)新儀器有限公司）。

香椿子購(gòu)于購(gòu)自濟(jì)南圣科技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，經(jīng)濰坊醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室許崇梅博士鑒定為楝科香椿屬植物香椿Toona sinensis（A.Juss.）Roem.的果實(shí)；葡萄糖及其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 香椿子多糖鑒別方法

精密稱取樣品適量，加水溶解，取樣品溶液1 mL，加1～3滴5％ α-萘酚乙醇溶液，搖勻后沿試管壁緩緩加入濃硫酸，觀察是否在中間出現(xiàn)紫環(huán)現(xiàn)象[7]。試驗(yàn)中出現(xiàn)紫環(huán)現(xiàn)象，說(shuō)明樣品中含有多糖類物質(zhì)。

2.2 香椿子多糖含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[8]，精密稱取葡萄糖對(duì)照品50 mg，于容量瓶中加水定容，制成0.5 mg/mL對(duì)照品溶液，備用。精密稱取苯酚6.0 g，置棕色容量瓶中，加水溶解搖勻，即得6％苯酚溶液（4 ℃保存）。精密移取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL對(duì)照品溶液，定容于50 mL容量瓶中。分別從中精密移取2 mL于10 mL具塞試管中，加入6％苯酚1.0 mL，再加入5.0 mL濃硫酸混勻，靜置10 min，25 ℃水浴15 min，冷卻至室溫，以2 mL蒸餾水為空白同上操作，于490 nm處測(cè)定各樣品吸光度。以多糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得直線方程為Y＝15.767X－0.059 8，r＝0.999 0。精密稱取香椿子多糖適量，按上述方法測(cè)定樣品吸光度，由方程計(jì)算樣品中多糖含量。

2.3 香椿子多糖提取工藝研究

2.3.1 香椿子多糖提取方法 香椿子適當(dāng)粉碎，95％乙醇脫脂處理，過(guò)濾后晾干備用。取脫脂香椿子適量，精密稱定，加水回流提取，抽濾后減壓濃縮。濃縮液采用sevage法脫蛋白處理[9]，向脫蛋白溶液中加乙醇使含量達(dá)85％，4 ℃靜置過(guò)夜，抽濾，無(wú)水乙醇洗滌3次，干燥后即得香椿子多糖。

2.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 以香椿子粗多糖含量為指標(biāo)，選擇提取次數(shù)、提取時(shí)間、料液比三因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，運(yùn)用正交表L9（34），優(yōu)選香椿子多糖提取工藝條件，因素與水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表1　水提工藝正交試驗(yàn)因素水平表

表2　L9（34）正交試驗(yàn)安排與結(jié)果

表3　正交試驗(yàn)方差分析

由表2可知，以多糖含量為指標(biāo)，各因素作用主次順序?yàn)锳＞B＞C，其中因素A有顯著影響（P＜0.05），因素B、C無(wú)顯著影響（P＞0.05），所以優(yōu)化的香椿子多糖提取方案為A3B3C3，即提取3次，提取120 min，料液比為1∶12。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)正交試驗(yàn)得出的最佳組合條件，取同一批香椿子3份，按A3B3C3進(jìn)行提取。香椿子多糖平均含量為18.54 mg，RSD＝2.92％（n＝3），說(shuō)明方案穩(wěn)定，最終確定較優(yōu)方案為A3B3C3。

2.4 香椿子多糖體外抗氧化活性測(cè)定

2.4.1 試液配制 精密稱取香椿子多糖適量，加水定容于50 mL容量瓶中，制成5 mg/mL母液備用；精密移取多糖母液適量于10 mL容量瓶，定容，搖勻，即得系列濃度的多糖溶液。

精密稱取維生素C（Vc）適量，加水溶解，制成0.2 mg/mL溶液；精密移取Vc母液適量于10 mL容量瓶，定容，搖勻，即得不同濃度Vc溶液。

2.4.2 香椿子多糖總還原力測(cè)定 采用普魯士藍(lán)法[10]測(cè)定香椿子多糖總還原力。分別移取不同濃度Vc溶液與香椿子多糖1.0 mL于10 mL離心管中，加入0.2 mol/L pH 6.6磷酸緩沖溶液2.5 mL和1％鐵氰化鉀溶液2.5 mL混勻，50 ℃水浴保溫20 min，加入10％三氯乙酸溶液2.5 mL混勻，3000 r/min離心10 min，精密移取上清液2.5 mL，加蒸餾水2.5 mL和0.1 ％三氯化鐵0.5 mL，靜置10 min，于700 nm處測(cè)定吸光度，以蒸餾水為參比，測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

圖1　Vc總還原力測(cè)定結(jié)果

圖2　香椿子多糖總還原力測(cè)定結(jié)果

由圖1可知，Vc總還原力隨濃度增加而增加，在0.02～0.20 mg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，回歸方程為Y＝5.410 5X＋0.003 71，r＝0.999 6；可知，當(dāng)Vc＝0.091 mg/mL時(shí)，吸光度為0.50，總還原力達(dá)到50％。

由圖2可知，香椿子多糖具有一定還原力，總還原力隨多糖濃度增加而增加，呈劑量依賴關(guān)系，在0.2～1.6 mg/mL范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系，回歸方程為Y＝0.483 8X＋0.020 2，r＝0.999 5。當(dāng)香椿子多糖總還原力為50 ％時(shí)，多糖濃度為0.991 mg/mL。

2.4.3 香椿子多糖DPPH自由基清除率測(cè)定 參照文獻(xiàn)[11-13]，精密移取2.0 mL不同濃度香椿子多糖溶液和Vc溶液于試管中，加入2.0 mL 0.04 mg/mL DPPH溶液混勻，暗處反應(yīng)30 min，517 nm處測(cè)定吸光度（Ai），同時(shí)測(cè)定2.0 mL DPPH溶液（0.04 mg/mL）與等體積蒸餾水混合溶液的吸光度（A0），不同濃度香椿子多糖溶液與等體積無(wú)水乙醇混合液的吸光度（Aj），以Vc作為陽(yáng)性對(duì)照，平行測(cè)定3次，取平均值。根據(jù)公式DPPH?清除率（％）＝（A0－Ai＋Aj）÷ A0×100％計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。可見(jiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，香椿子多糖對(duì)DPPH?有一定清除能力；清除能力隨多糖濃度增加而增加，但低于Vc對(duì)DPPH?的清除能力。

圖3　Vc對(duì)DPPH·清除作用測(cè)定結(jié)果

圖4　香椿子多糖對(duì)DPPH·清除作用測(cè)定結(jié)果

在0.002～0.007 mg/mL范圍內(nèi)，根據(jù)Vc清除率，利用Excel2010軟件對(duì)曲線進(jìn)行擬合，得方程Y＝0.005 58e385.03X，r＝0.998 7，可知Vc對(duì)DPPH?的IC50為0.005 7 mg/mL；在0.2～1.6 mg/mL范圍內(nèi)，根據(jù)香椿子多糖清除率，同法擬合方程Y＝0.326 8lnX＋0.779 4，r＝0.986 0，可知香椿子多糖對(duì)DPPH?的IC50為0.43 mg/mL。

3 小結(jié)

本研究以多糖含量為指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化香椿子多糖提取工藝，初步建立了香椿子多糖制備方法，為后續(xù)香椿子多糖進(jìn)一步分離純化及活性評(píng)價(jià)奠定了研究基礎(chǔ)。

香椿子多糖有一定抗氧化活性，本研究初步建立了數(shù)學(xué)模型，可為從中尋找新的清除體內(nèi)自由基的抗氧化劑提供理論依據(jù)。

香椿子多糖具有抗氧化生物活性，本研究尚未對(duì)其進(jìn)行分離純化及理化性質(zhì)分析，香椿子多糖構(gòu)效與量效關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。

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Study of Extraction Process of Polysaccharide from Seeds of Toona sinensis and Antioxidant

Activity in Vitro

DING Shi-hong1, LIU Bing1, ZHAO Shu-wei2, LI Yi-qing1, LI Wan-zhong1(1. Weifang

Medical University, Weifang 261053, China; 2. Changle County Hospital of Traditional Chinese Medicine, Weifang 262400, China)

Objective To optimize the conditions of extraction process of polysaccharides from seeds of Toona sinensis; To preliminary determinate the antioxidant activity in vitro. Methods The content of polysaccharides from Toona sinensis was chosen as evaluation index; the extraction time, material liquid ratio, and extraction times were chosen as factors; L9(34) orthogonal design was used to optimize extraction process; antioxidant activity of polysaccharides from Toona sinensis was investigated by the total reducing power and 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl (DPPH) method. Results From the statistical data of processing, the optimal extracting conditions were as follows: liquid to material was 1:12, extraction time was 120 min, and extracted for 3 times. Polysaccharides from seeds of Toona sinensis had certain reducing capacity and had better scavenging ability on DPPH? and the scavenging rate significantly increased with the concentration. The effect was simulated by curve equation. Conclusion The process is simple, feasible, stable and reliable and can be used for the small-scale study on extraction of polysaccharides from seeds of Toona sinensis. Polysaccharides from seeds of Toona sinensis have antioxidant activity.

polysaccharides from seeds of Toona sinensis; extraction process; antioxidation

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.025

R284.2

A

1005-5304(2016)03-0091-04

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81274049）

李萬(wàn)忠，E-mail：lwzwfmc@163.com

（2015-05-08）

（2015-06-02；編輯：陳靜）