閆 帥 高崧淋 陳玉杰 魏垚臣 王海濤

華北理工大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 河北唐山 063000

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創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞Bax的表達(dá)

閆 帥 高崧淋 陳玉杰 魏垚臣 王海濤

華北理工大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 河北唐山 063000

①目的 觀察創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Bax)的表達(dá)。②方法 選用Wistar大鼠，隨機(jī)分為對照組和模型組，使用單一連續(xù)應(yīng)激(SPS)建立PTSD大鼠模型，采用激光共聚焦方法觀察神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)與Bax在海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞中的共存。③結(jié)果 模型組大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP、Bax陽性細(xì)胞數(shù)和積分光密度均高于對照組(P<0.05)。④結(jié)論 PTSD大鼠海馬組織星形膠質(zhì)細(xì)胞Bax表達(dá)增加，這可能與PTSD發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙 海馬 星形膠質(zhì)細(xì)胞 激光掃描共聚焦

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(posttraumatic stress disorder, PTSD)是個體親歷災(zāi)難性事件或死亡威脅所引發(fā)的一種精神障礙。其核心癥狀之一是反復(fù)不自主的創(chuàng)傷性再體驗[1]。海馬是空間定位以及學(xué)習(xí)記憶功能相關(guān)的重要腦區(qū)。有報道PTSD等應(yīng)激選擇性的損害海馬，致使海馬組織體積縮小、功能減退[2]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞90%為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其中20%為星形膠質(zhì)細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞可調(diào)節(jié)神經(jīng)信號傳遞、誘導(dǎo)突觸形成，同時為神經(jīng)元提供重要的營養(yǎng)、通訊和保護(hù)作用，是連接神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的橋梁。星形膠質(zhì)細(xì)胞已經(jīng)成為研究神經(jīng)科學(xué)的熱點[3～8]。PTSD患者星形膠質(zhì)細(xì)胞是否存在凋亡，目前還未見明確報道。本實驗研究觀察PTSD大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Bax)和神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP)的表達(dá)情況，為PTSD研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物和分組 雄性Wistar大鼠20只(購自華北理工大學(xué)動物實驗中心)，體質(zhì)量200～250g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對照組和模型組，每組10只。飼養(yǎng)條件：12小時白天/12小時黑夜,(22±1)℃,(52±2)%濕度，換氣通風(fēng)，自由進(jìn)食進(jìn)水。鼠盒、飲水瓶、墊料和飼料都經(jīng)高壓消毒。每周兩次更換墊料、消毒，隔周更換消毒劑品種，每月進(jìn)行一次大消毒。

1.2 主要試劑和儀器 兔抗鼠GFAP抗體、鼠抗鼠Bax抗體、羊抗兔lgG/Alexa Fluor 488、羊抗鼠lgG/Alexa Fluor 647均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；石蠟切片機(jī)，德國徠卡HZ1220；激光共聚焦顯微鏡，德國徠卡TCS SP8 STED。

1.3 方法

1.3.1 制備PTSD模型大鼠。模型組給予單一連續(xù)應(yīng)激(SPS)，建立PTSD大鼠模型。SPS應(yīng)激括禁錮2分鐘，強(qiáng)迫游泳20分鐘，乙醚麻醉至昏迷。實驗結(jié)束后，靜養(yǎng)7天，自由飲水?dāng)z食。

1.3.2 灌注。①用3%戊巴比妥鈉1mg/kg腹腔注射,將小鼠麻醉；②切開胸骨下端,暴露出心臟,將針尖插入心尖部,最好能插入主動脈中,但要注意避免損傷心臟,將生理鹽水開關(guān)打開,沖洗全身洗液,隨即再用剪刀剪開右心耳,至沖洗的顏色無血色為止,注意右心耳不能剪的太大；③關(guān)掉生理鹽水開關(guān),用4%的多聚甲醛灌注,至小鼠的肝臟發(fā)白,身體變僵硬為止；④將動物斷頭留取完整腦組織；⑤將腦組織立刻置于 4%多聚甲醛固定24小時。

1.3.3 制作石蠟切片。①取出組織塊，進(jìn)行編號，置入有孔容器；②流水沖水2小時；③脫水：50%酒精4小時→70%酒精4小時→80%酒精10小時→90%酒精3小時→95%酒精Ⅰ2小時→95%酒精Ⅱ2小時→100%酒精Ⅰ1.5小時→100%酒精Ⅱ1.5小時；④透明：1/2二甲苯+1/2無水乙醇(1h)→純二甲苯(30分鐘)；⑤浸蠟：組織經(jīng)透明后放入熔化的軟蠟(熔點<54℃)內(nèi)2小時；然后入硬蠟(熔點>54℃)2小時；⑥包埋：將熔化的石蠟倒入包埋框再將組織塊放入，放入時不能有氣泡；⑦切片：選擇一些完整的組織片，切片， 片厚5μm。

1.3.4 脫蠟至水。①拷片：1～1.5小時；②脫蠟：二甲苯Ⅰ 20分鐘→二甲苯Ⅱ 20分鐘→100%酒精Ⅰ10分鐘→100%酒精Ⅱ10分鐘→95%酒精Ⅰ5分鐘→95%酒精Ⅱ5分鐘→90%酒精5分鐘→80%酒精5分鐘→70%酒精5分鐘；③置于搖床上，PBS緩沖液蕩洗3次，每次5分鐘。

1.3.5 抗原修復(fù)(微波輻射法)。①3%H2O2甲醇處理10分鐘；②自來水、蒸餾水各洗一遍(勿直接沖洗)；③檸檬酸鹽緩沖液浸泡，隨后置于微波爐中微波輻射10分鐘(前8分鐘中高火加熱，后2分鐘高火加熱)；④待修復(fù)液降至室溫；⑤置于搖床上，用PBS緩沖液，蕩洗三次 每次5分鐘。

1.3.6 破膜處理上一抗、二抗。⑴將組織周圍液體拭去，用免疫組化筆在距離組織周圍1～2cm處畫圈，以防滴加的各種液體外溢。將載玻片置于暗盒上操作，使其完整平穩(wěn)，注意周圍環(huán)境要保持濕潤；⑵切片上滴加0.4%PBS-Triton，室溫孵育15分鐘，甩去，將多余液體吸出；⑶滴加PBS緩沖液洗滌，甩去；⑷用正常山羊血清封閉(使用PBS緩沖液1：10倍稀釋)，室溫孵育10分鐘，甩去血清，勿洗(注意：血清同二抗種屬一樣)；⑸滴加一抗50μL，用PBS緩沖液以1:100稀釋，4℃過夜；⑹4℃過夜后，室溫自然復(fù)溫45分鐘；⑺PBS緩沖液，蕩洗三次 每次5分鐘；⑻滴加二抗(全程避光處理)：滴加Alexa Fluor488 標(biāo)記羊抗兔熒光二抗與Alexa Fluor647標(biāo)記羊抗小鼠熒光二抗混合液(均為1:200配置)20℃～25℃室溫避光孵育2小時；⑼PBS緩沖液，洗三次 每次10分鐘；⑽用含DAPI的抗熒光衰減封片劑封固，激光共聚焦顯微鏡鏡檢。⑾高倍鏡下隨機(jī)選取10個視野，進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù)，并利用分析軟件分析熒光積分光密度值。

2 結(jié)果

2.1 陽性細(xì)胞數(shù)量比較 GFAP陽性細(xì)胞呈綠色熒光，Bax陽性細(xì)胞呈紅色熒光。模型組GFAP陽性和Bax陽性細(xì)胞數(shù)均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩種陽性細(xì)胞計數(shù)結(jié)果見表1、圖1。

表1 兩組大鼠海馬膠質(zhì)細(xì)胞Bax、GFAP陽性細(xì)胞計數(shù)結(jié)果比較

2.2 膠質(zhì)細(xì)胞積分光密度分析 對熒光免疫組織化學(xué)染色結(jié)果分別進(jìn)行光密度分析，模型組GFAP和Bax熒光積分光密度均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 兩組大鼠海馬膠質(zhì)細(xì)胞積分光密度分析結(jié)果比較±s)

2.3 GFAP和Bax在星形膠質(zhì)細(xì)胞的共存 GFAP和Bax兩種蛋白熒光Merge之后呈現(xiàn)黃色，見圖1中D和H。鏡下觀察，模型組黃色熒光的積分光密度高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

(A-D：對照組，E-H：模型組。AE：GFAP，BF：Bax：CG：核；DH：Merge)

3 討論

經(jīng)歷自然災(zāi)害、慘重車禍、恐怖暴力等嚴(yán)重創(chuàng)傷事件的人中，罹患PTSD的比例約為25%～30%，其發(fā)病機(jī)制涉及到多個領(lǐng)域[9]。對PTSD的理論探討和實證研究，越來越為學(xué)界所重視。PTSD患者總是處于創(chuàng)傷經(jīng)歷重現(xiàn)和極力擺脫與創(chuàng)傷有關(guān)回憶的沖突中,這種強(qiáng)烈的精神創(chuàng)傷導(dǎo)致其損害癥狀主要集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性的領(lǐng)域。海馬組織是在學(xué)習(xí)和記憶功能以及調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌和自主神經(jīng)活動中起重要作用的腦區(qū)[3,4]，是參與調(diào)解情感、認(rèn)知、行為的重要邊緣系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，使不斷出現(xiàn)創(chuàng)傷性再體驗的恐懼反應(yīng)難于抑制或過分抑制。

研究表明，PTSD大鼠海馬椎體神經(jīng)元的樹突減少，體積縮小[10]。強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)引起的Ga2+大量內(nèi)流，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞受損而凋亡，凋亡細(xì)胞產(chǎn)生的某種信號引起周圍細(xì)胞內(nèi)部的溶酶體釋放出大量的酸性磷酸酶并用于攝取和消化凋亡的細(xì)胞，從而神經(jīng)元數(shù)目減少，海馬萎縮，最終引起海馬體積減小。前期研究發(fā)現(xiàn)PTSD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡增加[11]。膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，其數(shù)量是神經(jīng)細(xì)胞的10～50倍，其中主要成分為星形膠質(zhì)細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞不單純是“膠質(zhì)基質(zhì)”，而是具有多種復(fù)雜功能的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主動參與者。但在PTSD發(fā)病過程中，關(guān)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能改變，目前少有報道。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記蛋白，采用熒光標(biāo)記方法可以原位顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞[12]。Bax蛋白是一種促凋亡蛋白，其表達(dá)升高提示細(xì)胞凋亡增強(qiáng)。本研究采用激光共聚焦方法觀察GFAP和Bax的表達(dá)，以此檢測PTSD大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果表明，PTSD大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP和Bax陽性細(xì)胞數(shù)量以及二者熒光積分光密度均高于對照組，提示PTSD大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞中Bax表達(dá)明顯增強(qiáng)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡可能與PTSD發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

注：實驗中TUNEL染色實驗失敗，由于作者面臨實習(xí)工作考研，無法繼續(xù)實驗，所以只做了Bax指標(biāo)。

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(2016-05-04 收稿)(張愛國 編輯)

Bax expression in the hippocampus astrocytes of PTSD model rats

YANShuai,GAOSonglin,CHENYujie,etal

(ClinicalMedicalSchool,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To observe the expression of Bax in hippocampus astrocytes of post-traumatic stress disorder (PTSD) model rats.Methods Male wistar rats were divided into model group and control group randomly.Single-prolonged stress was used to built PTSD rats model,and laser scanning confocal microscopy was used to observe the coexistence of GFAP and Bax in hippocampal astrocytes.Results The number of positive cells and integral optical density of GFAP,Bax in hippocampal astrocytes in the hippocampus of model group were higher than that in control group rats significantly(P<0.05).Conclusion The Bax expression of hippocampal astrocytes in PTSD model rats is increase, which may be involved in the pathogenesis of PTSD.

Post-traumatic stress disorder.Hippocampus.Astrocyte.Laser scanning confocal microscopy

華北理工大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(編號：X2015152)。

閆帥(1992-)，女，本科生。研究方向：醫(yī)學(xué)影像。

王海濤。

R 749.99

A

2095-2694(2016)06-421-04