宋艷梅，劉亞魯，李 峰△

1山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院藥劑科

山東仁瓜蔞的HPLC指紋圖譜研究*

宋艷梅1，劉亞魯2，李 峰1△

1山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院藥劑科

目的:建立山東仁瓜蔞的高效液相色譜法(H PLC)指紋圖譜。方法：采用A gi l ent ZO RBA X SB-C18色譜柱（4.6 m m×250 m m，粒度5 μm），以甲醇-水（95∶5）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速1 m L/m i n，柱溫25℃，檢測波長230 nm，進(jìn)樣量20 μL。結(jié)果:建立了山東仁瓜蔞的H PLC指紋圖譜，方法學(xué)考察結(jié)果良好，確立了9個(gè)共有峰，其中1個(gè)共有峰得到確認(rèn)，10批仁瓜蔞藥材的H PLC指紋圖譜的相似度均＞0.95。結(jié)論:該方法重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，建立的指紋圖譜可為山東仁瓜蔞藥材的質(zhì)量評價(jià)提供依據(jù)。

仁瓜蔞；高效液相色譜法；指紋圖譜

瓜蔞(Trichosanthis fructus)為葫蘆科栝樓屬植物栝樓（Trichosanthes kirilowii Maxim）或雙邊栝樓（Trichosanthes rosthornii Harms）的干燥成熟果實(shí)，具有清熱滌痰、寬胸散結(jié)、潤燥滑腸的功效［1］。瓜蔞的原植物可分為栝樓和雙邊栝樓，其植株形態(tài)、果實(shí)的外形和質(zhì)量差異顯著，其中“仁瓜蔞”為山東省栽培瓜蔞的主流品種，量大質(zhì)優(yōu)。高效液相色譜法(HPLC)中藥指紋技術(shù)是目前判斷中藥材真?zhèn)?，評價(jià)質(zhì)量優(yōu)劣綜合的、可量化的鑒別手段。為實(shí)現(xiàn)瓜蔞的規(guī)范化種植，保護(hù)仁瓜蔞種質(zhì)資源，為仁瓜蔞質(zhì)量控制提供依據(jù)，我們對山東10批仁瓜蔞樣品進(jìn)行了HPLC指紋圖譜研究。

1 材料與方法

1.1 藥材 取仁瓜蔞成熟果實(shí)，自然陰干后，鐵研船研磨，過40目篩，備用。供試材料經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李峰教授準(zhǔn)確鑒定，材料來源見表1。

表1 10批山東仁瓜蔞藥材樣品

1.2 儀器和試劑 高效液相色譜儀(AGILENT1100)；色譜柱(Agilent ZORBAX SB-C18柱，4.6 mm×250 mm，粒度5 μm)；KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司提供)；甲醇(色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，批號：20131126)；娃哈哈純凈水。

1.3 方法［2-5］

1.3.1 供試品溶液制備方法的優(yōu)選 精密稱取粉碎后過40目篩的瓜蔞成熟果實(shí)5.0 g，分別選用甲醇、50%甲醇、乙醇、氯仿、乙醚和石油醚100 mL為溶劑，30分鐘超聲波振蕩提取，抽濾，揮去溶劑，甲醇定容至10 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過，HPLC分析，流速為1 mL/min，吸收波長：230 nm，流動(dòng)相為甲醇∶水=97∶3，記錄60分鐘色譜圖，選出適宜的提取溶劑。

1.3.2 高效液相色譜條件的選擇

1.3.2.1 檢測波長的選擇 精密稱定瓜蔞粉末5.0 g，上述方法制備樣品液后采用甲醇和水梯度洗脫，在190～400 nm全波長下掃描，選擇能夠較多顯示瓜蔞化學(xué)成分信息的波長，進(jìn)一步進(jìn)行波長優(yōu)選，最后根據(jù)優(yōu)選結(jié)果，選擇檢測波長為230 nm。見圖1。

圖1 瓜蔞H PLC3D光譜圖

1.3.2.2 洗脫條件的選擇 精密稱取瓜蔞樣品粉末5.0 g，以氯仿為溶劑，超聲波振蕩30分鐘提取，過濾，揮干氯仿，甲醇定容至10 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過，柱溫25℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，檢測波長230 nm，分別采用以下洗脫條件進(jìn)行HPLC分析。洗脫條件1，甲醇∶水=97∶3作為流動(dòng)相，非梯度洗脫60分鐘。洗脫條件2，見表2。洗脫條件3，見表3。

表2 洗脫條件2

1.3.3 對照品實(shí)驗(yàn) 2010年版《中華人民共和國藥典》(一部)未對瓜蔞藥材的標(biāo)準(zhǔn)品做出規(guī)定，程雪梅等［6］經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)3，29-二苯甲?；闃侨嗜际枪鲜V中含有的一種有效成分，具有很好的專屬性和穩(wěn)定性，所以我們選擇3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇作為仁瓜蔞HPLC指紋圖譜分析的對照品。吸取上述對照品溶液20 μL，按優(yōu)選的高效液相色譜條件洗脫，確定對照品的位置，記錄色譜圖。

1.3.4 方法學(xué)考察

1.3.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取第1批仁瓜蔞樣品粉末5.0 g，精密稱定，以優(yōu)選出的方法制備樣品液，連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測定，結(jié)果表明，峰面積占總峰面積2%以上的色譜峰，其相對保留時(shí)間的RSD值均小于0.9993%，相對保留峰面積的比值均小于2.398%，均在3%以內(nèi)，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

1.3.4.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取第4批仁瓜蔞樣品粉末5.0 g，精密稱定，以優(yōu)選出的方法制備樣品液，分別在0、4、8、16、24、48小時(shí)檢測，結(jié)果表明，峰面積占總峰面積2%以上的色譜峰，其相對保留時(shí)間的RSD值均小于0.7555%，相對保留峰面積的比值均小于2.6093%，均在3%以內(nèi)，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

1.3.4.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取第9批仁瓜蔞樣品粉末5.0 g，精密稱定，共取6份，以優(yōu)選出的方法制備樣品液，分別進(jìn)行測定。結(jié)果表明，峰面積占總峰面積2%以上的色譜峰，其相對保留時(shí)間的RSD值均小于0.8311%，相對保留峰面積的比值均小于2.6861%，均在3%以內(nèi)，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

1.3.5 10批仁瓜蔞的H PLC指紋圖譜研究 采用上述條件對山東10批仁瓜蔞進(jìn)行HPLC指紋研究，運(yùn)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004年版》對10批仁瓜蔞樣品的HPLC指紋圖譜進(jìn)行匹配和相似度分析。

2 結(jié)果

2.1 制備方法優(yōu)選 結(jié)果表明采用石油醚、乙醚、氯仿、50%甲醇、甲醇、乙醇提取，所得HPLC色譜峰數(shù)目、峰形相差較大，其中氯仿提取所得的色譜峰數(shù)目較多，峰強(qiáng)度較高，結(jié)合瓜蔞中含有較多的三萜皂苷類化合物的極性特點(diǎn)，以及色譜分離的情況，選擇氯仿作為提取溶劑，超聲波振蕩30分鐘提取較適宜。

2.2 色譜條件的選擇 根據(jù)檢測波長優(yōu)選結(jié)果，選擇檢測波長為230 nm。采用3種洗脫條件洗脫結(jié)果見圖2—4。

圖2 洗脫條件1 H PLC色譜圖

圖3 洗脫條件2 H PLC色譜圖

圖4 洗脫條件3 H PLC色譜圖

由圖可知，在洗脫條件1下，除去溶劑峰和雜質(zhì)峰，分離得到9個(gè)色譜峰，色譜峰分離度較好，但是峰強(qiáng)度較弱，后30分鐘沒有色譜峰分離。在洗脫條件2下前30分鐘基本沒有分離出色譜峰，后10分鐘有3個(gè)峰分離，但是由于時(shí)間較短，峰沒有分離完全，而且分離度不好。在洗脫條件3下，除去溶劑峰和雜質(zhì)峰，得到色譜峰數(shù)目最多，色譜峰分離度較好。綜合所得色譜峰的數(shù)目、分離度、強(qiáng)度等因素，本實(shí)驗(yàn)采用洗脫條件3。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用氯仿作為提取溶劑，超聲波震蕩30分鐘提取，柱溫25℃，采用洗脫條件3，選擇230 nm作為檢測波長進(jìn)行仁瓜蔞HPLC指紋圖譜研究。

2.3 對照品實(shí)驗(yàn) 選擇3，29-二苯甲?；闃侨嗜甲鳛槿使鲜VHPLC指紋圖譜分析的對照品。吸取上述對照品溶液20 μL，按優(yōu)選的高效液相色譜條件洗脫，確定對照品的位置，記錄色譜圖，結(jié)果見圖5。

圖5 對照品溶液H PLC圖譜

2.4 山東仁瓜蔞指紋圖譜測定

2.4.1 共有峰的標(biāo)定 按照本研究方法檢測山東l0批仁瓜蔞藥材的HPLC指紋圖譜，并運(yùn)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004年版》對山東10批仁瓜蔞樣品的HPLC指紋圖譜進(jìn)行了匹配，所得匹配圖譜見圖6。

圖6 10批山東仁瓜蔞的H PLC匹配圖譜

參考國家食品藥品監(jiān)督管理局制定的《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》［3］，經(jīng)過對上述10批樣品的測試分析和研究比較，并運(yùn)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004年版》，以中位數(shù)法生成10批仁瓜蔞藥材的對照指紋圖譜歸納確定山東仁瓜蔞的HPLC指紋圖譜具有9個(gè)共有的基本特征峰，如圖7所示。

圖7 山東仁瓜蔞的H PLC對照指紋圖譜

描述如下：仁瓜蔞的指紋特征峰從左到右依次為：1號峰右側(cè)帶有1個(gè)肩峰；2號為1個(gè)尖峰，分離較好，峰強(qiáng)度較高；3號、4號、5號為3個(gè)單峰，3號峰雖較小，但分離較好，相對保留時(shí)間和面積最為穩(wěn)定；6號為1個(gè)尖峰，比較穩(wěn)定；7號峰比較穩(wěn)定；8號峰形寬而且較低；9號為1～2個(gè)連續(xù)峰。

比較圖6—7各特征峰的保留時(shí)間與圖5中3,29-二苯甲?；闃侨嗜紭?biāo)準(zhǔn)品峰的保留時(shí)間可知，瓜蔞指紋圖譜中3號峰為3,29-二苯甲?；闃侨嗜嫉奈辗澹朔蹇勺鳛樯綎|仁瓜蔞指紋圖譜的內(nèi)標(biāo)參照峰。

2.4.2 相似度評價(jià) 運(yùn)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004年版》對山東10批仁瓜蔞的相似度進(jìn)行分析，分析結(jié)果見表4。

表4 山東10批仁瓜蔞相似度比較

由相似度比較結(jié)果可知，10批山東仁瓜蔞藥材的HPLC指紋圖譜的相似度均大于0.95，說明這10批樣品質(zhì)量相對較穩(wěn)定，符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》規(guī)定，因此，所建立的仁瓜蔞HPLC對照指紋圖譜合格，可作為山東仁瓜蔞藥材的標(biāo)準(zhǔn)圖譜。

3 討論

3.1 參照物的選擇 由于2010年版《中華人民共和國藥典》(一部)未對瓜蔞藥材的標(biāo)準(zhǔn)品做出規(guī)定，經(jīng)查閱關(guān)于瓜蔞對照品文獻(xiàn)報(bào)道較少，程雪梅等［6］經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)3,29-二苯甲?；闃侨嗜际枪鲜V中含有的一種有效成分，具有很好的專屬性和穩(wěn)定性，可作為瓜蔞質(zhì)量評價(jià)的指標(biāo)之一。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，山東仁瓜蔞指紋圖譜的3號峰為3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇的吸收峰，其峰形雖然較小，但是峰分離度較好，而且相對保留時(shí)間和面積最為穩(wěn)定，所以我們選擇3，29-二苯甲?；闃侨嗜嘉招纬傻?號共有峰作為山東仁瓜蔞指紋圖譜的內(nèi)標(biāo)參照峰。

3.2 測定方法的選擇

3.2.1 檢測波長的選擇 本研究利用Agilent DAD檢測器具有的所有模式儲存采集光譜圖的特點(diǎn)，通過從光譜圖數(shù)據(jù)中篩選信號，獲得分離色譜峰信息較多的檢測波長210、220、230、240、250 nm。經(jīng)過比較220 nm和230 nm檢測波長下的主要色譜峰的保留時(shí)間和峰型相似，但是以230 nm為檢測波長的色譜圖中色譜峰分離較好、出峰時(shí)間較短、分離強(qiáng)度較高，且與相關(guān)文獻(xiàn)［6］報(bào)道吻合，所以本實(shí)驗(yàn)選用230 nm作為檢測波長。

3.2.2 流動(dòng)相的選擇 由于瓜蔞藥材成分復(fù)雜，選用單一流動(dòng)相難以很好的分離，需采用梯度洗脫才能達(dá)到較好的分離效果。梯度洗脫是流動(dòng)相中含有兩種或兩種以上不同極性的溶劑，在洗脫過程中連續(xù)或間斷改變流動(dòng)相組成，以調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性使每個(gè)流出的組分獲得最理想的分離效果，并使樣品中的所有組分在最短的分析時(shí)間內(nèi)以適宜的分離度獲得較好的選擇性分離。經(jīng)梯度洗脫分離的瓜蔞各共有色譜峰峰型尖銳，分離較好。在實(shí)驗(yàn)中，選用了文獻(xiàn)報(bào)道中常用的甲醇∶水作為流動(dòng)相進(jìn)行考察，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)摸索，結(jié)果表明，以甲醇∶水=95∶5(洗脫條件3)進(jìn)行梯度洗脫分離的效果最好。

3.3 相似度分析 由相似度比較結(jié)果可知，10批山東仁瓜蔞藥材的HPLC指紋圖譜的相似度均大于0.95，說明這10批樣品質(zhì)量相對較穩(wěn)定，符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》規(guī)定，因此，所建立的仁瓜蔞HPLC對照指紋圖譜合格，可作為山東仁瓜蔞藥材的標(biāo)準(zhǔn)圖譜。

山東仁瓜蔞HPLC指紋圖譜的建立為保證瓜蔞藥材的質(zhì)量，建立完善瓜蔞的質(zhì)量控制關(guān)鍵技術(shù)和評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2010年版一部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:104．

［2］ 周鳳琴，徐凌川，張永清，等.山東瓜蔞生產(chǎn)情況調(diào)查［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，26(5):379-381．

［3］ 國家食品藥品監(jiān)督管理局.中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)［J］.中成藥，2000，22(10):671-675.

［4］ 周濤，黃璐琦，江維克.高效液相色譜法測定大方油栝樓藥材中葫蘆素B的含量［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2008，1(6): 4-5.

［5］ 時(shí)巖鵬，姚慶強(qiáng)，劉擁軍，等.栝樓化學(xué)成分的研究及其α—菠菜甾醇的含量測定（Ⅰ）［J］.中草藥，2002，33(1):15-16.

［6］ 程雪梅，吳弢，俞桂新，等.RP-H PLC法測定瓜蔞子中3，29-二苯甲?；闃侨嗜嫉暮浚跩］.藥物分析雜志，2005，25 (4):377-380.

Study in HPLC Fingerprint of RenGuaLou from Shandong Province

SONG Yanmei1,LIU Yalu2,LI Feng1△
1 School of pharmacy of Shandong University of traditional Chinese medicine,Jinan 250355,China;
2 Pharmacy Department in Qilu Children's Hospital of Shandong University

Objective:To establish HPLC fingerprint of RenGuaLou(trichosanthis)from Shandong Province. Methods:The HPLC method was used on an Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm,5 μm）chromatographic column with methanol-water(95:5)as mobile phase in gradient elution at the detection wavelength of 230 nm with the flow rate of 1 mL/min，and the column temperature was 25℃,the sample injection was 20 μL.Results:The HPLC fingerprint of RenGuaLou from Shandong Province was established．The methodological investigation result was good．Nine common peaks were existed in the fingerprint and one common peaks were confirmed．The similarities of ten batches of herb trichosanthis were greater than 0.95.Conclusion:The method holds a good stability and a well repeatability,and the established fingerprint can provide a basis for quality evaluation for herb RenGuaLou from Shandong Province．

RenGuaLou;HPLC;fingerprint

R284.1

A

1004-6852(2016)08-0024-05

2015-12-09

山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(編號2007G G 2N S02052)。

宋艷梅(1977—)，女，博士學(xué)位，講師。研究方向：中藥資源開發(fā)與質(zhì)量控制。

△通訊作者：李峰(1957—)，男，博士學(xué)位，博士研究生導(dǎo)師，教授。研究方向：中藥質(zhì)量控制研究。