林 洋 ， 劉 艷 ， 夏圣榮 ， 曹艷子 ， 單春?jiǎn)?， 嚴(yán)秀梅 ， 江國(guó)托

(1.大連三儀動(dòng)物藥品有限公司 ， 遼寧大連116036 ； 2.江蘇省金湖縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 江蘇淮安211600)

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中藥制劑對(duì)人工感染雞大腸桿菌病療效的研究

林 洋1， 劉 艷1， 夏圣榮2， 曹艷子1， 單春?jiǎn)?， 嚴(yán)秀梅1， 江國(guó)托1

(1.大連三儀動(dòng)物藥品有限公司 ， 遼寧大連116036 ； 2.江蘇省金湖縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 江蘇淮安211600)

為了考察中藥制劑對(duì)人工感染雞大腸桿菌病的治療效果。以大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株O78、O1、O2三種混合大腸桿菌菌液肌肉注射感染15 日齡海藍(lán)褐蛋公雞，之后口服不同劑量的中藥制劑與氟苯尼考粉，觀察試驗(yàn)雞的臨床癥狀、病理變化、病變發(fā)生率等，最終統(tǒng)計(jì)出試驗(yàn)雞的死亡率和治愈率。采用Duncan 法多重比較，結(jié)果各試驗(yàn)組雞只死亡率均與感染對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，而試驗(yàn)組之間差異不顯著(P>0.05)，中藥高劑量組對(duì)感染雞只治愈率與感染對(duì)照組雞只自愈率差異顯著(P<0.05)，且近似于氟苯尼考粉組。因此，中藥制劑可以作為有效控制和治療雞大腸桿菌病的途徑之一。

大腸桿菌 ； 中藥 ； 藜蒿 ； 抑菌作用；

大腸桿菌是獸醫(yī)臨床感染中最常見致病菌之一，能夠引起局部或全身性感染的疾病，如大腸桿菌敗血癥、氣囊炎、關(guān)節(jié)炎、腫頭綜合征、輸卵管炎、腹膜炎、全眼球炎及臍炎等。大腸桿菌病是一種條件性疾病，養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)環(huán)境污染、通風(fēng)不良、飼養(yǎng)密度大、濫用抗生素等因素易造成大面積發(fā)病，尤其是雛雞感染后發(fā)病率和死亡率較高，常給養(yǎng)殖戶帶來較大經(jīng)濟(jì)損失。

大腸桿菌病之所以廣泛流行，正是由于大腸桿菌耐藥機(jī)制不斷變化，耐藥譜不斷擴(kuò)大，耐藥水平不斷提高，從而影響了獸醫(yī)臨床對(duì)大腸桿菌感染的治療效果。尤其是大腸桿菌的耐藥性可能通過畜禽產(chǎn)品以及環(huán)境等途徑造成交叉?zhèn)鞑?，?duì)人類的生命健康構(gòu)成威脅。目前，大腸桿菌對(duì)抗生素的耐藥性問題，己在世界范圍內(nèi)引起重視。因此，設(shè)法尋求抑制大腸桿菌的耐藥性迫在眉睫[1-2]。

本試驗(yàn)根據(jù)大腸桿菌的發(fā)病特點(diǎn)和中藥配伍中“君臣佐使”的藥理作用，制備一種抑制大腸桿菌的中藥制劑，對(duì)人工感染大腸桿菌的蛋雞進(jìn)行治療效果研究，以期為防治雞大腸桿菌病篩選出有效方劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 中藥：本試驗(yàn)選用黃芩、連翹、葛根和甘草4 味中藥，購(gòu)自白云山藥房。野生藜蒿采自江西省鄱陽湖，曬干后備用。氟苯尼考粉(10%)由大連三儀動(dòng)物藥品有限公司提供，按說明書使用。

試驗(yàn)菌株與培養(yǎng)基：供試大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株O78、O1、O2，購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心并由大連三儀動(dòng)物藥品有限公司保存。供試培養(yǎng)基均按常規(guī)法制備，滅菌后置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)動(dòng)物：350 只健康海藍(lán)褐蛋公雞，購(gòu)自韓偉雞場(chǎng)。未免疫大腸桿菌疫苗，試驗(yàn)期間采用無抗生素飼料，自由采食與飲水，15 日齡開始試驗(yàn)，16日齡進(jìn)行給藥，試驗(yàn)周期25 d。

1.2 試驗(yàn)方法1.2.1 中藥制劑 將黃芩、連翹、葛根、甘草4 味中藥和野生藜蒿，烘干后各稱取500 g，加水10 L，浸泡30 min 后煎煮，煮沸后文火煎60 min，過濾，藥渣加水5 L 煮沸60 min，過濾藥液，合并兩次藥液，濾液減壓濃縮至2.5 L，即藥液中生藥含量為1 g/mL，滅菌備用。

1.2.2 常用培養(yǎng)基和溶液的配制 營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體和液體培養(yǎng)基、0.9%生理鹽水的配制均按常規(guī)方法配制，氟苯尼考粉(10%)用無菌水配制成氟苯尼考粉(0.25 g/mL)的溶液，備用。

1.2.3 致病大腸桿菌菌液制備及計(jì)數(shù) 將3 種大腸桿菌菌株接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，菌液經(jīng)稀釋后涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后計(jì)數(shù)，三種大腸桿菌菌液濃度均調(diào)至為5×108CFU/mL，混合后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 大腸桿菌半數(shù)致死量(LD50)的測(cè)定 將30只14日齡的試驗(yàn)雞平均分成6組，每組5只，分別給每只雞肌肉注射0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 大腸桿菌混合菌液，觀察72 h 內(nèi)雞只死亡情況，判定該混合菌的致病力，以感染后能引起死亡率達(dá)50%～60%的菌液濃度為該株細(xì)菌的最佳攻毒劑量。根據(jù)結(jié)果確定5×108CFU/mL 混合菌液肌肉注射0.5 mL/羽。

1.2.5 試驗(yàn)分組與作用方式 將300只15日齡試驗(yàn)雞分為6組，見表1，每組3個(gè)平行組，每個(gè)平行組17只試驗(yàn)雞。

表1 分組與給藥方式

1.2.6 藥效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.2.6.1 體外抑菌試驗(yàn)抑菌圈法：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，放置凝固后作為底層培養(yǎng)基。用無菌吸管吸取大腸桿菌培養(yǎng)液0.1 mL，滴在平皿底層培養(yǎng)基上，用無菌棒將菌液涂勻，在平皿底部作好相應(yīng)標(biāo)記，用打孔器在營(yíng)養(yǎng)瓊脂板上打孔、封底，用滴管分別將藥液加到孔中，150 μL/孔，每孔3 個(gè)重復(fù)，蓋上平皿蓋。然后將滴加藥液的平皿水平置恒溫箱內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。判定標(biāo)準(zhǔn)：≥19 mm 為高度敏感；14～19 mm 為中度敏感；10～14 mm 為低度敏感；≤10 mm為耐藥。

1.2.6.2 體內(nèi)抗菌試驗(yàn) 臨床癥狀及剖檢：致病后病雞精神狀態(tài)和特征觀察，剖檢后器官的病變和特征觀察。

病變數(shù)：凡是剖檢后出現(xiàn)典型大腸桿菌病癥狀，肝臟腫大、易碎、包膜增厚；脾臟腫大，心臟有心包炎，心外膜有纖維蛋白覆蓋物，氣囊渾濁，有干酪樣物質(zhì)覆蓋，十二指腸有出血點(diǎn)，判斷為感染病變數(shù)。

死亡率：凡在試驗(yàn)期間，出現(xiàn)大腸桿菌病癥狀并死亡，剖檢后氣囊、肝臟和心臟有典型病變特征，病料能分離出大腸桿菌的，判斷為感染死亡，計(jì)算死亡率(%)=死亡數(shù)/試驗(yàn)數(shù)×100%。

治愈率：凡在試驗(yàn)期間，雞經(jīng)混飲給藥后，不出現(xiàn)拉稀等癥狀，其精神狀態(tài)、食欲、呼吸等到逐步恢復(fù)正常者均屬治愈，且剖檢后無大腸桿菌病器官典型病變特征，判斷為治愈，計(jì)算治愈率(%)=(試驗(yàn)數(shù)-死亡數(shù)-病變數(shù))/試驗(yàn)數(shù)×100%。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 體外抑菌試驗(yàn) 如表2所示，中藥制劑、主藥及氟苯尼考粉對(duì)大腸桿菌3種血清型均有不同程度的抑制作用。

表2 中藥復(fù)方、主藥劑氟苯尼考粉體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果 (mm)

2.2 臨床癥狀及剖檢 空白對(duì)照組雞群未出現(xiàn)死亡和病變癥狀，健康狀態(tài)良好。而感染大腸桿菌的雞群在致病36 h 后，開始出現(xiàn)癥狀，病雞精神沉郁，羽毛粗亂，閉眼昏睡，食欲下降，腹瀉，張口呼吸，嚴(yán)重的臥地不起而死亡。

病死雞剖檢可見：肝臟充血、腫大、易碎，包膜增厚；脾臟腫大，心臟有心包炎、心包積液，心外膜有纖維蛋白覆蓋物，氣囊渾濁，有干酪樣物質(zhì)覆蓋，十二指腸有出血點(diǎn)。25 日后剖檢所有試驗(yàn)雞，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)雞的死亡率和治愈率。試驗(yàn)采用SPSS17 軟件進(jìn)行分析，各平行組的均值處理采用Duncan法多重比較，結(jié)果如表3所示。

表3 動(dòng)物試驗(yàn)死亡率和治愈率Duncan法多重比較結(jié)果

注：肩角標(biāo)字母不相同表明結(jié)果差異顯著，P<0.05，肩角標(biāo)有相同字母表明結(jié)果差異不顯著，P>0.05

3 結(jié)論

從體外抑菌試驗(yàn)可以看出，中藥制劑、主藥成分及氟苯尼考粉對(duì)雞源大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株O1、O2、O78有不同程度的抑制作用，均能到達(dá)與抗生素抑菌效果相當(dāng)?shù)闹忻舫潭取?/p>

通過體內(nèi)抗菌試驗(yàn)研究，空白組雞群生長(zhǎng)狀態(tài)良好，剖檢后器官一切正常；各試驗(yàn)組雞的死亡率均與感染對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，而試驗(yàn)組之間差異不顯著(P>0.05)，試驗(yàn)中藥高劑量組和氟苯尼考組對(duì)感染雞的治愈率與感染對(duì)照組雞的自愈率差異顯著(P<0.05)，而兩試驗(yàn)組之間差異不顯著(P>0.05)，說明中藥試驗(yàn)組對(duì)雞群有不同程度保護(hù)作用，且效果近似于氟苯尼考組。

4 討論

目前，中藥廣泛應(yīng)用能夠有效防治大腸桿菌病對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成的危害，說明中藥組分具有抗菌作用是不爭(zhēng)的事實(shí)，其作用機(jī)理尚不明確，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)中藥抗大腸桿菌的機(jī)制進(jìn)行一些研究，認(rèn)為：(1)中草藥通過影響致病性大腸桿菌的DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成對(duì)其產(chǎn)生抑制作用[3-4]；(2)中藥通過對(duì)致病性大腸桿菌粘附性的影響[5]抑制大腸桿菌繁殖；(3)中藥提取物可以消除大腸桿菌耐藥性及耐藥質(zhì)粒[6-7]，從而達(dá)到抑殺目的；(4)中藥治療傳染病不一定對(duì)細(xì)菌起直接殺滅作用，可通過扶正和祛邪兩方面來達(dá)到現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所說的增強(qiáng)體質(zhì)、防御病邪的侵襲，提高機(jī)體免疫力和抗病力的作用[8]。但在動(dòng)物體內(nèi)的具體的作用機(jī)制仍需大量試驗(yàn)進(jìn)一步研究與探索。

臨床實(shí)踐表明，中藥及中藥復(fù)方制劑對(duì)禽大腸桿菌病有較好的防治效果，其療效優(yōu)于或與西藥相當(dāng)[9]，并具有殘留低、治愈率高、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，符合當(dāng)今社會(huì)倡導(dǎo)綠色養(yǎng)殖的行業(yè)要求，有著廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

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The study of Chinese Herbal Medicines effect on the Artificial Infection Chicken Colibacillosis

LIN Yang1， LIU Yan1， XIA Sheng-rong2， CAO Yang-zi1，SHAN Chun-qiao1， YAN Xiu-mei1， JIANG Guo-tuo1

(1.Dalian Sanyi Animal Pharmaceutical Co.，LTD，Dalian 116036，China ；2.Animal disease prevention and control center of Jinhu County，Huaian 211600，China)

The purpose of this study was to investigate the therapeutic effect of Chinese Herbal Medicines on Chicken Colibacillosis.The method used 3 mixed standard strains ofE.colisolution O78，O1，O2to infect 15 day-old of highland brown egg rooster by intramuscular injection,and then different doses of Chinese Herbal Medicines and florfenicol powder were given orally,And then the clinical symptoms，pathological changes，incidence of disease were observed,and mortality rate and cure rate were recorded.The results showed that，significant difference(P<0.05)was observed in mortality rate between trial group and infection control group，while there was no significant difference in the trialgroups(P>0.05)The cure rate was significant difference(P<0.05)between infected chickens and control group using high dose of Chinese herbal medicine，which was similar to florfenicol powder group.Therefore，it can be concluded that the Chinese Herbal Medicines can be used to effectively control and treat the chicken colibacillosis.

Escherichia Coli ； Chinese Herbal Medicines ； Artemisia selengnesis ； Bacteriostasis

JIANG Guo-tuo

2015-09-25

林洋(1984-)，男，工程師，碩士生，從事動(dòng)物藥品研發(fā)工作，E-mail：linyang1984@yeah.net

江國(guó)托，E-mail：jgt600@sina.com

S858.31

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0529-6005(2016)10-0049-03