初歡歡 ， 楊海燕 ， 王述柏 ， 劉 斌

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 ， 山東青島266109)

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兩種合成生物活性肽對人工感染大腸桿菌新城疫病毒肉雞的保護試驗

初歡歡 ， 楊海燕 ， 王述柏 ， 劉 斌

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 ， 山東青島266109)

為了研究兩種合成生物活性肽對肉雞的抗菌、抗病毒作用。將1 440只1日齡AA肉雞隨機分為8個處理：6個試驗組分別為兩種肽的低、中、高(10、20、40 μg/kg體重)劑量組，2個對照組分別為桿菌肽鋅組及空白組，每組設(shè)6個重復(fù)，每重復(fù)30只，試驗期42 d。于10 d進行攻菌保護試驗，于33 d進行攻毒保護試驗。試驗結(jié)果表明，20、40 μg/kg體重肽 I μg/kg 和40 μg/kg體重肽Ⅱ具有良好抗大腸桿菌活性，40 μg/kg體重肽I和肽Ⅱ具有良好抗新城疫病毒活性。結(jié)論是試驗所用兩種活性肽產(chǎn)品對肉雞人工感染大腸桿菌和新城疫病毒均有良好保護作用。

活性肽 ； 大腸桿菌 ； 新城疫病毒 ； 攻毒保護

新城疫和大腸桿菌病作為禽類高發(fā)性傳染病，嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，使得安全有效、不易產(chǎn)生耐藥性的新型抗菌抗病毒產(chǎn)品成為當(dāng)前研究的熱點。生物活性肽作為動物體天然存在的生理活性調(diào)節(jié)物，具有抗菌、抗病毒、促生長、提高機體免疫力等功能，是一類較為理想的抗生素類替代品。本試驗研究了兩種合成生物活性肽對人工感染大腸桿菌和新城疫病毒肉雞的保護作用，旨在了解其應(yīng)用于肉雞的抗菌及抗病毒作用效果及使用劑量，從而為其在肉雞生產(chǎn)上推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 兩種合成生物活性肽(肽I 和肽Ⅱ，分別由9 個、7 個氨基酸組成，由上海九川公司提供)；致病性大腸桿菌：大腸桿菌質(zhì)控菌株(25922)；新城疫病毒(NDV)：F48E9 株，由中國動物與流行病學(xué)中心提供。

1.2 試驗動物分組及飼養(yǎng)管理 1日齡AA 肉仔雞1 440 只，隨機分為8 個處理，每個處理180 只雞，設(shè)6 個重復(fù)，每重復(fù)30 只雞。試驗分組與處理見表1。所有組均飼喂同一基礎(chǔ)飼糧，飼糧營養(yǎng)水平參照中國肉雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T33-2004)設(shè)置，各組飼養(yǎng)管理條件一致。

1.3 攻菌試驗

1.3.1 攻菌劑量篩選試驗 大腸桿菌接種于普通培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取典型菌落于MH肉湯中，37 ℃培養(yǎng)18 h。用分光光度計測定OD值，PBS稀釋至108個/mL(平板計數(shù)法測定)和0.5麥?zhǔn)蠞舛?108個/mL，分光光度計625 nm測定吸光度0.08～0.10)。

表1 試驗分組與處理

攻菌劑量篩選：24只7日齡試驗雞隨機分為8組，于8 d胸肌注射108個/mL和109個/mL兩種濃度菌液0.1、0.2、0.4、0.5 mL，每個劑量依次注射3只雞，攻菌后3～48 h內(nèi)觀察記錄發(fā)病及死亡情況，病死雞剖檢，確定為大腸桿菌感染所致，并確定正式攻菌試驗的劑量[1]。

1.3.2 大腸桿菌攻菌試驗 于7d每組每重復(fù)隨機取5只雞(每組共30只)，飼養(yǎng)于預(yù)先消毒好的試驗籠適應(yīng)3 d，于10 d進大腸桿菌攻菌試驗，胸肌注射篩選的最佳劑量及濃度的大腸桿菌菌液。觀察肉雞臨床癥狀。

1.4 攻毒試驗

1.4.1 攻毒劑量篩選試驗 雞新城疫病毒EID50測定：新收獲的待測NDV感染雞胚尿囊液，用無菌生理鹽水作10倍系列稀釋。每個稀釋度一組，每組3枚，絨毛尿囊腔接種9～10日齡雞胚，置于37 ℃孵化3 d，觀察記錄雞胚死亡感染情況[2]。經(jīng)測定新城疫病毒EID50為10-6。

攻毒劑量篩選：12只體重相近21日齡試驗雞隨機分為6組，每組兩只，適應(yīng)環(huán)境3 d后，于24 d進行攻毒劑量篩選試驗。分別采用104、105、106倍EID50濃度(即病毒原液稀釋102、10、1倍)0.1 mL肌肉注射，觀察感染及死亡狀況。然后分別采用上述結(jié)果中適中濃度0.1 mL、0.2 mL兩個劑量，每個劑量3只，進行肌肉注射，觀察感染及死亡狀況，確定正式攻毒的濃度及劑量。

1.4.2 新城疫病毒攻毒試驗 于29 d，每組每重復(fù)隨機取5只試驗雞(每組共30只)，飼養(yǎng)于預(yù)先消毒的試驗籠，適應(yīng)環(huán)境3 d后，于33 d進行新城疫病毒攻毒試驗，試驗雞肌肉注射篩選的最佳濃度及劑量的新城疫病毒。觀察肉雞臨床癥狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌攻菌保護試驗結(jié)果 大腸桿菌攻菌劑量篩選試驗確定攻菌濃度為109個/mL，劑量 0.2 mL。攻菌試驗結(jié)果見表2。由表2可知，肉雞存活率空白對照組最低，肽I低、中、高劑量組分別較空白對照組高4.40%、14.87%、9.54%；肽Ⅱ低、中、高劑量組分別較空白對照組高7.69%、9.54%、13.54%；桿菌肽鋅組較空白對照組高3.47%。各試驗組存活率均高于桿菌肽鋅組。保護率空白對照組和肽Ⅱ低劑量組最低，肽I低、中、高劑量組保護率分別較空白對照組高2.75%、5.13%、4.46%；肽Ⅱ中、高劑量組分別較空白對照組高0.46%、4.46%；桿菌肽鋅組較空白對照組高1.36%?？梢姡?0、40 μg/kg體重肽I和40 μg/kg體重肽Ⅱ?qū)θ斯じ腥敬竽c桿菌肉雞有良好保護作用。

表2 大腸桿菌攻菌保護試驗結(jié)果

2.2 新城疫病毒攻毒保護試驗結(jié)果 新城疫病毒攻毒劑量篩選試驗確定攻毒濃度為106倍EID50濃度，即原病毒液稀釋100倍，劑量0.2 mL。攻毒試驗結(jié)果見表3。由表3可知，存活率空白對照組最低，肽I低、中、高劑量組分別較空白對照組高 3.34%、3.34%、6.67%；肽Ⅱ低、中、高劑量組分別較空白對照組高6.67%、6.67%、10.00%。保護率空白對照組和肽I中劑量組最低，肽I低、高劑量組保護率分別較空白對照組高3.33%、6.67%；肽Ⅱ低、中、高劑量組分別較空白對照組高10.00%、6.67%、10.00%。可見，40 μg/kg體重肽I和肽Ⅱ?qū)θ斯じ腥拘鲁且卟《居辛己帽Ｗo作用。

表3 新城疫病毒攻毒保護試驗結(jié)果

3 討論

目前已有較多研究證實生物活性肽可以一定程度改善機體細(xì)菌危害和耐藥性問題。楊海燕等(2014)[3]采用攻菌試驗研究了復(fù)合生物活性肽對SPF雞抗病力的影響，結(jié)果表明，接種大腸桿菌后試驗組保護率比對照組高20%。鄭健(2011)[4]研究表明，卵轉(zhuǎn)鐵蛋白抗菌活性肽對革蘭陽性菌及革蘭陰性菌均具有抑制作用，對革蘭陽性菌更敏感。趙瑞利等(2013)[5]報道牛蛙活性肽Catesbeianin-1a對豬鏈球菌等具有較好的抑菌活性。本試驗表明飼喂兩種活性肽，對人工感染大腸桿菌均有一定的保護效果，高劑量組效果較好，與上述報道結(jié)果類似。研究表明，活性肽產(chǎn)品具有提高機體免疫作用、抗病毒功效。孫芳(2007)[6]制取的東北林蛙皮膚活性肽對人流感病毒具有抑制作用。曹云飛(2010)[7]研究證明，蠅抗病毒肽Alloferon1對PRRSV和NDV具有良好的抑制作用。本試驗結(jié)果表明，40 μg/kg體重肽I和肽Ⅱ?qū)θ斯じ腥拘鲁且卟《救怆u有良好保護作用，說明這兩種肽作為飼料添加劑使用對肉雞抵抗新城疫病毒感染具有良好作用。

4 小結(jié)

本試驗所用的兩種人工合成活性肽產(chǎn)品，對肉雞感染大腸桿菌和新城疫病毒均有一定保護作用，作用效果隨其劑量增加呈增強趨勢，40 μg/kg體重劑量具有最佳抗菌抗病毒活性。

[1] 王妮，張萬福，賈雪蓮，等.中藥復(fù)方制劑對人工感染雞大腸桿菌病療效的研究[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2012(03)：46-48.

[2] Cattoli G，Susta L，Terregine C，etal.Newcastle disease:a review of field recognition and current methods of laboratory detection[J].Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2011，23(04)：637-656.

[3] 楊海燕，靳繼惠，張傳美，等.一種新型復(fù)合生物活性肽對SPF雞抗病力和生長性能的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014，10(上)：144-146.

[4] 鄭健.卵轉(zhuǎn)鐵蛋白抗菌活性肽的制備及其抑菌活性的研究[D].長春：吉林大學(xué)，2011.

[5] 趙瑞利，韓俊友，韓文瑜，等.新牛蛙活性肽Catesbeianin-1a的抗菌抗腫瘤作用[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2013，33(09)：1407-1411.

[6] 孫芳.東北林蛙皮膚活性肽HPLC分離純化及體外抗病毒活性研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2007.

[7] 曹云飛.天蠶素A-蛙皮素雜合肽、抗菌肽DermaseptinS4、麗蠅抗病毒肽Alloferon1體外抗病毒活性研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

Protective Experiment of Two Kinds of Bioactive Peptides on Broilers Artificially InfectedE.coliand Newcastle Disease Virus

CHU Huan-huan ， YANG Hai-yan ， WANG Shu-bai ， LIU Bin

(College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China)

This study was designed to investigate the antibacterial and antiviral effects of two synthetic bioactive peptides on broilers.1 440 one-day old AA broilers were randomly divided into 8 groups with 6 replicates，in each group and 30 broilers in per replicate.The low，middle and high doses(10，20，40 μg/kg body weight)of two peptides were used to treat the broilers，and bacitracin zinc and blank group were used as control groups.The test lasted 42 days.The challenge protection test usingE.coliwas conducted with 10 day-old broilers，and the challenge protection test using Newcastle disease virus was conducted with 33 day-old broilers.The doses of 20，and 40 μg/kg body weight of peptideⅠand 40 μg/kg body weight of peptideⅡshowed good antibacterial activity toE.coli，and 40 μg/kg body weight of peptideⅠandⅡshowed good antiviral activity to Newcastle disease virus.We conclude that the two products of bioactive peptides had good protection to broilers infected withE.coliand Newcastle Disease Virus.

Bioactive peptides ；E.coli； Newcastle disease virus ； Challenge protection

WANG Shu-bai

2015-07-31

山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項(2014ZZCX071-05)；國家國際科技合作專項(2014DFR30980)；青島市公共領(lǐng)域科技支撐計劃項目(12-1-3-30-nsh)；山東省2014 年農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新課題(肉雞飼用活性肽制備關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用)

初歡歡(1991-)，女，碩士生，研究方向為預(yù)防獸醫(yī)學(xué)，E-mail：15275210115@126.com

王述柏，E-mail：wshubai@163.com

S852.61+2

A

0529-6005(2016)10-0020-02