李 玥 ， 王冠穎 ， 李欣然 ， 姜仁禮 ， 范曉靜 ， 劉 旭 ， 王晶璐 ， 高 利

(東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院 ， 黑龍江哈爾濱150030)

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馬骨關節(jié)炎模型關節(jié)液中COMP含量變化的研究

李 玥 ， 王冠穎 ， 李欣然 ， 姜仁禮 ， 范曉靜 ， 劉 旭 ， 王晶璐 ， 高 利

(東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院 ， 黑龍江哈爾濱150030)

為探索馬骨關節(jié)炎病變程度與關節(jié)液中軟骨代謝標志物軟骨寡聚基質蛋白(COMP)水平的關系，試驗選用13匹蒙古馬，隨機分為試驗組(n=8)和對照組(n=5)試驗組左側腕關節(jié)內注入2 mL兩性霉素B(25 mg/mL體重)，建立馬骨關節(jié)炎模型；對照組左側腕關節(jié)注射2 mL 生理鹽，水。每周采集關節(jié)液1次，用ELISA法檢測馬關節(jié)液中COMP的含量。結果顯示，試驗組關節(jié)液COMP濃度在注射兩性霉素B后第14天開始顯著升高(15.54 μg/L±1.46 μg/L)，與對照組(11.29 μg/L±0.73 μg/L)比較差異極顯著(P<0.01)；試驗組COMP濃度保持增高的趨勢直至第63天試驗結束；第21天試驗組馬匹開始出現(xiàn)不同程度跛行。試驗結果表明，關節(jié)液內COMP濃度升高比馬跛行出現(xiàn)得早，推測COMP可以作為馬骨關節(jié)炎(OA)早期診斷的生物標記物。

骨關節(jié)炎 ； 兩性霉素B ； COMP

骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一類以軟骨退化、軟骨下骨硬化和邊緣骨贅形成為主要病理變化的疾病。臨床表現(xiàn)為緩慢發(fā)展的關節(jié)疼痛、壓痛、僵硬，關節(jié)腫脹、活動受限以及關節(jié)畸形等。在表現(xiàn)出臨床癥狀時可以通過X線檢查及關節(jié)鏡對骨關節(jié)炎進行確診，但是通常在X 線檢查出現(xiàn)異常前就已出現(xiàn)軟骨損傷、關節(jié)狹窄、關節(jié)畸形等軟骨的病變[1]。探索血清、關節(jié)液或尿液中軟骨代謝物濃度與軟骨病變程度間關系，有助于判斷骨關節(jié)炎軟骨病變的程度、預后和治療效果，是骨關節(jié)炎早期診斷有效的輔助方法。軟骨寡聚基質蛋白(Cartilage oligomeric matrix protein，COMP)是軟骨非膠原蛋白重要成分，主要分布在軟骨、滑膜和肌腱[2]。目前國內關于馬骨關節(jié)炎生物標記物的研究未見相關報道。本研究采用夾心酶聯(lián)免疫吸附法(Sandwich-ELISA)測定關節(jié)液內COMP 水平，探索馬骨關節(jié)炎病變程度與關節(jié)液中軟骨代謝物COMP 水平的關系，為馬骨關節(jié)炎的早期診斷提供理論依據(jù)及參考標準。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 試驗動物為13 匹蒙古馬，平均體重420 kg(313～487 kg)，平均年齡7 歲(5～8 歲)，購自肇東市某養(yǎng)殖場。對每匹馬進行體況評分[3]，得分均在4～6分之間，無肢蹄病史且臨床檢查沒有肢蹄病。將13匹馬隨機分為對照組(n=5)和試驗組(n=8)。試驗前，將馬在試驗場地飼喂兩個星期以適應環(huán)境。

1.2 造模 造模前，對所有試驗馬匹進行體況檢查和跛行評估。跛行評估標準參照美國馬獸醫(yī)協(xié)會(AAEP)制定的跛行分級標準[4](見表1)。體況檢查合格，臨床檢查未見跛行后靜脈注射鹽酸地托咪定(10 μg/kg體重)和鹽酸美沙酮(0.1 mg/kg體重)，進行鎮(zhèn)靜。試驗組在馬左側腕關節(jié)內注入 2 mL 兩性霉素B(25 g/mL)，建立馬骨關節(jié)炎模型[5]，對照組在馬左側腕關節(jié)注射2ml生理鹽水。

1.3 樣本處理及數(shù)據(jù)處理 試驗組和對照組的馬每7天采集一次關節(jié)液，直至第63天。采樣前先進行體況檢查和跛行評估，而后靜脈注射鹽酸地托咪定(10 μg/kg體重)和鹽酸美沙酮(0.1 mg/kg體重)進行鎮(zhèn)靜。對腕關節(jié)皮膚消毒，用注射器抽取液 1 mL，采樣后將樣本13 000 r/min離心10 min取上清液，使用COMP酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測樣本中COMP濃度。

表1 馬的跛行分級

數(shù)據(jù)處理用Social Sciences 18.0(SPSS Inc.，USA)軟件，每個時間點采用單因素方差LSD(L)分析法分析。結果表示為MEAN±SD。

2 結果

2.1 臨床癥狀 試驗期間，對照組馬匹均未出現(xiàn)跛行；試驗組在腕關節(jié)注入兩性霉素B后第21天陸續(xù)出現(xiàn)跛行，而后逐漸加重，第63天出現(xiàn)4級跛行。

2.2 關節(jié)液COMP濃度變化 試驗組關節(jié)液COMP濃度在注射兩性霉素B后第14天開始顯著升高，與對照組比較差異極顯著(P<0.01)；試驗組COMP濃度保持增高的趨勢直至試驗結束(如圖1，表2所示)。

圖1 馬關節(jié)液COMP濃度變化

3 討論

關節(jié)軟骨是由豐富的細胞外基質(extra cellular matrix，ECM)和嵌于其中的少量軟骨細胞所組成。ECM包括膠原成分和非膠原成分。越來越多的證據(jù)表明，在細胞-基質和基質-基質的相互作用中，非膠原蛋白成分起著非常重要的作用。COMP是一種細胞外糖蛋白，屬于血小板反應素家族，是軟骨非膠原蛋白的主要成分[6]。在對轉基因小鼠進行的試驗中發(fā)現(xiàn)，COMP mRNA表達上調與COMP蛋白重新分布是OA早期階段關節(jié)軟骨的特征性改變[7]。Huebner等[8]研究發(fā)現(xiàn)，有OA傾向的荷蘭豬的關節(jié)液中COMP濃度變化比軟骨組織損傷造成的組織學改變要早兩個月左右。Saxne等[13]在研究中發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性骨關節(jié)炎及臨床有關節(jié)疼痛但無影像學改變的患者，其關節(jié)液中COMP水平較對照組(正常人組)高。目前，COMP的生物學意義仍然不是很清楚，但是可以肯定的是COMP通過與膠原纖維和軟骨基質的相互作用，參與到穩(wěn)定ECM的過程中，從而起到結構性功能作用[9]。因此，COMP與關節(jié)損傷之間的聯(lián)系已越來越受到重視。

表2 馬關節(jié)液COMP濃度(μg/L)變化

*：差異顯著(P<0.05)，**：差異極顯著(P<0.01)

在本試驗中，將兩性霉素B注入左側腕關節(jié)建立馬骨關節(jié)炎模型，相比手術方法建立的骨關節(jié)炎模型，用兩性霉素B建立骨關節(jié)炎模型具有快速、簡便、安全等優(yōu)點，同時又避免了手術創(chuàng)口對試驗的影響[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，關節(jié)內注射兩性霉素B建立驢OA模型引起的關節(jié)病變[5]與手術法建立鼠OA模型引起的關節(jié)病變相似[11]。在整個試驗過程中，對照組關節(jié)液內COMP濃度無明顯變化；試驗組關節(jié)液COMP濃度在注射兩性霉素B后第14天開始顯著增加(P<0.05)在整個試驗過程中關節(jié)液COMP濃度持續(xù)升高直，至第63天試驗結束，這一結果與人OA病變過程中COMP變化趨勢相符[12]；試驗組在腕關節(jié)注入兩性霉素B后第21天開始出現(xiàn)不同程度跛行。關節(jié)內注射兩性霉素B建立OA模型引起試驗馬匹跛行可能是由于兩性霉素B對軟骨基質和滑膜的毒性作用引起炎癥反應以及滑液分泌增多導致的。

本試驗結果證明，軟骨損傷發(fā)生在OA臨床癥狀出現(xiàn)之前，并且COMP分泌增加。這一試驗結果提示關節(jié)液中的COMP可以作為馬OA的潛在的生物標記物，為馬骨關節(jié)炎快速診斷提供試驗基礎。

[1] Park R D，Steyn P F，Wrigley R H.Imaging techniques in the diagnosis of equine joint disease[J].Joint Disease in the Horse.Philadelphia[J].WB Saunders，USA，1996，145-164.

[2] Clark A G，Jordan J M，Vilim V，etal.Serum cartilage oligomeric matrix protein reflects osteoarthritis presence and severity：the Johnston County Osteoarthritis Project[J].Arthritis & Rheumatism，1999，42(11)：2356-2364.

[3] Dugdale A H A，Grove-White D，Curtis G C，etal.Body condition scoring as a predictor of body fat in horses and ponies[J].The Veterinary Journal，2012，194(2)：173-178.

[4] Ross M W，Dyson S J.Diagnosis and Management of Lameness in the Horse[M].Elsevier Health Sciences，2010：66-67.

[5] Mokbel A N，El Tookhy O S，Shamaa A A，etal.Homing and reparative effect of intra-articular injection of autologus mesenchymal stem cells in osteoarthritic animal model[J].BMC musculoskeletal disorders，2011，12(1)：259.

[6] Neidhart M，Hauser N，Paulsson M，etal.Small fragments of cartilage oligomeric matrix protein in synovial fluid and serum as markers for cartilage degradation[J].Rheumatology，1997，36(11)：1151-1160.

[7] Salminen H，Per.l.M，Lorenzo P，etal.Up-regulation of cartilage oligomeric matrix protein at the onset of articular cartilage degeneration in a transgenic mouse model of osteoarthritis[J].Arthritis & Rheumatism，2000，43(8)：1742-1748.

[8] Huebner J L，Kraus V B.Assessment of the utility of biomarkers of osteoarthritis in the guinea pig[J].Osteoarthritis and cartilage，2006，14(9)：923-930.

[9] Dodge G R，Hawkins D，Boesler E，etal.Production of cartilage oligomeric matrix protein(COMP)by cultured human dermal and synovial fibroblasts[J].Osteoarthritis and Cartilage，1998，6(6)：435-440.

[10] Kotschwar J L，Coetzee J F，Anderson D E，etal.Analgesic efficacy of sodium salicylate in an amphotericin B-induced bovine synovitis-arthritis model[J].Journal of dairy science，2009，92(8)：3731-3743.

[11] Appleton C T G，Mcerlain D D，Pitelka V，etal.Forced mobilization accelerates pathogenesis：characterization of a preclinical surgical model of osteoarthritis[J].Arthritis research & therapy，2007，9(1)：R13.

[12] Neidhart M，Hauser N，Paulsson M，etal.Small fragments of cartilage oligomeric matrix protein in synovial fluid and serum as markers for cartilage degradation[J].Rheumatology，1997，36(11)：1151-1160.

[13] Saxne T，Glenn.s A，Kvien T K，etal.Release of cartilage macromolecules into the synovial fluid in patients with acute and prolonged phases of reactive arthritis[J].Arthritis & Rheumatism，1993，36(1)：20-25.

Changes in synovial fluid COMP from equine with experimentally-induced osteoarthritis

LI Yue ， WANG Guan-ying ， LI Xin-ran ， JIANG Ren-li ， FAN Xiao-jing ， LIU Xu ， WANG Jing-lu ， GAO Li

(College of Animal Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

To study the relationship of lesion extent of osteoarthritis to COMP level，the marker of cartilage metabolites，in synovial fluid，13 horses were divided into experimental(n=8)and control groups(n=5)，Acute osteoarthritis was induced in 8 horses by a sterile intra-articular injection of 2 mL Amphotericin-B(25 mg/mL)into the left carpal joint，and the control group was injected into the left carpal joint with 2ml Saline.Synovial fluid was collected once a week，and the concentrations of COMP were measured with ELISA kit.Compared with the control group(11.29μg/L±0.73μg/L)，the level of COMP in synovial fluid was significantly increased in the experimental group at the 14th day(15.54μg/L±1.46μg/L)，and lameness appeared at the 21th day.The results demonstrated that the level of COMP in synovial fluid increased earlier than the lameness appearance，and the COMP could be used as a biomarker for early diagnosis of equine osteoarthritis.

osteoarthritis ； Amphotericin-B ； COMP

GAO Li

2015-04-27

國家科技支撐計劃資助(2012BAD46B02-03)

李玥(1990-)，女，博士生，研究方向為馬肢蹄病的研究，E-mail：liyue_315207218@163.com

高利，E-mail：gaoli43450@163.com

S821.8+1；S857.16+5

A

0529-6005(2016)10-0012-03