潘瑜 孫建樞 金甌 蔡茜茜 陳引蕾

RP-HPLC法測定大鼠血漿中槲皮素含量

潘瑜 孫建樞 金甌 蔡茜茜 陳引蕾

目的 建立大鼠血漿中槲皮素的反相高效液相色譜（RP-HPLC）測定方法，研究菟絲子水提取液中槲皮素在正常大鼠血漿中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)過程。方法 給予大鼠灌胃菟絲子水提取液后，于不同時(shí)間點(diǎn)采血。血漿樣品經(jīng)酸化后乙酸乙酯萃取，RP-HPLC法進(jìn)行檢測，采用Hypersil ODS柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-0.5%磷酸水（60∶40），流速1.0ml/min，柱溫25℃，檢測波長為360nm。應(yīng)用藥物代謝動(dòng)力學(xué)軟件DAS 2.1.1擬合房室模型，并計(jì)算藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果 槲皮素在0.5～6μg/ml線性關(guān)系良好，最低檢測限為0.5μg/ml，高、中、低（含槲皮素5、2.5和1μg/ml）3種濃度的平均回收率均為90%～105%，日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜5%。槲皮素的血藥濃度-時(shí)間曲線符合二室模型，槲皮素的消除半衰期為4.589h，0～t時(shí)刻藥時(shí)AUC為13.498μg/（L·h），藥時(shí)總AUC為20.765μg/（L·h）。結(jié)論 建立了測定菟絲子水提取液中槲皮素在血漿的RP-HPLC測定方法，此方法簡便、靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，適用于測定槲皮素的血藥濃度及在大鼠體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。

RP-HPLC 菟絲子 槲皮素 藥物代謝動(dòng)力學(xué)

槲皮素為旋花科一年生寄生性蔓草菟絲子或大菟絲子成熟種子菟絲子中提取的一種黃酮類化合物。許多植物的花、葉、果實(shí)中都含槲皮素，多以甙的形式存在，如槲皮甙、蘆丁、金絲桃甙等，經(jīng)酸水解可得到槲皮素，具有較廣泛的藥理活性，如抗炎[1]、抗氧化[2]、抗菌[3]、抗病毒[4-5]、抗腫瘤[6]等。中醫(yī)方劑用藥的基本形式都是水煎劑，而目前報(bào)道尚無菟絲子水煎劑中槲皮素的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，建立了大鼠口服菟絲子水提取液血漿中槲皮素濃度的反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）測定方法，并利用此方法研究了菟絲子中的槲皮素在大鼠體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)過程。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)（美國Agilent公司）[配在線脫氣機(jī)（G1379A）、四元低壓泵（G1311A）、手動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱（G1316A）、紫外檢測器（G1314A）、儀器控制和數(shù)據(jù)采集分析使用ChemStation工作站）]；XW-80A型漩渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；FD-1C型冷凍干燥機(jī)（北京德天佑科技發(fā)展有限公司）；AllegraTM64R型號(hào)低溫高速離心機(jī)（美國BECKMAN有限公司）；D10-12型ANGEL氮?dú)獯祾邇x （杭州奧盛儀器有限公司）；Sartorius BS224S電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

1.1.2 藥品與試劑 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)100081-200907）；甲醇（美國Spectrum公司，色譜純）；乙酸乙酯、10mol/L鹽酸、磷酸均為分析純；超純水（Milli-Q系統(tǒng)）；槲皮素（由溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房提供）。定量藥材加6～8倍水煎煮40min后倒出藥液并收集藥渣，加適量水煎煮30min，然后收集藥液，棄去藥渣，合并濾液，并將濾液用4層紗布過濾，收集濾液冷凍干燥成粉后4℃保存，給藥時(shí)用超純水配制成濃度為0.15g/ml。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 5只雄性SD大鼠，6～7周齡，體重（250±20）g，溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 [動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（浙）2005-0019]提供。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 分析柱：Hypersil ODS柱（250mm× 4.6mm，5μm，大連依利特分析儀器有限公司）；保護(hù)柱：SB-C18（12.5mm×4.6mm，5μm，美國Agilent公司）；流動(dòng)相：甲醇-0.5%磷酸水（60∶40）；流速：1.0ml/min；柱溫：25℃；檢測波長：360nm；進(jìn)樣量：20μl。

1.2.2 給藥及采血 5只SD大鼠，禁食不禁水12h，按照1ml/100g的劑量，灌胃給予菟絲子水提取液。于灌胃后0、0.167、0.333、0.5、0.75、1、1.5、2、4、8和12h尾靜脈取血，每次約0.5ml，置于肝素化離心管中，13 000r/min離心10min，分離血漿，-20℃保存待測。

1.2.3 血漿樣品處理 取血漿室溫下凍融，準(zhǔn)確吸取甲醇1ml于10ml具塞試管中，加入10mol/L的鹽酸0.4ml，混勻后精密吸取待測大鼠血漿樣品200μl加入其中，密閉渦旋之后于90℃水浴5h，冷卻后精密加入2ml乙酸乙酯，渦旋（5 000r/min）10min，轉(zhuǎn)移上清液于另一刻度離心管中，氮?dú)獯祾邇x中吹干。用200μl甲醇復(fù)溶，過濾，進(jìn)樣20μl進(jìn)行RP-HPLC分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 將各時(shí)間點(diǎn)及其對應(yīng)的槲皮素濃度輸入藥理學(xué)計(jì)算軟件DAS 2.1.1，得到主要藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 色譜行為 紫外光譜掃描顯示，槲皮素在360nm處有一個(gè)明顯吸收峰，經(jīng)預(yù)試選定此波長為檢測波長。在1.2.1色譜條件下，空白血漿、含藥血漿和含標(biāo)準(zhǔn)品血漿的色譜如圖1所示，各組分色譜峰充分分離，不受內(nèi)源性雜質(zhì)峰干擾，槲皮素的保留時(shí)間為8.959min。

圖1 大鼠RP-HPLC色譜圖（a：空白血漿；b：含標(biāo)準(zhǔn)品血漿；c：含藥血漿）

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含槲皮素100μg的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。將上述配制好的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液用甲醇依次稀釋為濃度分別為60、40、20、10、7.5和5μg/ml的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。取大鼠空白血漿200μl，精密加入上述配制好的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，得到一系列不同濃度分別含槲皮素6、4、2、1、0.75和0.5μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿。按照方法中1.2.3進(jìn)行操作。以血漿中待測物槲皮素濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=21.198X-9.428 4，決定系數(shù)R2=0.998，見圖2。槲皮素在0.5～6μg/ml線性關(guān)系良好，最低檢測限（S/ N＞3）為0.5μg/ml。

2.3 回收率和精密度 取大鼠空白血漿200μl，精密加入已配制好的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋溶液，配成高、中、低濃度（含槲皮素5、2.5和1μg/ml），按照方法中1.2.3進(jìn)行操作，每一濃度進(jìn)樣3次，進(jìn)行樣本分析，計(jì)算求得其在大鼠血漿中的相對回收率和絕對回收率，在1d內(nèi)不同時(shí)間進(jìn)樣，測得3種濃度標(biāo)準(zhǔn)血漿的日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）及相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿在3d內(nèi)的日間RSD，結(jié)果見表1。

圖2 大鼠槲皮素血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 回收率和RSD試驗(yàn)結(jié)果（%）

2.4 穩(wěn)定性考察 制備高、中、低（含槲皮素5、2.5和1μg/ml）的質(zhì)量控制樣品，分別室溫放置12h，反復(fù)凍融2次，-20℃凍存1d，1周后測定。結(jié)果樣品在室溫放置12h、凍融前、凍融1次、凍融2次、冷凍1d和7d后，測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜5%，穩(wěn)定性良好。

2.5 槲皮素在大鼠體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究 大鼠灌胃菟絲子水提取液后，于不同時(shí)間點(diǎn)采集的血樣，按照方法中1.2.3進(jìn)行操作，得到的槲皮素在大鼠血漿中的血藥濃度-時(shí)間曲線見圖3。血藥濃度經(jīng)藥理學(xué)計(jì)算軟件DAS 2.1.1處理，自動(dòng)推算、模型、權(quán)重選擇，擬合的血藥濃度-時(shí)間曲線符合二室模型，有關(guān)藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2。

圖3 大鼠血漿中槲皮素的血藥濃度-時(shí)間曲線

3 討論

目前國內(nèi)尚未有針對菟絲子水提取液內(nèi)槲皮素進(jìn)行藥物代謝動(dòng)學(xué)的研究，本實(shí)驗(yàn)建立了RP-HPLC測定槲皮素在大鼠體內(nèi)血藥濃度的方法，并進(jìn)行了藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。本實(shí)驗(yàn)分別考察了直接蛋白沉淀法和有機(jī)溶劑萃取法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)直接蛋白沉淀法沉淀不完全，干擾較大，因此采用有機(jī)溶劑萃取法，并進(jìn)行不同濃度的鹽酸酸化，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)比對，結(jié)果表明10mol/L的鹽酸酸化后結(jié)合乙酸乙酯萃取的方法可排除干擾，獲得滿意提取效果。在流動(dòng)相的選擇上，本法分離黃酮成分時(shí)候有拖尾現(xiàn)象，在流動(dòng)相中加入少量磷酸后明顯改善。

表2 大鼠體內(nèi)槲皮素的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)

RP-HPLC法的藥物體內(nèi)分析通常因提取方法對含量準(zhǔn)確測定影響較大而采用內(nèi)標(biāo)法，朱紅崗等[7]曾用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行槲皮素灌胃后大鼠體內(nèi)槲皮素的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究，但內(nèi)標(biāo)法測定操作過程較繁瑣，成本高。本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)水煎法提取方式，血樣處理操作簡單易行，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，精密度較好，回收率高，故選擇外標(biāo)法進(jìn)行含量測定，進(jìn)而簡化了實(shí)驗(yàn)操作步驟，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。

藥物代謝動(dòng)力學(xué)處理結(jié)果表明，大鼠灌胃服用菟絲子水提取液后的藥物代謝動(dòng)力學(xué)過程用二室模型描述較為合理。灌服菟絲子水提取液后槲皮素的血藥濃度在1h達(dá)到峰值，槲皮素進(jìn)入大鼠體循環(huán)后迅速分布（α=1.926），發(fā)揮藥效迅速。血漿中槲皮素的消除速率常數(shù)β為0.151，血中的t1/2（α）=0.359h，t1/2（β）=4.589h，t1/2（β）＞t1/2（α），提示大鼠灌服菟絲子提取液后槲皮素在體內(nèi)消除也迅速，屬于吸收快、消除快的代謝過程，表明該化合物在體內(nèi)不容易蓄積，較安全。

經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，本方法簡便、快速、穩(wěn)定，重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度均較好，回收率、精密度均符合生物樣本中微量測定要求，可用于菟絲子水煎劑藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究，為含有槲皮素成分的中藥材及其復(fù)方制劑的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)。

[1] 周東生,梁志清,秦青,等.槲皮素對大鼠非酒精性脂肪性肝病的療效及其機(jī)制[J].中華肝病雜志,2013,21(2):134-137.

[2] Papiez M A，Krzysciak W.The antioxidant quercetin protects HL-60 cells with high myeloperoxidase activity against pro-oxidative and apoptotic effects of etoposide[J].Acta BiochimicaPolonica,2014,61(4):795-799.

[3] 秦曉蓉,張銘金,高緒娜,等.槲皮素抗菌活性的研究[J].化學(xué)與生物工程,2009,26(4):55-58.

[4] Fatima K,Mathew S,Suhail M,et al.Docking studies of Pakistani HCVNS3 helicase:a possible antiviral drug target[J].PLoS One, 2014,9(9):1-12.

[5] Guo L,Hu W R,Lian J H,et al.Anti-hyperlipidemic properties of CM108(a flavone derivative)in vitro and in vivo[J].European Journal of Pharmacology,2006,511(1-3):80-86.

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[7] 朱紅崗,凌明.大鼠體內(nèi)槲皮素的血藥濃度測定及其藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究[J].中國藥業(yè),2013,22(2):14-15.

（本文編輯：陳麗）

《浙江醫(yī)學(xué)》對圖表的要求

稿件中若有圖表，分別按其在正文中出現(xiàn)的先后次序連續(xù)編碼。每幅圖應(yīng)冠有圖題。說明性的文字應(yīng)置于圖下方注釋中，并在注釋中標(biāo)明圖表中使用的全部非公知公用的縮寫。線條圖應(yīng)墨繪在白紙上，高寬比例以5∶7為宜。以計(jì)算機(jī)制圖者應(yīng)提供激光打印圖樣。照片圖要求有良好的清晰度和對比度；圖中需標(biāo)注的符號(hào)（包括箭頭）請用另紙標(biāo)上，不要直接寫在照片上。每幅圖的背面應(yīng)貼上標(biāo)簽，注明圖號(hào)、方向及作者姓名。若刊用人像，應(yīng)征得本人的書面同意，或遮蓋其能被辨認(rèn)出系何人的部分。大體標(biāo)本照片在圖內(nèi)應(yīng)有尺度標(biāo)記。病理照片要求注明染色方法和放大倍數(shù)。圖表中如有引自他刊者，應(yīng)注明出處。電子版投稿中圖片建議采用JPG格式。表格建議采用三橫線表（頂線、表頭線、底線），如遇有合計(jì)和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理內(nèi)容（如t值、P值等），則在此行上面加一條分界橫線；表內(nèi)數(shù)據(jù)要求同一指標(biāo)有效位數(shù)一致，一般按標(biāo)準(zhǔn)差的1/3確定有效位數(shù)。

本刊編輯部

Determination of quercetin concentration in rat plasma by RP-HPLC

PAN Yu,SUN Jianshu,JIN Ou,et al.Department of Pharmacy,Wenzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese Medicine and Western Medicine,Wenzhou 325000，China

【 Abstract】 Objective To establish a RP-HPLC method for determination of quercetin in rat plasma and to investigate its pharmacokinetics after oral administration of dodder extract in rats. Methods After oral administration of dodder extract,rat blood samples were collected at different time points.Plasma samples were extracted by ethyl acetate,the analysis was performed on a Hypersil ODS column,the mobile phase was composed of methanol-0.5%phosphoric acid water(60:40)with the flow rate of 1.0ml/min and the column temperature of 25℃and UV wave length of 360nm.The data obtained were fitted with DAS 2.1.1 program and the pharmacokinetic parameters were calculated. Results Linear calibration curve obtained with the peak area of quercetin versus drug concentration was found to be linear between the ranges of 0.5～6μg/ml.The lowest detectable concentration was 0.5μg/ml.The average recoveries were 90%～105%.The inter-and intra-day RSDs were all less than 5%.The plasma concentration-time data fit to a two-compartment model.Elimination half lives of quercetin was 4.589 h.The area under the concentration-time curve(AUC0-t)was 13.498μg/(L·h),and the total area under the concentration-time curve (AUC0-∞)was 20.765μg/(L·h). Conclusion A validated reversed-phase HPLC method has been developed for determining quercetin in rat plasma.The assay method is proved to be simple,sensitive,precise and reliable enough for the pharmacokinetics study of quercetin in rats after oral administration.

RP-HPLC DodderQuercetin Pharmacokinetics

2016-04-12）

325000 溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科（潘瑜、金甌、蔡茜茜、陳引蕾）；溫州市第二人民醫(yī)院藥劑科（孫建樞）

潘瑜，E-mail：everydayisbetter@126.com