周丹+++崔曉嫻+++孫淑惠++蔣琳+++榮星喻+++汪慧菁+++趙超+++史虹莉

[摘要]目的 建立一種評(píng)價(jià)PBMC基因組DNA制備質(zhì)量的簡(jiǎn)便有效的方法。方法 本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，對(duì)樣本中的單拷貝基因36B4進(jìn)行擴(kuò)增，以考察擴(kuò)增效率與樣品質(zhì)量之間的關(guān)系。結(jié)果 經(jīng)DNase Ⅰ處理的基因組DNA中的36B4擴(kuò)增效率顯著低于未處理樣品。采用該方法，對(duì)18份健康志愿者的血液標(biāo)本基因組樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果顯示，其可以有效地評(píng)估血液標(biāo)本基因組制備質(zhì)量。結(jié)論 該方法可用于評(píng)價(jià)健康體檢標(biāo)本采集中的流程和操作對(duì)體檢的影響，提高涉及基因組DNA檢測(cè)體檢項(xiàng)目的準(zhǔn)確性。

[關(guān)鍵詞]單拷貝基因；基因組DNA；血液標(biāo)本；定量PCR

[中圖分類號(hào)] R-331 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）10（a）-0004-04

[Abstract]Objective To establish a simple and effective method for evaluating the preparation quality of the genomic DNA from PBMC.Methods In this study，real-time quantitative PCR technique was used to amplify the single copy gene 36B4 in a sample to investigate the relationship between the amplification efficiency and the quality of samples.Results The amplification efficiency of 36B4 in the genomic DNA treated by DNase Ⅰ was significantly lower than that of the untreated sample.By using this method，the blood samples from 18 healthy volunteers were detected and analyzed，the results showed that the preparation quality of blood sample genome was effectively evaluated.Conclusion The method can be used to evaluate the influence of the process and operation on the physical examination in the sample collection of health examination，and to improve the accuracy of the test item of the genomic DNA.

[Key words]Single-copy gene；Genomic DNA；Blood sample；Quantitative PCR

細(xì)胞基因組DNA含有重要的遺傳信息，通過(guò)檢測(cè)基因組的DNA序列、拷貝數(shù)等信息，可提供細(xì)胞遺傳和病理的信息，其被廣泛應(yīng)用于遺傳病、腫瘤和衰老等諸多領(lǐng)域。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的廣泛應(yīng)用，基因組DNA需求也越來(lái)越多[1]。制備好的基因組DNA相對(duì)較穩(wěn)定，可長(zhǎng)期存放用于相關(guān)研究。細(xì)胞采集、運(yùn)輸、保存到基因組制備操作過(guò)程等多個(gè)環(huán)節(jié)可影響DNA制備的質(zhì)量，從而可能對(duì)后續(xù)檢測(cè)，特別是定量檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。

評(píng)估基因組質(zhì)量可為后續(xù)檢測(cè)提供良好保障，常用的DNA瓊脂糖凝膠電泳方法可比較直觀地觀察DNA的降解情況，但敏感度較差。利用DNA在紫外波長(zhǎng)區(qū)的吸光度（OD），測(cè)定OD260與OD280比值，可以判定DNA的純度，利用OD260讀數(shù)，可以較精確地定量DNA含量，但是由OD260的讀數(shù)計(jì)算所得的基因組DNA含量包含了降解的DNA片段，并不能很好地反映基因組的質(zhì)量。

基因組中含有單拷貝的基因，其與基因組DNA含量有較高的一致性，在基因組降解時(shí)，單拷貝的基因也相應(yīng)降解。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)單拷貝基因擴(kuò)增效率，可以反映基因組降解情況，能夠被用來(lái)作為評(píng)估基因組DNA質(zhì)量的方法。本研究選取編碼酸性核糖體磷酸蛋白PO的36B4基因?yàn)槟康幕蜻M(jìn)行擴(kuò)增[2]，可有效評(píng)估制備的基因組DNA的質(zhì)量。

1材料與方法

1.1全血基因組DNA制備

采用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒（Qiagen公司，Lot No.148030300）抽提EDTA抗凝全血中外周血單核淋巴細(xì)胞（PBMC）的基因組DNA，方法見操作說(shuō)明。簡(jiǎn)要過(guò)程：20 μl蛋白酶K消化液加入溶解于200 μl PBS的PBMC細(xì)胞懸液，56℃恒溫水浴鍋中消化10 min，加入200 μl無(wú)水乙醇充分混勻后過(guò)柱，再分別用500 μl AW1和AW2洗滌1次，晾干后用100 μl超純水溶解DNA。

1.2 DNase Ⅰ處理DNA樣品

取Takara公司DNA酶Deoxyribonuclease Ⅰ（DNase Ⅰ，Lot No.CE5301A）0.7 U加入1 μg DNA樣品，25℃孵育，分別處理1、5、15 min，處理后經(jīng)Qiagen DNA純化試劑盒純化回收。

1.3分光光度儀定量DNA含量

采用Epoch微孔板分光光度計(jì)（BioTek公司）對(duì)基因組DNA進(jìn)行定量，并讀取OD260/OD280讀數(shù)，以評(píng)估DNA純度，并對(duì)DNA進(jìn)行定量。

1.4 DNA瓊脂糖凝膠電泳

采用1%瓊脂糖凝膠電泳，每孔上樣量200 ng，條件為100 V恒壓，45 min，經(jīng)復(fù)日科技凝膠成像系統(tǒng)成像。采用Takara公司DL5000（M5 kb）、DL15000（M15 kb）DNA marker作為分子量參照。

1.5實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

PCR體系的組成：150 nmol/L 6-ROX，0.2×Sybr Green Ⅰ，15 nmol/L Tris-HCl（pH=8.0），50 nmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2，dNTP各0.2 mmol/L，5 mmol/L DTT，1% DMSO以及1.25 U GoTaq Gold DNA 多聚酶（Promega公司）[3]?；蚪MDNA模板40 ng，引物濃度0.5 μmol/L，反應(yīng)體系體積20 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，58℃延伸1 min（35個(gè)循環(huán)）。標(biāo)準(zhǔn)曲線為一份抽提的基因組DNA按照梯度稀釋，最高濃度42 ng，依次按照1.68倍等比稀釋。

引物由生工生物工程上海有限公司合成，序列[4]如下：

36B4u，CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC；

36B4d，CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA。

2結(jié)果

2.1瓊脂糖凝膠電泳較難分辨降解條帶

經(jīng)DNA酶（DNase Ⅰ）處理的基因組DNA很快被降解成小片段。瓊脂糖凝膠電泳圖（圖1A）可以看到，在同樣上樣量條件下，基因組DNA主條帶含量下降，但并未見到明顯的拖尾現(xiàn)象。同樣，未被及時(shí)處理的抗凝血標(biāo)本中，也發(fā)現(xiàn)在同樣上樣量條件下，基因組DNA主條帶含量下降，而并未見到明顯的拖尾現(xiàn)象。原因在于DNA被降解成過(guò)小片段，加之凝膠成像分辨率有限，難以被該方法顯示出來(lái)（圖1B）。

M15 kb和M5 kb分別為分子量參照。A中為基因組DNA未經(jīng)DNase Ⅰ處理和分別處理1 min（D1）、5 min（D5）和15 min（D15）的電泳圖。B為同一份血清立刻抽提（G1）、4℃冷藏放置24 h（G2）和室溫放置24 h（G3）后抽提的基因組DNA

2.2利用實(shí)時(shí)定量PCR法擴(kuò)增標(biāo)本中的34B4基因可評(píng)估DNA質(zhì)量

借助標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)時(shí)定量PCR法可對(duì)樣本中的目的基因進(jìn)行定量，敏感度較高。利用該技術(shù)擴(kuò)增標(biāo)本中的34B4基因，可以反映出完整的基因組DNA的含量，用此數(shù)據(jù)能夠評(píng)估DNA質(zhì)量高低。對(duì)來(lái)自同一份健康志愿者的抗凝血在不同條件下抽提，或加DNase Ⅰ處理后，在同樣條件下進(jìn)行擴(kuò)增，繪制閾值循環(huán)數(shù)（Ct）-濃度（以2為底的對(duì)數(shù)值）曲線（圖2）。結(jié)果顯示，立刻抽提組（G1）的擴(kuò)增效率最高，經(jīng)DNase Ⅰ處理的基因組DNA的Ct值明顯升高（D1和D5），而D15組已不能有效擴(kuò)增出目的基因。相對(duì)于G1組，4℃冷藏放置24 h（G2）和室溫放置24 h（G3）后抽提組的Ct值增加，提示擴(kuò)增效率降低，DNA發(fā)生降解。這說(shuō)明該方法可靈敏地分辨出基因組DNA的降解情況，進(jìn)而評(píng)估DNA質(zhì)量。

G1、G2、G3、D1、D5和D15組PCR檢測(cè)起始上樣量均為40 ng，Ct值依次升高，D15組未能檢測(cè)出。橫坐標(biāo)為DNA含量單位納克（ng），以Log2數(shù)值顯示，縱坐標(biāo)為閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）

2.3在實(shí)際樣本中34B4基因擴(kuò)增效率反映基因組DNA制備質(zhì)量

選取18份健康志愿者抗凝血，抽提基因組DNA，利用定量PCR擴(kuò)增34B4基因，繪制閾值循環(huán)數(shù)（Ct）-濃度（以2為底的對(duì)數(shù)值）曲線（圖3）。結(jié)果顯示，13份標(biāo)本較好地符合標(biāo)準(zhǔn)曲線，5份產(chǎn)生偏離，提示不同的標(biāo)本基因組DNA質(zhì)量存在差異。該方法適用于臨床實(shí)際標(biāo)本的評(píng)估。

3討論

隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)在健康管理中的應(yīng)用，越來(lái)越多的基因組DNA標(biāo)本被用于研究[5-7]?；蚪M的質(zhì)量受多個(gè)環(huán)節(jié)影響，包括樣本采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存、后續(xù)制備等。對(duì)DNA質(zhì)量進(jìn)行科學(xué)靈敏的評(píng)估，能夠?qū)颖咎幚憝h(huán)節(jié)的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)影響樣本質(zhì)量的因素，促進(jìn)樣本處理方法的改進(jìn)，因此，開發(fā)簡(jiǎn)單有效的評(píng)估方法顯得尤為重要?；蚪MDNA以雙鏈纏繞組蛋白的形式形成染色體，存在于細(xì)胞核內(nèi)?；蚪MDNA制備過(guò)程中，需裂解細(xì)胞膜和細(xì)胞核膜，去除蛋白質(zhì)和RNA干擾[8]?；蚪MDNA分子量大，易受機(jī)械剪切影響，因此，樣本取放時(shí)應(yīng)該格外注意[9-10]。基因組DNA樣品也受多因素影響，包括儲(chǔ)運(yùn)條件、反復(fù)凍融、標(biāo)本污染等，所以，標(biāo)準(zhǔn)化的流程和全程的管理并配合簡(jiǎn)便易行的評(píng)估手段是保障后續(xù)實(shí)驗(yàn)成功的必要條件。

單拷貝基因含量在基因組中穩(wěn)定，與完整的基因組含量成正比。當(dāng)基因組DNA受損后，單拷貝基因也會(huì)隨機(jī)被降解，導(dǎo)致其擴(kuò)增效率低于完整基因組DNA。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，其擴(kuò)增的Ct值變大[11]。本研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)時(shí)間放置的抗凝血標(biāo)本擴(kuò)增效率降低，而瓊脂糖凝膠電泳圖中未見明顯降解條帶，原因是由于后者的分辨率不足。利用DNase Ⅰ處理基因組DNA，作為降解的陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳明顯可見DNA降解圖形，對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增效率明顯降低，并且與凝膠結(jié)果正相關(guān)，這說(shuō)明該方法是一種靈敏可靠的評(píng)估DNA降解的方法。目前常用的可供選擇的單拷貝基因有36B4、β-globin等[12-13]。本研究也發(fā)現(xiàn)利用不同單拷貝基因擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的評(píng)估效果類似。

實(shí)時(shí)定量PCR法用于目的基因的擴(kuò)增，具有線性范圍廣、重復(fù)性好、易于批量化等優(yōu)點(diǎn)，適合在臨床科室中推廣應(yīng)用。目前，很多醫(yī)院檢驗(yàn)科和中心實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)配備實(shí)時(shí)定量PCR儀，所以該方法的可移植性好。而其缺點(diǎn)同一般PCR（如易污染，過(guò)于靈敏）類似，但可以通過(guò)嚴(yán)格規(guī)范操作程序和采用復(fù)孔等方法避免[14]。

本方法可以作為評(píng)估基因組DNA質(zhì)量的簡(jiǎn)單可靠的方法，具有便捷可靠的特點(diǎn)，易于在健康管理和臨床實(shí)踐中推廣使用，特別是對(duì)基因組DNA質(zhì)量要求較高的研究，如基因拷貝數(shù)、端粒檢測(cè)等[15-16]。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Kibriya MG，Jasmine F，Roy S，et al.Measurement of telomere length：a new assay using QuantiGene chemistry on a Luminex platform[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2014， 23（12）：2667-2672.

[2]Akamine R，Yamamoto T，Watanabe M，et al.Usefulness of the 5′ region of the cDNA encoding acidic ribosomal phosphoprotein P0 conserved among rats，mice，and humans as a standard probe for gene expression analysis in different tissues and animal species[J].J Biochem Biophys Methods，2007，70（3）：481-486.

[3]Fang C，Zhao C，Liu X，et al.Protein alteration of HepG2.2.15 cells induced by iron overload[J].Proteomics，2012，12（9）：1378-1390.

[4]Cawthon RM.Telomere measurement by quantitative PCR[J].Nucleic Acids Res，2002，30（10）：e47.

[5]Kimura M，Stone RC，Hunt SC，et al.Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths[J].Nat Protoc，2010，5（9）：1596-1607.

[6]Lin Y，Damjanovic A，Metter EJ，et al.Age-associated telomere attrition of lymphocytes in vivo is co-ordinated with changes in telomerase activity，composition of lymphocyte subsets and health conditions[J].Clin Sci （Lond），2015，128（6）：367-377.

[7]Edson SM，McMahon TP.Extraction of DNA from skeletal remains[J].Methods Mol Biol，2016，1420：69-87.

[8]Dapprich J，F(xiàn)erriola D，Mackiewicz K，et al.The next generation of target capture technologies-large DNA fragment enrichment and sequencing determines regional genomic variation of high complexity[J].BMC Genomics，2016，17（1）：486.

[9]Melendez JH，Santaus TM，Brinsley G，et al.Microwave-accelerated method for ultra-rapid extraction of Neisseria gonorrhoeae DNA for downstream detection[J].Anal Biochem，2016，510：33-40.

[10]Vaudano E，Costantini A，Garcia-Moruno E.An event-specific method for the detection and quantification of ML01，a genetically modified Saccharomyces cerevisiae wine strain，using quantitative PCR[J].Int J Food Microbiol，2016，234：15-23.

[11]Al-Harti SA.Assessment of three blood genomic-DNA preparation methods for malaria molecular diagnosis[J].J Egypt Soc Parasitol，2016，46（1）：1-8.

[12]Zhang WX，F(xiàn)an J，Ma J，et al.Selection of suitable reference genes for quantitative real-time PCR normalization in three types of rat adipose tissue[J].Int J Mol Sci，2016，17（6）：E968.

[13]Cawthon RM.Telomere length measurement by a novel monochrome multiplex quantitative PCR method[J].Nucleic Acids Res，2009，37（3）：e21.

[14]Tian X，Zhao C，Ren J，et al.Gene expression profiles of a hepatitis B small surface antigen secreting cell line revealed up-regulation of lymphoid enhancer-binding factor 1[J].J Gen Virol，2007，88（Pt 11）：2966-2976.

[15]Chen G，Lustig A，Weng NP.T cell aging：a review of the transcriptional changes determined from genome-wide analysis[J].Front Immunol，2013，4：121.

[16]Meena JK，Cerutti A，Beichler C，et al.Telomerase abrogates aneuploidy-induced telomere replication stress，senescence and cell depletion[J].EMBO J，2015，34（10）：1371-1384.

（收稿日期：2016-07-19 本文編輯：祁海文）