楊向妮，姚志湘*，粟 暉，劉 柳

(1.廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006；2.廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545006)

?

斜投影和空間夾角判據(jù)結(jié)合紫外光譜分析滴眼液中苯扎氯銨

楊向妮1,2，姚志湘1,2*，粟 暉1,2，劉 柳1,2

(1.廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006；2.廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545006)

采用紫外光譜，將斜投影(OP)與空間夾角判據(jù)(SAC)相結(jié)合，通過(guò)十二烷基二甲基芐基氯化銨(1227)含量反映苯扎氯銨(BAC)含量的方式建立了一種快速檢測(cè)滴眼液中BAC的新方法。首先采用斜投影提取BAC混合物中1227的純信號(hào)，以提取的光譜信號(hào)與對(duì)應(yīng)濃度值進(jìn)行最小二乘擬合，建立標(biāo)準(zhǔn)光譜矩陣；再通過(guò)高效液相色譜-紫外光譜聯(lián)用獲取滴眼液本底光譜矩陣；最后根據(jù)空間夾角判據(jù)測(cè)定滴眼液樣品中1227的含量，并以此反映BAC的含量。結(jié)果顯示：在1～20 μg/mL濃度范圍內(nèi)，斜投影提取的1227純信號(hào)與對(duì)應(yīng)濃度呈良好線性關(guān)系(r>0.999 6)，方法的檢測(cè)結(jié)果與高效液相色譜法接近，相對(duì)誤差不大于2.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)不大于2.8%，回收率為99.6%～101.8%。該方法采用多波長(zhǎng)紫外光譜直接定量BAC，無(wú)需復(fù)雜的樣品前處理，定量時(shí)間短，分析效率高，穩(wěn)健性好，可推廣應(yīng)用于其他領(lǐng)域。

斜投影；空間夾角判據(jù)；高效液相色譜-紫外光譜聯(lián)用；苯扎氯銨；滴眼液

苯扎氯銨(BAC)是滴眼液中一種常用的防腐劑，使用添加過(guò)量BAC的滴眼液會(huì)對(duì)眼內(nèi)細(xì)胞造成傷害[1]，即使其濃度低于0.001%，經(jīng)常使用或使用超過(guò)30 min以上也會(huì)引起角膜上皮細(xì)胞功能障礙[2]。

目前BAC的檢測(cè)方法主要為高效液相色譜(HPLC)法[3-6]，HPLC能有效測(cè)定BAC含量，但其色譜峰易拖尾，柱效難以滿足需求，分析時(shí)間長(zhǎng)，溶劑消耗量大且需使用有毒溶劑；質(zhì)譜分析法[7]所用儀器昂貴、普及度小，且會(huì)破壞分析樣品。此外氣相色譜法[8]、紫外分光光度法[9]、薄層色譜法[10]、毛細(xì)管電泳法[11-12]、伏安法[13]等方法在分析要求較高的情況下均受到一定限制。近年來(lái)，化學(xué)計(jì)量學(xué)方法的快速發(fā)展給復(fù)雜樣品分析帶來(lái)新的生機(jī)，空間夾角判據(jù)(Space angle criterion,SAC)作為一種新的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，因具有所用樣品數(shù)量少、預(yù)處理簡(jiǎn)單、方法簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)得到較多應(yīng)用。粟暉等[14]采用該方法成功分析了化妝品中對(duì)羥基苯甲酸酯的含量。然而，BAC是由3種正烷基取代基(C12，C14，C16)二甲基芐基氯化銨同系物組成的混合物，該方法不適用于分析物為混合物，無(wú)法得到目標(biāo)組分純物質(zhì)信號(hào)的情況，并且直接用BAC定量常會(huì)因?qū)φ掌放c滴眼液產(chǎn)品中同系物組成不一致而對(duì)分析造成困擾。

因此，為克服此困擾、拓展空間夾角判據(jù)方法的普適性，本文提出用同系物十二烷基二甲基芐基氯化銨(1227)的含量反映BAC含量進(jìn)行樣品中BAC的含量檢測(cè)，以斜投影(Oblique projection,OP)與空間夾角判據(jù)相結(jié)合的方式來(lái)改善方法局限性，首先采用斜投影[15]將感興趣組分(1227)純物質(zhì)信號(hào)從BAC混合物中提取出，再結(jié)合空間夾角判據(jù)定量滴眼液中1227，并以此反映BAC的含量。據(jù)此建立了一種快速檢測(cè)滴眼液中BAC含量的新方法。

1 方法原理及分析步驟

復(fù)雜化學(xué)體系(多變量體系)可由多個(gè)互不平行向量組成的空間(Mb)確定描述，每個(gè)向量代表體系中一個(gè)獨(dú)立的化學(xué)組分。斜投影系將Mb看成由“感興趣組分”向量(S)與除S外的其他組分構(gòu)成的相鄰子空間(H)所組成。根據(jù)空間中的線性變換關(guān)系，空間中存在投影變換，S與H互為核關(guān)系，其核關(guān)系建立的模型通過(guò)系列正交投影來(lái)實(shí)現(xiàn)，可描述S、H的非正交關(guān)系。其投影變換表達(dá)式為式(1)，其中ES|H稱為斜投影算子，PH為沿著子空間H到子空間S的投影算子，I為與PH維數(shù)相同的單位矩陣。通過(guò)計(jì)算ES|H建立模型，可將“感興趣組分”向量S從復(fù)雜體系y中以數(shù)學(xué)的方式分離提取出，即S=ES|H*y。

ES|H=S(STPH┴S)-1STPH┴,PH┴=I-PH=I-H(HTH)-1HT

(1)

空間夾角判據(jù)也將每一種化學(xué)純組分看作一個(gè)向量，復(fù)雜化學(xué)體系即是由多個(gè)向量構(gòu)成的空間。向量與空間存在夾角，當(dāng)“感興趣組分”向量V在數(shù)據(jù)空間Ms中時(shí)，夾角為0，當(dāng)“感興趣組分”向量V不在數(shù)據(jù)空間Ms中時(shí)，V與Ms存在固定夾角。由此作為判據(jù)，通過(guò)逐步扣減分析樣中V向量分析復(fù)雜體系中“感興趣組分”的含量值。詳見(jiàn)文獻(xiàn)[16]。

具體實(shí)施步驟如圖1所示。

圖1 方法流程圖Fig.1 Operating steps of the method

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(LC-20AT，島津公司)，紫外-可見(jiàn)分光光譜儀(Maya2000Pro，Ocean Optics)，電子分析天平(AR124CN，奧豪斯儀器有限公司)。乙腈(HPLC級(jí))，冰乙酸、乙酸銨、三乙胺、甲醇(分析純)，苯扎氯銨(按C22H40ClN計(jì),每1 mL含苯扎氯銨12.02 mg，含n-C12H25取代基同系物65.49%，n-C14H29取代基同系物34.09%)(HPLC級(jí))，滴眼液7種(市售)。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件

高效液相色譜條件：色譜柱：ODS-SP92689 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；等度洗脫,流動(dòng)相為0.02 mol/L醋酸銨(每升中含三乙胺10 mL，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.0±0.5)-乙腈(10∶90)；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：262 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：室溫。

紫外光譜儀條件：波長(zhǎng)范圍196.93～400.36 nm，光譜間隔0.46 nm，石英比色皿光程為1.0 cm，以二次蒸餾水為參比樣品，積分時(shí)間設(shè)為8 ms。

2.3 BAC標(biāo)準(zhǔn)品、滴眼液樣品的制備及數(shù)據(jù)獲取

精確移取0.5 mL 12.02 mg/mL的BAC(C12取代基65.49%，C14取代基34.09%。按C12計(jì)，為7 871.898 μg/mL)標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，以二次蒸餾水定容，得濃度為39.359 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)母液，并以二次蒸餾水配制濃度為1～20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取其紫外光譜數(shù)據(jù)，記為y。

根據(jù)市售7種滴眼液樣品特點(diǎn)用二次水對(duì)樣品進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋，分別記為1﹟～7﹟樣品，另取與其中1種滴眼液同品牌不同批號(hào)的樣品同法稀釋，記為8#樣品，采集各樣品的紫外光譜，記為a。

將液相色譜儀與紫外光譜儀聯(lián)接，設(shè)置好儀器參數(shù)后獲取不同濃度BAC標(biāo)準(zhǔn)溶液、各滴眼液樣品的時(shí)間、波長(zhǎng)、光強(qiáng)度三維數(shù)據(jù)Mb、Ms。

以高效液相色譜法為對(duì)比方法，取不同濃度BAC標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行液相色譜分析，以1227的峰面積(A)為定量標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；8份滴眼液樣品不經(jīng)稀釋過(guò)濾后直接進(jìn)樣，取其與1227出峰時(shí)間一致時(shí)的峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量。

2.4 回收率與精密度實(shí)驗(yàn)

選取1#，2#，3#樣品進(jìn)行方法準(zhǔn)確度驗(yàn)證，取3份1#樣品加入濃度為6，8，10 μg/mL的BAC標(biāo)準(zhǔn)溶液，取2#和3#樣品各3份分別加入濃度為8，10，15 μg/mL的BAC標(biāo)準(zhǔn)溶液，采集其紫外光譜數(shù)據(jù)；選取1#和3#樣品分別重復(fù)采集其紫外光譜6次，計(jì)算方法的精密度。

圖2 1﹟樣品的三維譜圖Fig.2 Three-dimensional spectra of sample 1﹟

圖3 BAC標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖Fig.3 Chromatogram of BAC standard solution

3 結(jié)果與討論

3.1 BAC及滴眼液的本底矩陣建立

將獲得的BAC標(biāo)準(zhǔn)溶液、各滴眼液樣品的三維數(shù)據(jù)Mb、Ms導(dǎo)入Matlab計(jì)算平臺(tái)，并將光強(qiáng)度信號(hào)轉(zhuǎn)化為吸光度(如圖2)。于波長(zhǎng)262 nm處繪制BAC的色譜圖，找出1227的色譜出峰時(shí)間段，查閱相關(guān)文獻(xiàn)并經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證1227的出峰時(shí)間段在8.31～9.02 min(如圖3)?？鄢硕螖?shù)據(jù)后，將其余部分加和作為BAC的本底數(shù)據(jù)矩陣H。同法獲取滴眼液樣品的本底數(shù)據(jù)矩陣H1，其中8﹟樣品不參與建立本底。根據(jù)二階差分值序列的折點(diǎn)[17]判斷H、H1的主成分?jǐn)?shù)N、N1，分別應(yīng)用奇異值分解[USV]=svd[H]對(duì)光譜數(shù)據(jù)H、H1進(jìn)行重構(gòu)，選取U中前N、N1列加和作為降維后的本底光譜數(shù)據(jù)H′、H1′。

3.2 采用斜投影方法提取純1227光譜建立標(biāo)準(zhǔn)光譜矩陣

選取 BAC標(biāo)準(zhǔn)溶液中1227液相色譜出峰響應(yīng)值最高時(shí)間點(diǎn)8.38 min(如圖3)的全波長(zhǎng)光譜信號(hào)作為純1227數(shù)據(jù)矩陣S。將不同濃度BAC的紫外光譜y、BAC的本底數(shù)據(jù)矩陣H′及S代入編寫(xiě)的斜投影程序，計(jì)算得到純1227在不同濃度的全波長(zhǎng)光譜數(shù)據(jù)；將其與對(duì)應(yīng)的系列濃度進(jìn)行最小二乘擬合得到標(biāo)準(zhǔn)光譜矩陣v，矩陣v由擬合系數(shù)列與殘差列組成。其擬合結(jié)果顯示：在1～20 μg/mL濃度范圍內(nèi)，斜投影提取的1227純信號(hào)與對(duì)應(yīng)濃度呈良好的線性關(guān)系(r>0.999 6)，表明通過(guò)斜投影方法可以準(zhǔn)確提取混合物中單一物質(zhì)的光譜信號(hào)。

3.3 采用空間夾角判據(jù)計(jì)算滴眼液中1227含量

將任一線性范圍內(nèi)的濃度值x1代入公式y(tǒng)i=aix+bi，得到此濃度下純1227的光譜向量V；將滴眼液樣品光譜a、滴眼液樣品本底數(shù)據(jù)矩陣H′1及V代入編寫(xiě)的向量扣減程序，計(jì)算滴眼液樣品中1227濃度(1227濃度值反映BAC濃度值)，并以高效液相色譜法為對(duì)比方法計(jì)算滴眼液中1227的濃度,兩種方法的計(jì)算見(jiàn)表1。

表1 不同樣本中1227的濃度及相對(duì)誤差分析

Table 1 Concentration and relative error of benzalkonium chloride in different samples

SampleResultofobliqueprojectionwithspaceanglecriterionmethod(μg/mL)ResultofHPLC(μg/mL)Relativeerror(%)1﹟8548520232﹟00-?3﹟102910260294﹟00-5﹟00-6﹟339347237﹟2422430418﹟796795013

*no detected

經(jīng)比較，兩種方法的測(cè)定結(jié)果接近，其相對(duì)誤差不大于2.3%。其中2#,4#,5#樣品中不含苯扎氯銨，兩種方法的1227計(jì)算結(jié)果均為0，說(shuō)明方法能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)待測(cè)組分濃度。由8#樣品的比較結(jié)果可以看出，對(duì)于不參與建立本底的滴眼液樣品，方法計(jì)算結(jié)果同樣準(zhǔn)確。此外，本方法采用多波長(zhǎng)紫外光譜直接定量苯扎氯銨，操作簡(jiǎn)單，無(wú)需復(fù)雜的樣品前處理過(guò)程，經(jīng)建庫(kù)后無(wú)需花費(fèi)大量時(shí)間進(jìn)行液相色譜分析，分析時(shí)間大大縮短，分析效率得到較大提高;通過(guò)軟件方法實(shí)現(xiàn)光譜信號(hào)提取以及定量分析，降低了分析成本、儀器及試劑損耗；對(duì)于背景干擾嚴(yán)重的復(fù)雜體系，方法仍能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，抗干擾能力強(qiáng)，可辨識(shí)程度高，穩(wěn)健性好。

3.4 回收率與精密度

按照“3.3”所述步驟計(jì)算BAC在1#,2#,3#樣品中的添加量，并與實(shí)際添加量進(jìn)行比較，進(jìn)一步驗(yàn)證方法準(zhǔn)確度，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明：斜投影結(jié)合空間夾角判據(jù)的測(cè)定結(jié)果與實(shí)際添加量接近，方法可以準(zhǔn)確計(jì)算BAC的添加量，回收率為99.6%～101.8%。1#和3#樣品重復(fù)測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為2.8%和0.54%，表明方法具有較好的精密度。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Table 2 Experimental results of recovery

SampleConcentrationof1227(μg/mL)Added(μg/mL)Resultofobliqueprojectionwithspaceanglecriterionmethod(μg/mL)Recovery(%)1#8526，8，101463，1661，18481018，1011，9962#08，10，15799，1001，1504999，1001，10033#10268，10，151825，2025，2525999，999，999

4 結(jié) 論

方法以十二烷基二甲基芐基氯化銨(1227)代替苯扎氯銨進(jìn)行含量測(cè)定，不僅簡(jiǎn)化了計(jì)算，并可避免由于對(duì)照品與滴眼液產(chǎn)品中同系物組成不一致而使得分析結(jié)果不準(zhǔn)確甚至無(wú)法分析的窘境。采用斜投影與空間夾角判據(jù)相結(jié)合打破了空間夾角判據(jù)的局限，拓展了方法的普適性，即使得不到待測(cè)組分的純物質(zhì)也可對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。斜投影純信號(hào)分析方法可有效提取混合物中1227純光譜數(shù)據(jù)，提取的1227光譜與對(duì)應(yīng)濃度間呈良好的線性關(guān)系(r>0.999 6)。采用斜投影結(jié)合子空間-向量扣減的方法可以準(zhǔn)確測(cè)定滴眼液中1227的含量，與液相色譜測(cè)定結(jié)果比較，相對(duì)誤差不大于2.3%。本方法分析速度快，準(zhǔn)確可靠，操作簡(jiǎn)單，節(jié)約分析成本和分析時(shí)間，使用樣本數(shù)量少且樣品無(wú)需復(fù)雜的前處理，為滴眼液中防腐劑的含量測(cè)定提供了一種有效檢測(cè)手段，可推廣應(yīng)用于其他領(lǐng)域。

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Rapid Determination of Benzalkonium Chloride in Eye Drops with Ultraviolet Spectrum Based on Oblique Projection and Space Angle Criterion

YANG Xiang-ni1,2,YAO Zhi-xiang1,2*,SU Hui1,2,LIU Liu1,2

(1.Department of Biological and Chemical Engineering,Guangxi University of Science and Technology,Liuzhou 545006, China;2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources,Liuzhou 545006,China)

A rapid new method for the determination of benzalkonium chloride (BAC) in eye drops complex system was developed with ultraviolet spectrum based on oblique projection (OP) and space angle criterion (SAC),in which the content of BAC is based on content of dodecyl dimethyl benzyl ammonium chloride (1227) .By treatment with oblique projection,the pure spectrum of dodecyl dimethyl benzyl ammonium chloride was obtained.The standard spectral matrix was set up by the least squares fitting the spectrum with the corresponding concentration.And then the background spectral matrix was obtained by using high performance liquid chromatography-ultraviolet spectrum(HPLC-UV).After that the contents of 1227 in different kinds of eye drops were calculated by using space angle criterion,and the content of BAC was obtained.The results indicated that the method exhibited a good linearity (r>0.999 6) for BAC in the range of 1-20 μg/mL.The determination results of this method is close to that of HPLC method,and the relative error is not more than 2.3%.The recoveries were obtained between 99.6% and 101.8%,with RSDs not more than 2.8%.The content of BAC could be directly obtained with multiple wavelength ultraviolet spectrum without complicated sample preparation,and the method has the advantages of short quantitative time,high analysis efficiency,good robustness,and could provide a feasible scheme for the detection of analyte of interest in other complex system.Key words：oblique projection;space angle criterion;high performance liquid chromatography-ultraviolet spectrum(HPLC-UV);benzalkonium chloride;eye drops

2015-08-21；

2015-09-17

廣西科技計(jì)劃項(xiàng)目(桂科攻1355010-15)；柳州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015J030201)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.03.014

O657.3;S482.294

A

1004-4957(2016)03-0337-05

*通訊作者：姚志湘，博士，教授，研究方向：過(guò)程分析技術(shù)，Tel：0772-2686670，E-mail：zxyao@gxut.edu.cn