吳映璇,林 峰,姚仰勛，卲琳智，歐陽少倫

(1.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；2.廣東省動(dòng)植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510623)

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固相萃取/18O標(biāo)記高氯酸根稀釋高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水果中的高氯酸鹽

吳映璇1,2*,林 峰1,2,姚仰勛1,2，卲琳智1,2，歐陽少倫1,2

(1.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；2.廣東省動(dòng)植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510623)

建立了水果中高氯酸鹽的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析檢測方法。樣品采用1%乙酸提取，C18固相萃取柱凈化，Waters IC-Pak Anion HR(4.6 mm× 75 mm)色譜柱洗脫,流動(dòng)相為乙腈-100 mmol/L 乙酸銨溶液(體積比 60∶40),流速 0.7 mL/min；液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)-電噴霧負(fù)離子監(jiān)測模式檢測，采用18O標(biāo)記高氯酸根離子作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行基質(zhì)校正，內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明：高氯酸鹽在0.1～10.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為1.0 μg/kg；在1.0，2.0，10 μg/kg 3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率為92.5%～110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.4%～5.4%。實(shí)際樣品檢測表明該方法準(zhǔn)確可靠，適合于水果中高氯酸鹽的測定。

高氯酸鹽；18O標(biāo)記高氯酸根離子稀釋;固相萃??；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；水果

水果是日常生活中不可或缺的食物之一，不但營養(yǎng)豐富，更有降血壓、減緩衰老、明目、抗癌、降低膽固醇等保健作用。其富含的維生素是嬰幼兒成長發(fā)育不可缺少的營養(yǎng)元素，富含的葉酸有助于細(xì)胞繁殖與修復(fù)，能幫助胚胎神經(jīng)系統(tǒng)良好發(fā)育，預(yù)防孕婦貧血。由于水果對嬰幼兒和孕婦的健康具有潛在的影響,其安全問題顯得非常重要。高氯酸鹽是指含有高氯酸根離子([ClO4]-)的鹽類，其物理化學(xué)性質(zhì)極其穩(wěn)定，水溶性高，流動(dòng)性強(qiáng)，具有高度的擴(kuò)散性和持久性，可經(jīng)土壤、水等途徑被植物吸收富集，并通過食物鏈進(jìn)入人體[1]。高氯酸鹽進(jìn)入人體后主要通過與碘離子競爭性結(jié)合利用鈉/碘轉(zhuǎn)運(yùn)體(NIS)載運(yùn)膜蛋白，抑制甲狀腺對碘離子的吸收，導(dǎo)致甲狀腺功能紊亂，干擾T3和T4激素的合成與分泌，從而引發(fā)下丘腦-垂體-甲狀腺軸系列的補(bǔ)償機(jī)制，最終影響人體正常新陳代謝和生長發(fā)育，孕婦嚴(yán)重的甲狀腺功能不足會(huì)導(dǎo)致胎兒的呆小癥[2-3]。

目前，國外已有關(guān)于飲用水、水源、奶類、蔬菜以及營養(yǎng)補(bǔ)充劑等中高氯酸鹽含量的相關(guān)調(diào)查研究[4-5]，檢測含量為0.89～768 μg/kg；我國也有關(guān)于飲用水、牛奶和奶粉等中的高氯酸鹽污染情況研究[6-8]，檢測含量為0.05～464 μg/kg。尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)水果中高氯酸鹽含量的測定研究。因此，建立快速準(zhǔn)確測定水果中高氯酸鹽含量的分析方法，保障人群尤其是孕婦和嬰幼兒等敏感群體的健康，已迫在眉睫。

高氯酸鹽的測定方法主要有離子色譜法[5,9]、表面增強(qiáng)拉曼散射法[10-11]、離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[3-5,8-9,12-16]和高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[6-7]等。雖然離子色譜法可測定高氯酸根離子,但其檢測器缺乏選擇性,且易出現(xiàn)假陽性。表面增強(qiáng)拉曼散射法的重現(xiàn)性較差，定量分析困難。離子色譜-質(zhì)譜法能夠滿足檢測需求，但該設(shè)備的普及率不高，不利于方法的推廣和應(yīng)用；相比之下，高效液相色譜-質(zhì)譜法具有良好的靈敏度和選擇性，且設(shè)備普及更廣，利于推廣應(yīng)用。本課題組在已有研究基礎(chǔ)上采用液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜結(jié)合18O標(biāo)記高氯酸根稀釋、固相萃取等技術(shù)，建立了水果中高氯酸鹽的檢測方法。解決了由于電噴霧離子源造成的電離抑制現(xiàn)象，從而避免了對高氯酸鹽測定的影響并避免了結(jié)果偏差[17]。該方法準(zhǔn)確、快速、靈敏，能夠?yàn)樗懈呗人猁}污染狀況的監(jiān)測和產(chǎn)品質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑與儀器

高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，Inorganic Ventures(CAS No：7601-89-0，純度：100%，濃度1 000 mg/L)；18O標(biāo)記高氯酸根溶液(純度：90%，濃度100 μg/mL，Cambridge Isotope Laboratories);乙腈(HPLC級，美國Tedia公司)；乙酸(HPLC級，德國 Merck Darmstadt 公司)；乙酸銨(優(yōu)級純，印度 Fluka 公司)。蓮霧、蘋果、橙子和橘子在果蔬市場購買后，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

4000QTRAP液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國 AB Sciex公司)；Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)；旋渦振蕩器(德國IKA公司)；C18固相萃取柱(200 mg/3 mL，美國Waters公司),經(jīng)3 mL乙腈、3 mL 1%乙酸活化后備用；離心機(jī)(德國 Sigma 公司)。聚丙烯離心管：50 mL和1.5 mL。實(shí)驗(yàn)所用的試劑和標(biāo)準(zhǔn)溶液存儲(chǔ)容器均需先用30%硝酸溶液預(yù)處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(10 mg/L)：準(zhǔn)確吸取適量高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于100 mL容量瓶中，用水定容，于4 ℃保存。18O標(biāo)記高氯酸根儲(chǔ)備溶液(10 mg/L)：準(zhǔn)確吸取適量的18O標(biāo)記高氯酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于10 mL容量瓶中，用水定容，于4 ℃保存。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液和18O標(biāo)記高氯酸根使用溶液，用水配制成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度在0～10 μg/L范圍內(nèi)，18O標(biāo)記高氯酸根濃度均為2.0 ng/mL，當(dāng)天配制。

1.2.2 溶液的配制 1%乙酸溶液：移取 10.0 mL乙酸至 1 L容量瓶中，加水至刻度，搖勻備用；乙酸銨溶液(100 mmol/L)：稱取7.708 g乙酸銨，用水溶解定容至1 000 mL，混勻后備用。

1.2.3 樣品提取 稱取試樣5 g(精確至0.01 g)至50 mL離心管中，加100 μL18O標(biāo)記高氯酸根中間溶液(100 μg/L)和25.0 mL 1%乙酸溶液，渦旋振蕩2 min，10 000 r/min離心10 min，分離上清液于具塞離心管中，用1%乙酸溶液定容至25 mL刻度，搖勻，待凈化。

1.2.4 樣品凈化 吸取1.5 mL上清液過固相萃取C18柱，收集流出液，渦旋振蕩30 s，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，10 000 r/min離心10 min，吸取上清液，供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測定。

1.2.5 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜條件 色譜條件：IC-PakTMAnion HR柱(6 μm，4.6 mm×75 mm)；流動(dòng)相：乙腈-100 mmol/L乙酸銨溶液(60∶40)，等度洗脫。流速：0.70 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。質(zhì)譜條件：電噴霧負(fù)離子模式(ESI-)掃描；多反應(yīng)監(jiān)測方式檢測；氣簾氣壓力(CUR)：207 kPa；霧化氣壓力(GS1)：414 kPa；輔助加熱氣壓力(GS2)：483 kPa；碰撞氣壓力(CAD)：HIGH；電噴霧電壓(IS)：-1 000 V；離子源溫度(TEM)：550 ℃;監(jiān)測離子對、碰撞能量、去簇電壓、采集時(shí)間和保留時(shí)間見表1。

表1 高氯酸鹽的質(zhì)譜分析參數(shù)

Table 1 LC-MS/MS parameters for perchlorate analysis

CompoundRetentiontime(min)Parention(m/z)Daughterion(m/z)Declusteringpotential(V)Collisionenergy(V)Perchlorate46199，10183?，85-44，-65-36，-37Isotopelabelledperchlorate46110789-80-37

*quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑種類及體積的選擇

已有文獻(xiàn)中采用水[4,6,9]或1%乙酸溶液[5,7-8]為提取溶劑，鑒于高氯酸鹽的高溶解性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)分別采用1%乙酸溶液和水作為提取溶劑，以蓮霧為例進(jìn)行研究，比較高氯酸鹽在溶劑(水和1%乙酸)和樣品(蓮霧)中的提取效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1%乙酸溶液的提取效果優(yōu)于水。同時(shí)，由于1%乙酸溶液對目標(biāo)化合物的溶解度大，對雜質(zhì)的溶解度小，且與目標(biāo)化合物不起化學(xué)變化；經(jīng)濟(jì)、易得、使用安全。因此，本實(shí)驗(yàn)選用1%乙酸溶液作為提取溶劑。

進(jìn)一步考察了相同量的試樣加入不同體積(5，10，25，30 mL)1%乙酸溶液對提取效率的影響，發(fā)現(xiàn)均存在基質(zhì)抑制情況，但在添加同位素內(nèi)標(biāo)后，不同體積1%乙酸溶液的提取效率無明顯區(qū)別，回收率在98.6%～103%之間?？紤]到基質(zhì)效應(yīng)與后續(xù)凈化等因素，本實(shí)驗(yàn)選擇1%乙酸的體積為25 mL。

2.2 固相萃取柱的選擇

對比了常用的C18固相萃取柱、Oasis HLB固相萃取柱和石墨碳黑柱的凈化效果。結(jié)果表明，C18固相萃取柱的回收實(shí)驗(yàn)較理想，色素等雜質(zhì)保留在固相萃取柱上，而高氯酸鹽及18O標(biāo)記高氯酸根離子則沒有保留，隨流出液流出；Oasis HLB固相萃取柱和石墨碳黑柱對高氯酸鹽沒有保留，但對18O標(biāo)記高氯酸根離子有很強(qiáng)的吸附作用，難以將其洗脫，因此本實(shí)驗(yàn)選用C18固相萃取柱。

2.3 濾膜的吸附作用研究

在液相色譜分析中，為避免管路堵塞，根據(jù)篩分原理，通常使用濾膜對待測樣液進(jìn)行過濾。對實(shí)驗(yàn)室常用的兩種濾膜(尼龍66和聚醚砜濾膜)分別進(jìn)行測試。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩種濾膜對高氯酸鹽及其同位素內(nèi)標(biāo)均有不同程度的吸附，其中尼龍66濾膜對高氯酸鹽及其同位素內(nèi)標(biāo)的吸附達(dá)90.5%和95.8%；聚醚砜濾膜對高氯酸鹽及其同位素內(nèi)標(biāo)的吸附分別為62.4%和63.4%。本實(shí)驗(yàn)采用高速離心的方式將待測樣液中可能存在的大顆粒物質(zhì)去除，避免了使用濾膜后對待測樣液的吸附作用,以取得較好的回收率。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

用蠕動(dòng)泵以10 μL/min的流速分別連續(xù)注射0.5 mg/L的高氯酸鹽和18O標(biāo)記高氯酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液于ESI離子源中，由于高氯酸鹽中的氯離子在自然界存在同位素35Cl和37Cl，負(fù)離子檢測方式下對高氯酸鹽進(jìn)行一級質(zhì)譜分析(Q1掃描)，得到高氯酸鹽的準(zhǔn)分子離子峰(m/z99，101)和18O標(biāo)記高氯酸根的準(zhǔn)分子離子峰(m/z107，109)。對準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級質(zhì)譜分析(子離子掃描)，得到碎片離子信息,選擇響應(yīng)值高、基線噪音低的離子對m/z99/83,101/85作為監(jiān)測離子對(定性離子對)，選擇信號最強(qiáng)的m/z99/83作為定量離子對，選擇響應(yīng)值高的m/z107/89作為18O標(biāo)記高氯酸根的特征離子對。采用MRM模式采集數(shù)據(jù)，各離子對的優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.5 線性范圍、檢出限與定量下限

在優(yōu)化條件下，取一系列不同濃度的高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中18O標(biāo)記的高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為2 μg/L，以高氯酸鹽質(zhì)量濃度(X，μg/L)對高氯酸鹽與18O標(biāo)記高氯酸根定量離子的峰面積比值(Y)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，高氯酸鹽的濃度在0.1～10.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=0.454x+0.011 1,相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 9。按照3倍信噪比計(jì)算，高氯酸鹽在蓮霧和蘋果中的檢出限(LOD)分別為0.01 μg/kg和0.015 μg/kg；蓮霧和蘋果樣品中添加水平為1.0 μg/kg時(shí)，信噪比均大于10，表明其定量下限(LOQ)可達(dá)到1.0 μg/kg。當(dāng)樣品中高氯酸鹽的濃度超過線性范圍時(shí)，可適當(dāng)加大樣品的稀釋倍數(shù)。

2.6 加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

采用含有低含量高氯酸鹽的蓮霧樣品(0.10 μg/kg)和蘋果樣品(0.24 μg/kg)進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)水平為1.0，2.0，10.0 μg/kg，按照本方法進(jìn)行提取和凈化，每個(gè)加標(biāo)水平平行測定10次。結(jié)果表明，蓮霧樣品中高氯酸鹽的平均回收率為92.9%～110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.4%～5.2%；蘋果樣品的平均回收率為92.5%～108%,RSD為4.2%～5.4%。采用建立的方法檢測市售蓮霧、蘋果、橙子和橘子共10個(gè)水果樣品，其中橘子中高氯酸鹽含量為1.65 μg/kg，其他9個(gè)水果樣品均低于1.0 μg/kg。

3 結(jié) 論

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Determination of Perchlorate in Fruits by Solid Phase Extraction/18O Labeled Perchlorate Dilution High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WU Ying-xuan1,2*,LIN Feng1,2,YAO Yang-xun1,2,SHAO Lin-zhi1,2,OUYANG Shao-lun1,2

(1.Inspection and Quarantine Technology Center in Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou 510623,China;2.Key Laboratory of Animals and Plants and Food Import and Export of Technical Measures in Guangdong Province,Guangzhou 510623,China)

An analytical method based on high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS) was developed for the determination of perchlorate in fruits.Samples were extracted with 1% acetic acid.The extract was cleaned up on an C18solid-phase extraction(SPE) cartridge,and separated on a Waters IC-Pak Anion HR column(4.6 mm×75 mm) using acetonitrile -100 mmol/L ammonium acetate(60∶40) as mobile phase at a rate of 0.7 mL/min.The detection of perchlorate anion was performed by high performance liquid chromatography triple stage quadrupole mass spectrometry,equipped with electrospray ionization(ESI) in the negative ion mode.An18O-labelled perchlorate anion internal standard was used to correct matrix effects.Quantification analysis was conducted by the internal standard calibration.Good linearity was observed for perchlorate in the concentration range of 0.1- 10.0 μg/L.The limit of quantitation was 1.0 μg/kg.The recoveries of perchlorate in different samples at three spiked levels of 1.0,2.0,10.0 μg/kg were in the range of 92.5%-110%,with relative standard deviations of 1.4%-5.4%.The real sample analysis showed that this method was accurate and could be applied in the determination of perchlorate in fruits.

perchlorate；18O-labelled perchlorate dilution;solid-phase extraction;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)；fruits

2015-06-18；

2015-09-01

檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃項(xiàng)目(2009B535)；廣東檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015GDK10)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.03.018

O657.63;O623.422

A

1004-4957(2016)03-0355-04

*通訊作者：吳映璇，碩士，高級工程師，研究方向：食品安全檢測，Tel：020-38290337，E-mail: allanwyx@126.com