周 暉 高彥彬 李 麗 夏 晶 周焰實(shí) 張濤靜

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京，100078； 2 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京，100069； 3 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京，100191)

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糖脂平對(duì)胰島素抵抗大鼠骨骼肌IRS-1磷酸化及GLUT4分布的影響

周 暉1高彥彬2李 麗3夏 晶1周焰實(shí)1張濤靜1

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京，100078； 2 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京，100069； 3 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京，100191)

目的：觀察糖脂平對(duì)胰島素抵抗大鼠骨骼肌IRS-1磷酸化及GLUT4分布的影響。方法：將24只清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、中藥組和西藥組，采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)方法造模成功后，分別給予生理鹽水、糖脂平和二甲雙胍灌胃，給藥8周后，用Western Blot方法檢測(cè)大鼠骨骼肌酪氨酸磷酸化IRS-1和磷酸化Akt的含量，用免疫熒光法觀察大鼠骨骼肌GLUT4的分布情況。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)?zāi)c對(duì)照組比較，模型組大鼠骨骼肌酪氨酸磷酸化IRS-1和磷酸化Akt含量明顯降低，中藥組和西藥組大鼠的骨骼肌酪氨酸磷酸化IRS-1和磷酸化Akt含量與模型組比較均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，中藥組和西藥組的組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)照組GLUT4分布于骨骼肌肌膜表面，模型組GLUT4膜分布明顯減少，出現(xiàn)胞質(zhì)分布，中藥組和西藥組GLUT4的膜分布較模型組明顯改善。結(jié)論：糖脂平通過(guò)促進(jìn)IRS-1的酪氨酸磷酸化，激活其下游PI3K，增加磷酸化Akt含量，進(jìn)而使胞質(zhì)內(nèi)GLUT4膜轉(zhuǎn)位增加，從而改善胰島素抵抗。

胰島素抵抗；糖脂平；骨骼??；胰島素受體底物1；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4

胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)是多種代謝疾病發(fā)生發(fā)展的共同的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。IR的發(fā)生主要涉及肝臟、骨骼肌和脂肪組織，其中骨骼肌是葡萄糖代謝過(guò)程中最為重要的組織，所以有關(guān)骨骼肌IR的研究抗越來(lái)越受到重視，甚至有人認(rèn)為骨骼肌胰島素抵抗的發(fā)生早于其他組織，是外周胰島素抵抗的主要靶位[1]。糖脂平是我們?cè)谂R床上干預(yù)糖調(diào)節(jié)受損和早期糖尿病的經(jīng)驗(yàn)方藥，具有確切的臨床療效[2-3]。本研究通過(guò)觀察糖脂平對(duì)IR大鼠骨骼肌細(xì)胞受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中胰島素受體底物1(Insulin Receptor Sbstrate 1，IRS-1)的酪氨酸磷酸化及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(Glucose Transporter Type 4，GLUT4)在骨骼肌細(xì)胞膜分布的影響，從而探究糖脂平改善IR的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠24只，體重180～200 g，采購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 動(dòng)物飼料 基礎(chǔ)飼料購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司；高脂高鹽飼料是在基礎(chǔ)飼料的基礎(chǔ)上加豬油21%、膽固醇1.5%、食鹽2%制成，熱量比為碳水化合物占20%，脂肪占59%，蛋白質(zhì)占21%，購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑 糖脂平由丹參、澤瀉、鬼箭羽、黃連等組成，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院制劑中心加工，制成2 g生藥/ML的藥液；鹽酸二甲雙胍片購(gòu)自北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥房，中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)；裂解緩沖液；蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；1∶200 p-IRS-1抗體(兔來(lái)源)；1∶200 IRS-1抗體(兔來(lái)源)1∶200 p-Akt抗體(兔來(lái)源)；1∶200 Akt抗體(兔來(lái)源)；1∶200羊抗兔二抗；20%馬血清封閉液；GLUT4抗體(羊來(lái)源1∶100)；兔抗羊FITC標(biāo)記的熒光二抗(1∶400)；ECL發(fā)光液。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：DYY-6B型，中國(guó)北京六一儀器廠生產(chǎn)；圖像分析系統(tǒng)：550IW型，德國(guó)LEICA公司生產(chǎn)；紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)：Biophotometer型，德國(guó)EPPENDORF公司生產(chǎn)；激光共聚焦掃描顯微鏡：TCSSP2型，Leica公司生產(chǎn)；低溫臺(tái)式離心機(jī)：5417R型，德國(guó)EPPENDORF公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 建立模型 采用高脂高鹽飼料喂養(yǎng)方法造模[4]。用基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后的SD大鼠被隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、模型組、中藥組、西藥組，對(duì)照組繼續(xù)用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，另3組改用高脂高鹽飼料喂養(yǎng)，自由攝食、飲水，明暗周期12/12 h。第九周末空腹斷尾采血測(cè)血糖(FPG)和胰島素(FINS)，計(jì)算胰島素作用指數(shù)[IAI=-ln(FPG×FINS)]，以對(duì)照組IAI的均數(shù)減2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差為標(biāo)準(zhǔn)，低于該值的大鼠為造模成功。

2.2 分組處理 造模成功的大鼠從第10周開(kāi)始按不同組別給藥，西藥組給予鹽酸二甲雙胍200 mg/(kg·d)灌胃；中藥組給予糖脂平10 mL/(kg·d)[生藥20 g/(kg·d)]灌胃；模型組和對(duì)照組灌服等量的蒸餾水。各組大鼠喂養(yǎng)飼料和條件不變，連續(xù)給藥觀察8周。

2.3 取材與組織準(zhǔn)備 禁食12 h后處死，迅速取腓腸肌于-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 Western blot檢測(cè)酪氨酸磷酸化IRS-1的含量提取骨骼肌總蛋白，并用Bradford’s法測(cè)定所提蛋白質(zhì)濃度。使用Tris-HCl/SDS進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后采用濕法電轉(zhuǎn)印將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜在5%脫脂奶粉中室溫溫育2 h后，加入封閉液和1∶200 p-IRS-1抗體(一抗)，4 ℃孵育過(guò)夜。用1×PBST洗膜3次，10 min/次，然后加入1∶200二抗，37 ℃孵育2 h后用1×PBST洗膜3次，10 min/次。用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)條帶(p-IRS-1)。洗膜后重復(fù)上述操作，一抗改為非磷酸化IRS-1抗體，用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)條帶(總IRS-1)。各樣本光密度值經(jīng)非磷酸化IRS-1的光密度值校正后，以對(duì)照組為100%，計(jì)算其余各組的相對(duì)值。

2.5 Western blot檢測(cè)磷酸化Akt的含量 實(shí)驗(yàn)方法同2.4，一抗分別改為1∶200 p-Akt抗體和1∶200非磷酸化Akt抗體。各樣本光密度值經(jīng)非磷酸化Akt的光密度值校正后，以對(duì)照組為100%，計(jì)算其余各組的相對(duì)值。

2.6 觀察大鼠骨骼肌GLUT4膜轉(zhuǎn)位情況 制作7 μm骨骼肌組織冰凍切片后用冷丙酮固定，PBS洗滌后馬血清室溫封閉10 min，滴加抗GLUT4的抗體，4 ℃濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜。PBS沖洗后滴加FITC標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。PBS洗滌，甘油封片，立即在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察。

2.7 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)錄入SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠骨骼肌酪氨酸磷酸化IRS-1含量的變化情況 實(shí)驗(yàn)?zāi)?，與對(duì)照組比較，模型組大鼠骨骼肌酪氨酸磷酸化IRS-1含量明顯降低，中藥組和西藥組大鼠的骨骼肌酪氨酸磷酸化IRS-1含量與模型組比較均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，中西藥組的組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.2 各組大鼠骨骼肌磷酸化Akt含量的變化情況實(shí)驗(yàn)?zāi)?，與對(duì)照組比較，模型組大鼠骨骼肌磷酸化Akt含量顯著降低，中藥組和西藥組大鼠的骨骼肌磷酸化Akt含量與模型組比較均升高，升高幅度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，中西藥組的組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1各組大鼠骨骼肌酪氨酸磷酸化IRS-1含量的比較(±s)

表1各組大鼠骨骼肌酪氨酸磷酸化IRS-1含量的比較(±s)

注：▲與模型組比較，P<0.01。

組別例數(shù)灰度值(%)對(duì)照組6100模型組643.44±3.30中藥組677.28±6.10▲西藥組678.38±9.28▲

圖1

表2 各組大鼠骨骼肌磷酸化Akt含量的比較(±s)

表2 各組大鼠骨骼肌磷酸化Akt含量的比較(±s)

注：▲與模型組比較，P<0.01。

組別例數(shù)灰度值(%)對(duì)照組6100模型組661.01±10.12中藥組684.74±12.36▲西藥組682.25±8.78▲

圖2

3.3 各組大鼠骨骼肌GLUT4膜轉(zhuǎn)位的情況 結(jié)果見(jiàn)圖3，從圖中可以看出，對(duì)照組GLUT4分布于骨骼肌肌膜表面，模型組GLUT4膜分布明顯減少，且熒光強(qiáng)度減弱，出現(xiàn)胞質(zhì)分布，中藥組和西藥組GLUT4表現(xiàn)為膜分布增多，較模型組明顯改善。

圖3 各組大鼠骨骼肌GLUT4的膜分布情況

4 討論

IR是指骨骼肌、肝臟和脂肪等外周組織對(duì)胰島素作用的敏感性和反應(yīng)性下降，進(jìn)而出現(xiàn)正常胰島素水平產(chǎn)生低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種病理狀態(tài)。臨床研究證實(shí)，肥胖和2型糖尿病人群普遍存在胰島素抵抗，且貫穿于2型糖尿病的整個(gè)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中；胰島素抵抗與脂代謝紊亂、高血壓病、冠心病、腦卒中以及微量白蛋白尿有關(guān)，是導(dǎo)致這些疾病共同的病理生理學(xué)基礎(chǔ)[5]。胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制極為復(fù)雜，涉及骨骼肌、肝臟和脂肪等多個(gè)組織和器官，至今仍不能完全明了。由于骨骼肌是人體內(nèi)葡萄糖代謝最重要的組織，所以骨骼肌IR越來(lái)越引起專(zhuān)家學(xué)者的重視，甚至有人認(rèn)為骨骼肌胰島素抵抗的發(fā)生早于其他組織，是外周胰島素抵抗的主要靶位[1]。

骨骼肌細(xì)胞線粒體功能障礙導(dǎo)致的肌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積是引發(fā)胰島素受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路缺陷的重要因素[6]。線粒體是脂肪酸β-氧化的重要場(chǎng)所，當(dāng)骨骼肌線粒體生物合成減少或氧化磷酸化能力下降時(shí)，線粒體內(nèi)脂肪酸的氧化利用減少，導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)長(zhǎng)鏈脂酰基輔酶A及二?；视?DG)堆積，后者可激活新型PKC(nPKC)，nPKC能促進(jìn)IRS-1的絲氨酸位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，繼而干擾胰島素刺激下IRS-1的酪氨酸位點(diǎn)磷酸化，使其對(duì)下游磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的激活能力下降，胞質(zhì)內(nèi)GLUT4膜轉(zhuǎn)位減少，阻礙胰島素信號(hào)通路的正常轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生[7]。

通過(guò)參閱大量古今文獻(xiàn)，結(jié)合證候?qū)W研究結(jié)果，我們認(rèn)為，IR的發(fā)生是在先天稟賦異常的基礎(chǔ)上，加之后天飲食不節(jié)，嗜臥少動(dòng)，精神緊張，憂(yōu)思過(guò)度等多種因素共同作用的結(jié)果。飲食不節(jié)，過(guò)食肥甘，五谷精微停聚內(nèi)蘊(yùn)，化生濕濁，凝結(jié)為痰，阻遏氣機(jī)，氣機(jī)不暢，血運(yùn)隨之，而致氣血壅滯，終致血瘀痰阻。嗜臥少動(dòng)，“形不動(dòng)則精不流，精不流則氣郁”，氣郁血停，津液不化，凝聚為痰，痰濁血瘀互結(jié)為患。精神緊張，憂(yōu)思過(guò)度，氣機(jī)郁結(jié)不行，導(dǎo)致痰濁血瘀停滯互結(jié)。痰濁與血瘀，互為因果，相互影響，互為促進(jìn)，隨著疾病的發(fā)展，痰瘀互結(jié)壅遏氣機(jī)，影響到臟腑功能，使五臟六腑功能失常，氣血津液代謝失衡，從而變證百出[8]?；谶@一認(rèn)識(shí)并結(jié)合大量臨床資料，我們提出IR發(fā)生的核心病機(jī)是痰瘀互阻，中醫(yī)藥干預(yù)IR的基本治法應(yīng)該是化痰活血，臨床上我們將糖脂平用于治療痰瘀互阻型的早期糖尿病或糖尿病前期，療效顯著[9]。我們前期完成的國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃課題和國(guó)家中醫(yī)藥管理局課題證實(shí)，糖脂平可降低糖耐量低減患者發(fā)生糖尿病的危險(xiǎn)度，明顯增加代謝綜合征患者的胰島素敏感性，糾正糖脂代謝紊亂[2-3]，并且可以抑制炎性反應(yīng)因子的分泌，改善血管內(nèi)皮功能[10-11]。我們?cè)诟咧桂B(yǎng)的胰島素抵抗大鼠模型上發(fā)現(xiàn)：糖脂平通過(guò)增加脂肪組織PPAR-γ和脂聯(lián)素的基因表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)因子的分泌來(lái)改善胰島素敏感性、糾正糖脂代謝紊亂。

有氧運(yùn)動(dòng)能夠使骨骼肌有氧代謝酶類(lèi)濃度增加，提高糖脂代謝能力，增加脂肪供能的比例和肌細(xì)胞內(nèi)線粒體的體積與數(shù)量，改善胰島素抵抗。其作用機(jī)制包括增加骨骼肌IRS-1(Tyr612)磷酸化和GLUT4 mRNA表達(dá)[12]，增加骨骼肌中AMPK蛋白表達(dá)[13]，激活骨骼肌AMPK/SIRT1/PGC-1α信號(hào)傳導(dǎo)通路，使線粒體生物合成和氧化能力提高[14]。從以往中醫(yī)藥干預(yù)胰島素抵抗的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)看，多種中藥成分及復(fù)方可以通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而改善實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型肝臟的胰島素抵抗[15-17]，而關(guān)于骨骼肌胰島素抵抗及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的干預(yù)研究比較少。通過(guò)本研究的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，采用高鹽高脂飼料喂養(yǎng)的IR模型大鼠骨骼肌酪氨酸磷酸化IRS-1含量明顯降低，中藥干預(yù)后的酪氨酸磷酸化IRS-1含量較模型大鼠明顯升高，進(jìn)而使磷酸化Akt水平升高，從而使GLUT4在肌細(xì)胞膜表面分布增加，增加骨骼肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)利用，改善骨骼肌細(xì)胞的胰島素抵抗。

綜上所述，中藥糖脂平通過(guò)改善降低的骨骼肌酪氨酸磷酸化IRS-1水平，從而改善GLUT4肌細(xì)胞膜表面分布狀況，達(dá)到增加骨骼肌對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用，改善胰島素抵抗。

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(2015-07-30收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

The Effect of Tangzhiping on Phosphorylation of IRS-1 and Distribution of GLUT4 in Skeletal Muscle in Rats with Insulin Resistance

Zhou Hui1, Gao Yanbin2, Li Li3, Xia Jing1, Zhou Yanshi1，Zhang Taojing1

(1OrientalHospitalaffiliatedtoBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100078,China; 2CapitalMedicalUniversitySchoolofTraditionalChineseMedicine,Beijing100069,China; 3DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,PekingUniversityHealthScienceCenter,Beijing100191,China)

Objective: To investigate the effect of Tangzhiping on phosphorylation of IRS-1 and distribution of GLUT4 in skeletal muscle in rats with insulin resistance. Methods: SD rats of total 24 were randomly divided into four groups: Chinese medicine group, western medicine group, control group and model group. The rat model of insulin resistance (IR) was established by feeding with high-fat and high-salt diet. Rats in Chinese medicine and western medicine group were treated with Tangzhiping and metformin respectively for eight weeks. Eight weeks later, western blot test was used to detect tyrosine phosphorylation of IRS-1 and phosphorylation of Akt. Immunofluorescence assay was used to observe distribution of GLUT4 in skeletal muscle. Results: The level of tyrosine-phosphorylated IRS-1and phosphorylated Akt in rats of the model group was significantly lower than that in rats of control group. Treatment of IR rats with Tangzhiping or metformin elevated the level of tyrosine-phosphorylated IRS-1and phosphorylated Akt (P<0.01), when compared with the model group. There was no statistical differences between Chinese medicine group and western medicine group (P>0.05). GLUT4 was distributed predominantly on the membrane of skeletal muscle in rats of control group. GLUT4 distribution on membrane was significantly attenuated and GLUT4 distribution in plasma appeared in skeletal muscle of rats in the model group, which was improved by Chinese medicine and western medicine treatment. Conclusion: Tangzhiping can elevate insulin resistance by promoting the phosphorylation of IRS-1 and its downstream signal Akt and increasing the translocation of GLUT4 from cytoplasm to membrane.

Insulin resistance; Tangzhiping; Skeletal muscle; Insulin receptor substrate 1; Glucose transporter 4

北京中醫(yī)藥大學(xué)自主選題項(xiàng)目(編號(hào)：2009JYBZZ-JS085)——“胰島素抵抗大鼠骨骼肌線粒體損傷機(jī)制及中藥改善作用研究”

周暉(1975.10—)，男，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，研究方向：糖尿病及其血管并發(fā)癥的中醫(yī)藥防治研究，E-mail：emailzhouhui@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.032