李朝霞 歐陽俊搖 王雅麗 趙 暉 沈 素 王麗麗 李 任

(1 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點實驗室,北京，100069; 2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院,北京，100050)

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實驗研究

蛭丹化瘀組方對內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠CGRP、ET-1的影響

李朝霞1歐陽俊搖1王雅麗1趙 暉1沈 素2王麗麗2李 任2

(1 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點實驗室,北京，100069; 2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院,北京，100050)

目的:探討蛭丹化瘀組方對內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠血漿降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、內(nèi)皮素-1(ET-1)、腫瘤壞死因子(TNF-α)的影響。方法:SD大鼠84只,雌雄各半,隨機分為對照組、模型組、蛭丹化瘀組方3個劑量(33、16.5、8.25 g/kg)。大鼠氣管內(nèi)滴注LPS復(fù)制急性肺損傷大鼠模型,稱重法檢測大鼠肺含水量,放免法檢測各組大鼠血漿ET、CGRP、TNF-α的變化。結(jié)果:模型組大鼠肺含水量較正常組明顯升高(P<0.01),蛭丹化瘀組方(33 g/kg、16.5 g/kg)(P<0.01、P<0.05)以及陽性藥地塞米松(P<0.01)可降低內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠的肺含水量;與正常組比較,模型組大鼠血漿中內(nèi)皮素(ET)、降鈣素基因肽(CGRP)明顯增高(P<0.01);蛭丹化瘀組方(16.5 g/kg、8.25 g/kg)和陽性藥地塞米松可明顯降低大鼠血漿ET含量,差異較模型組明顯(P<0.01);蛭丹化瘀組方33 g/kg可明顯增加血漿CGRP含量;與正常組比較,模型組大鼠血漿腫瘤壞死因子(TNF-α)明顯增高(P<0.01);陽性藥地塞米松及蛭丹化瘀組方(33 g/kg、16.5 g/kg、8.25 g/kg)均可明顯降低大鼠血漿TNF-α含量(P<0.01)。結(jié)論:蛭丹化瘀組方方通過升高內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠CGRP的含量,降低ET-1及TNF-α含量發(fā)揮對肺損傷大鼠的保護(hù)作用。

蛭丹化瘀組方;肺損傷;降鈣素基因相關(guān)肽;內(nèi)皮素-1

急性肺損傷(Acute Lung Injury,ALI)是嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克等打擊后,出現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,造成彌散性肺間質(zhì)及肺泡水腫而導(dǎo)致的急性低氧性呼吸功能不全癥[1]。ALI時各種肺內(nèi)外因素可引起多種炎性反應(yīng)遞質(zhì)的釋放,引發(fā)肺內(nèi)過度、失控的炎性反應(yīng),形成惡性循環(huán),加重機體損傷[2]。蛭丹化瘀組方由制水蛭、牡丹皮、當(dāng)歸、赤芍、雞血藤、黃芪、川芎組成,具有益氣活血的功效,臨床上多用于治療治療小兒支原體感染及病毒性肺炎[3-4]。本實驗采用內(nèi)毒素誘導(dǎo)ALI的方法,觀察蛭丹化瘀組方對內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠肺含水量的影響,并通過檢測血漿降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、內(nèi)皮素-1(ET-1)腫瘤壞死因子(TNF-α)的變化,研究蛭丹化瘀組方方對ALI大鼠的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物SD大鼠,SPF級,雌雄各半,體質(zhì)重80～100 g,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,許可證號:SCXK(京)2012-0001。

1.2 藥品與試劑 蛭丹化瘀組方由黃芪、當(dāng)歸、赤芍、川芎、雞血藤、水蛭、牡丹皮組成,經(jīng)水提醇沉工藝制成組方顆粒劑的流浸膏，生藥含量為4.85 g/mL,由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥藥劑教研室制備。醋酸地塞米松片:天津力生制藥股份有限公司產(chǎn)品,批號:140511。脂多糖,由Sigma公司提供,貨號L2880。大鼠ET-1、CGRP、TNF-α放免檢測試劑盒由北京華英生物技術(shù)研究所提供。

1.3 方法

1.3.1 模型的制備、分組及給藥 參考文獻(xiàn)方法制備ALI大鼠模型[5]SD大鼠隨機分成6組,即對照組、模型組、蛭丹化瘀組方33 g/kg、16.5 g/kg、8.25 g/kg組、陽性對照組(地塞米松0.5 mg/kg)。除對照組、模型組灌胃給予等量生理鹽水外,其他各組均灌胃給與相應(yīng)藥物,1次/d,連續(xù)給藥4 d。第5次給藥后1 h,大鼠腹腔注射10%水合氯醛(35 mg/kg)麻醉,仰臥位固定,沿頸部正中線切開皮膚,暴露氣管,脂多糖(LPS)按7.5 mg/kg劑量,0.2 mL/100 g給藥容積于氣管內(nèi)緩慢滴入,縫合創(chuàng)口。造模19 h后,大鼠麻醉,取材。

1.3.2 血漿TNF-α、ET、CGRP檢測腹主動脈取血,制備血漿-80 ℃凍存?zhèn)溆?放免法檢測血漿TNF-α、ET、CGRP,由北京華英生物技術(shù)研究所檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS 10.0進(jìn)行單因素方差分析,LSD檢驗比較2組間差異。

2 結(jié)果

2.1 蛭丹化瘀組方對內(nèi)毒素致肺損傷大鼠肺含水量的影響 結(jié)果見表1。與正常組比較,模型組大鼠肺含水量明顯升高(P<0.01);陽性藥地塞米松及蛭丹化瘀組方(33、16.5 g/kg)組可明顯降低大鼠肺含水量。

表1 蛭丹化瘀組方對內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠肺指數(shù)及肺含水量的影響(±s)

表1 蛭丹化瘀組方對內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠肺指數(shù)及肺含水量的影響(±s)

注:與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

組別劑量(g/kg)動物數(shù)肺含水量(%)對照組-1480.18±0.90**模型組-1480.99±0.78蛭丹化瘀組方組331479.65±0.55**蛭丹化瘀組方組16.51480.31±0.70*蛭丹化瘀組方組8.251480.62±0.59地塞米松組0.00051479.23±1.45**

2.2 蛭丹化瘀組方對內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠血漿內(nèi)皮素(ET)、降鈣素基因肽(CGRP)的影響 與正常組比較,模型組大鼠內(nèi)皮素(ET)、降鈣素基因肽(CGRP)明顯增高(P<0.01);蛭丹化瘀組方(16.5 g/kg、8.25 g/kg)和陽性藥地塞米松可明顯降低大鼠血漿ET含量,差異較模型組明顯(P<0.05);蛭丹化瘀組方33 g/kg可明顯增加血漿CGRP含量。

表2 蛭丹化瘀組方對內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠血漿ET、CGRP的影響(±s)

表2 蛭丹化瘀組方對內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠血漿ET、CGRP的影響(±s)

注:與模型組相比,*P<0.05，**P<0.01。

組別只數(shù)劑量(g/kg)ET(pg/mL)CGRP(pg/mL)正常9-60.38±6.95**75.92±16.24**模型9-110.75±20.42103.70±16.35地塞米松組120.000578.14±29.30**97.90±18.73蛭丹化瘀組方組1133110.87±23.86130.62±13.82**蛭丹化瘀組方組1116.579.84±42.05**106.96±18.55蛭丹化瘀組方組128.2564.98±14.19**91.17±24.34

2.3 蛭丹化瘀組方對內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠血漿腫瘤壞死因子(TNF-α)的影響 與正常組比較,模型組大鼠血漿腫瘤壞死因子(TNF-α)明顯增高(P<0.01);陽性藥地塞米松及蛭丹化瘀組方(33 g/kg、16.5 g/kg、8.25 g/kg)均可降低大鼠血漿TNF-α含量,與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 蛭丹化瘀組方對內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠血漿TNF-α的影響(±s)

表3 蛭丹化瘀組方對內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠血漿TNF-α的影響(±s)

注:與模型組相比,*P<0.05，**P<0.01。

組別只數(shù)劑量(g/kg)TNF-α(pg/mL)正常9-60.81±6.60**模型9-89.67±8.13地塞米松組120.000566.41±9.65**蛭丹化瘀組方組113372.74±8.09**蛭丹化瘀組方組1116.565.58±9.13**蛭丹化瘀組方組128.2562.41±7.35**

3 討論

ALl以進(jìn)行性呼吸困難和難以糾正的低氧血癥為主要表現(xiàn)的肺部繼發(fā)性損傷[6],嚴(yán)重的ALI在臨床上也被稱為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。由于肺微血管通透性增高,肺內(nèi)液體滲出與吸收動態(tài)平衡遭到破壞,大量富含蛋白質(zhì)的液體滲入組織間隙,因此肺水腫是其主要的病理表現(xiàn)[7]。本研究結(jié)果表明,LPS致ALI大鼠肺含水量明顯增高,經(jīng)蛭丹化瘀組方33、16.5 g/kg或地塞米松治療后,大鼠肺含水量明顯降低,提示蛭丹化瘀組方可有效抑制肺損傷時肺微血管通透性增加,改善肺水腫。

內(nèi)皮素(ET)是目前已知的最強的血管收縮因子,其增高可引起肺血管、支氣管痙攣和毛細(xì)血管通透性增加,并通過刺激肺部花生四烯酸合成與釋放,誘導(dǎo)氧自由基生成,激活致炎因子的表達(dá),損傷肺組織[8]。研究表明,ETR拮抗劑、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶抑制劑等可下調(diào)ET-1的合成和分泌,通過抑制其促炎、縮血管、抑制肺泡液體清除能力等環(huán)節(jié),減輕肺組織炎性損傷,改善肺血流動力學(xué)、呼吸力學(xué)指標(biāo),減輕肺水腫,改善通氣換氣功能[9]。降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是一種血管活性多肽,是迄今為止在人和哺乳動物內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種最強的擴血管物質(zhì),其釋放受內(nèi)毒素、前列腺素、緩激肽等炎性因子和遞質(zhì)的調(diào)節(jié),具有擴張血管、降低動脈血壓的作用。在病理狀態(tài)下CGRP的分秘和釋放能夠緩解缺氧所致的肺血管收縮。本實驗研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠血漿CGRP、ET-1含量較正常組明顯升高,蛭丹化瘀組方(16.5 g/kg、8.25 g/kg)以及陽性藥地塞米松可降低ALI大鼠血漿ET-1,蛭丹化瘀組方33 g/kg還可明顯增高ALI大鼠血漿CGRP,表明蛭丹化瘀組方既可抑制ET-1生成及釋放,又可促進(jìn)血漿中CGRP的合成,從而減輕肺血管、支氣管痙攣,降低毛細(xì)血管通透性,減經(jīng)肺損傷。

目前認(rèn)為,炎性反應(yīng)是ALI/ARDS發(fā)生的主要機制[7],研究發(fā)現(xiàn)[11]注射LPS 6 h后,動物血清TNF-α含量就明顯升高。TNF-α作為啟動炎性反應(yīng)瀑布級聯(lián)反應(yīng)的促炎遞質(zhì),能誘導(dǎo)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞活化及中性粒細(xì)胞脫顆粒釋放氧自由基等遞質(zhì),引起白細(xì)胞遷移,損害肺泡表面活性物質(zhì)系統(tǒng)[10]。本次研究結(jié)果顯示,蛭丹化瘀組方在減輕肺含水量的同時,可明顯降低ALI大鼠血漿TNF-α含量。

綜上,本次實驗發(fā)現(xiàn)蛭丹化瘀組方對LPS致ALI具有一定的改善作用,其初步的作用機制可能與其促進(jìn)CGRP的合成與釋放,抑制ET-1的生成,減輕肺水腫,并通過抑制TNF-α的分泌,減輕致炎因子介導(dǎo)的炎性損傷。從而起到防治模型大鼠ALI的作用。

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(2016-02-29收稿 責(zé)任編輯：王明)

Effects of Zhi Dan Hua Yu prescription on CGRP and ET-1 of lung injury rats induced by LPS

Li Zhaoxia1，Ouyang Junyao1，Wang Yali1，Zhao Hui1，Shen Su2，Wang Lili2，Li Ren2

(1SchooloftraditionalChinesemedicine，BeijingKeyLabofTCMCollateralDiseaseTheoryResearch，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069,China; 2BeijingFriendshipHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050,China)

Objective:To observe the effect of Zhi Dan Hua Yu prescriptionon CGRP、ET-1 and TNF-αof lung injury rats induced byendotoxin.Methods:A total of 84 SD rats withhalf males and half females were divided into control group,model group,Zhi Dan Hua Yu prescription group(33 g/kg,16.5 g/kg,8.25 g/kg)and dexamethasone group by random,detecting the changes ofwatercontent inlung injury rats’ lung；utilizing radioimmunoassay to detecting changes of ET and CGRP in rat plasma.Results:Compared to control group，lung water content in model group rats were significantly increased(P<0.01),Zhi Dan Hua Yu prescription(33 g/kg,16.5 g/kg)and dexamethasone obviously reduced water content in lunginjury rats.The endothelin(ET)and calcitonin gene peptide(CGRP)in rat plasmaof model group were significantly increased(P<0.01)compared to that of control group;dexamethasone reduced ET content(P<0.01)and Zhi Dan Hua Yu prescription(16.5 g/kg,8.25 g/kg)reduced ET contant apparently(P<0.01); CGRP contant in rat plasma of Zhi Dan Hua Yuprescription(33 g/kg)were increased significantly(P<0.01); The content of tumor necrosis factor-α(TNF-α)was increased apparently(P<0.01)in comparison with that of control group; dexamethasone and Zhi Dan Hua Yu prescription(33 g/kg,16.5 g/kg,8.25 g/kg)reduced TNF-αin rat plasma obviously(P<0.01).Conclusion:Zhi Dan Hua Yu prescriptionprotect endotoxin-induced lung injury rats by increase CGRP content and reduce ET-1 and TNF-αcontent in rat plasma.

Zhi Dan Hua Yu prescription;Lung injury;CGRP;ET-1

北京市科學(xué)技術(shù)委員會“十病十藥”研發(fā)項目(編號:Z141100002214019)——“蛭丹化瘀組方用于治療小兒病毒性肺炎的成藥性研究”

沈素(1961.11—),女,本科,主任藥師,主任,研究方向:醫(yī)院藥學(xué),E-mail:shensu11022000@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.031