郭夢月 任 莉 陳新連 龐曉慧

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京，100193)

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基于ITS2條形碼鑒別半枝蓮及其混偽品

郭夢月 任 莉 陳新連 龐曉慧

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京，100193)

目的：運(yùn)用Internal Transcribed Spacer 2(ITS2)條形碼對半枝蓮及其混偽品進(jìn)行鑒別研究，為該藥材的安全用藥提供依據(jù)。方法：提取樣品基因組DNA，對ITS2序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和雙向測序，所得序列經(jīng)CodonCode Aligner V5.0.2.0拼接，采用MEGA6.0軟件進(jìn)行序列比對，計(jì)算種內(nèi)和種間遺傳距離。采用最近距離法(Nearest Distance)和構(gòu)建鄰接樹(NJ Tree)分析ITS2條形碼對半枝蓮的鑒定能力。結(jié)果：半枝蓮ITS2序列種內(nèi)遺傳距離為0～0.008 4，與其混偽品半邊蓮、韓信草和荔枝草的種間遺傳距離分別為0.354 7～0.369 6、0.044 2～0.054 2、0.271 9～0.301 8。半枝蓮種內(nèi)最大遺傳距離小于其與混偽品的種間最小遺傳距離，表明ITS2條形碼可以準(zhǔn)確鑒定半枝蓮與其混偽品?；贗TS2序列構(gòu)建的NJ樹也可將半枝蓮及其混偽品明顯區(qū)分開。結(jié)論：ITS2序列可以快速、準(zhǔn)確鑒別半枝蓮與其混偽品，是鑒別半枝蓮、保障其藥材質(zhì)量的有效條形碼。

半枝蓮；ITS2；DNA條形碼；分子鑒定

半枝蓮為常用中藥，具有清熱解毒，化瘀利尿的功效，用于治療疔瘡腫毒、咽喉腫痛、跌撲傷痛、水腫、黃疸及蛇蟲咬傷[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，半枝蓮具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌等多種藥理活性作用[2-6]，在臨床上可用于治療肺癌、乳腺癌、直腸癌等[7-9]。半枝蓮藥材來源為唇形科植物半枝蓮ScutellariabarbataD.Don的干燥全草，然而其常見混偽品半邊蓮LobeliachinensisLour.、韓信草ScutellariaindicaL.和荔枝草SalviaplebeiaR.Br.常與其混用[10]，導(dǎo)致用藥安全存在隱患。其混偽品韓信草、荔枝草和半枝蓮?fù)瑢俅叫慰浦参铮哂星o方形相似形態(tài)，易于混淆[11]?；靷纹钒脒吷弫碓礊榻酃？浦参锇脒吷彽母稍锶?，二者雖親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，形態(tài)差異相對較大，但由于其名稱和功效都相近，藥用部位也相同，在實(shí)際應(yīng)用中經(jīng)常發(fā)生混淆[12]。這些混偽品與半枝蓮的功效和化學(xué)成分都存在差異，若在臨床使用中混用或錯用，將對臨床用藥安全構(gòu)成威脅。為了將半枝蓮及其混偽品更好的區(qū)分開，保證臨床用藥的安全有效，急需一種準(zhǔn)確快速的鑒定方法。

利用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行物種分類和鑒定已經(jīng)成為近年來的研究熱點(diǎn)[13]。較傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別而言，DNA條形碼鑒定技術(shù)不受藥材性狀、鑒別經(jīng)驗(yàn)的影響，可直接從基因水平快速準(zhǔn)確地區(qū)分藥材及其混偽品，具有高效、操作簡單的優(yōu)點(diǎn)[14]。Chen等經(jīng)過大量樣本研究建立的以ITS2為核心，psbA-trnH為補(bǔ)充序列的植物類藥材DNA條形碼鑒定體系已被納入中國藥典(2010年版)增補(bǔ)本[15]。ITS2序列具有適宜擴(kuò)增和測序的長度，且鑒定成功率高，其鑒定能力已在豆科[16]、薔薇科[17]、菊科[18]、蕓香科[19]等多個科屬中得到驗(yàn)證。目前，ITS2條形碼已廣泛應(yīng)用于中藥材鑒定[20-40]。本研究采用ITS2條形碼對半枝蓮及其易混淆品進(jìn)行DNA條形碼鑒別研究，為半枝蓮的準(zhǔn)確鑒定提供依據(jù)。

1 材料

本研究共收集實(shí)驗(yàn)材料34份，其中半枝蓮樣品26份，包括藥材16份，種子10份；其混偽品樣品8份，包括半邊蓮7份，韓信草1份。樣品收集于河北、安徽、四川、江蘇、北京等地，憑證標(biāo)本經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定，并保存于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所。另外，從GenBank下載ITS2序列6條，分別為半邊蓮2條，韓信草2條，荔枝草2條。樣本信息詳見表1。

2 方法

2.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序 半枝蓮及其混偽品藥材各挑選葉片部分，稱取約30 mg；半枝蓮種子稱取60 mg，加入樣本量10%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，用DNA提取研磨儀(Retsch MM400，德國)研磨2 min(30次/s)，采用植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取總DNA。擴(kuò)增ITS2序列，正向引物：ITS2F：5' -ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'，反向引物：ITS3R：5' -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。擴(kuò)增體系及程序參照“中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則”[14]，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院進(jìn)行雙向測序。

2.2 數(shù)據(jù)處理 測序峰圖利用CodonCode AlignerV5.0.2.0(CodonCode Co.，USA)校對拼接。所得序列及GenBank下載序列基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S和28S區(qū)段。將所有序列用軟件MEGA6.0分析比對，并基于K2P模型進(jìn)行遺傳距離等分析。所得序列采用最近距離法(nearest distance)、構(gòu)建鄰接樹(NJ Tree)對序列鑒定能力進(jìn)行評估。

3 結(jié)果

3.1 半枝蓮及其混偽品ITS2序列特征分析 半枝蓮25條ITS2序列的長度均為241 bp，GC含量為68.9%～69.3%，半枝蓮種內(nèi)序列間存在2個變異點(diǎn)，分別為59位點(diǎn)G-A變異，229位點(diǎn)G-A變異，分為3個單倍型?；靷纹钒脒吷?、韓信草和荔枝草ITS2序列長度分別為246bp、234bp和228bp，GC含量分別為66.3%～67.2%、67.1%～67.9%和61.4%～62.3%。半枝蓮與半邊蓮、韓信草及荔枝草存在較多變異位點(diǎn)。見圖1。

表1 樣本信息

圖1 半枝蓮及其混偽品的種間變異位點(diǎn)

3.2 半枝蓮及其混偽品種內(nèi)及種間遺傳距離分析 半枝蓮ITS2序列種內(nèi)最小遺傳距離0，最大遺傳距離為0.008 4。半邊蓮、韓信草和荔枝草ITS2序列種內(nèi)遺傳距離分別為0～0.012 4、0～0.004 3、0.008 8。半枝蓮與半邊蓮、半枝蓮與韓信草以及半枝蓮與荔枝草之間的遺傳距離分別為0.354 7～0.369 6、0.044 2～0.054 2、0.271 9～0.301 8(表2)。半枝蓮與其混偽品種間最小遺傳距離大于半枝蓮種內(nèi)最大遺傳距離，說明采用ITS2序列可以將半枝蓮與其混偽品準(zhǔn)確區(qū)分開。

3.3 構(gòu)建NJ樹鑒別半枝蓮及其混偽品 從基于ITS2序列構(gòu)建的NJ樹圖(圖2)可以看出，半枝蓮單獨(dú)聚為一支，支持率為96%，表現(xiàn)出單系性。混偽品半邊蓮、韓信草及荔枝草各自聚為一支，明顯與半枝蓮分開。因此，ITS2條形碼可準(zhǔn)確鑒別半枝蓮藥材及其混偽品。

圖2 基于ITS2序列構(gòu)建的半枝蓮及其混偽品NJ樹

4 討論

4.1 半枝蓮混淆現(xiàn)象多見 半枝蓮為常用中藥，在臨床上有廣泛應(yīng)用。然而，有文獻(xiàn)報(bào)道半邊蓮、韓信草和荔枝草等中藥材常與其混淆使用[10]，嚴(yán)重影響藥材質(zhì)量。韓信草、荔枝草與半枝蓮?fù)瑏碓从诖叫慰魄宜幱貌课幌嗤哂邢嗨频那o四棱的植物學(xué)特征，在采收和使用過程中均易發(fā)生混淆。半邊蓮與半枝蓮形態(tài)特征差異較明顯，與其他混偽品相比較，易于與半枝蓮進(jìn)行區(qū)分。然而，我們的研究發(fā)現(xiàn)半邊蓮卻是半枝蓮更為常見的混偽品，本研究中收集于廣西藥店的BABL0007號樣品，購買時標(biāo)簽注明為半枝蓮，通過序列比對進(jìn)行判定并經(jīng)過NJ樹驗(yàn)證，結(jié)果證明該樣品并非半枝蓮，而是半邊蓮，可見半枝蓮和半邊蓮因其名稱相近，在使用中的確易于發(fā)生混淆。

4.2 ITS2條形碼可從種子源頭控制半枝蓮質(zhì)量 獲得樣品DNA以及擴(kuò)增得到條形碼序列是成功運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)的前提。種子類實(shí)驗(yàn)材料多含有大量油脂，存在難以粉碎和裂解的問題[36]。張娜娜等[37]在加裂解液GP1后，以65 ℃水浴4 h的條件對澤瀉種子進(jìn)行DNA提取。馬雙姣等[38]在王不留行種子粉碎前加入相當(dāng)于藥材量5%的PVP，粉碎后加人核分離液700 μL漂洗2～3次，65 ℃水浴3 h提取DNA。本研究在提取半枝蓮種子DNA時，在粉碎前加入樣本量10%的PVP，加裂解液GP1后56 ℃水浴過夜，后續(xù)按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，成功對所有半枝蓮種子DNA進(jìn)行提取和PCR擴(kuò)增，說明半枝蓮種子DNA易于提取。在收集的10份種子樣品中，9份樣品鑒定結(jié)果為半枝蓮，BAZL0026號樣品鑒定結(jié)果為旋花科的南方菟絲子，未發(fā)現(xiàn)常見混偽品韓信草、荔枝草和半邊蓮的種子。南方菟絲子不是半枝蓮的常見混偽品，親緣關(guān)系也非常遠(yuǎn)，僅僅是大小相似，就造成了種子混淆，說明半枝蓮藥材種子混淆問題存在且很嚴(yán)重，急需解決。中藥材種類繁多，鑒別困難，對其種子進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別更是難上加難，因此種子比藥材更易混淆。然而，在種子源頭發(fā)生混淆將直接導(dǎo)致中藥材的錯種和錯收，會嚴(yán)重影響藥材質(zhì)量和用藥安全，而且會造成經(jīng)濟(jì)上的大量損失。ITS2條形碼的成功應(yīng)用，能有效避免半枝蓮種子在流通環(huán)節(jié)混偽現(xiàn)象的發(fā)生，從根源上保證藥材的質(zhì)量。

4.3 ITS2條形碼可有效鑒別半枝蓮藥材及其混偽品 ITS2條形碼在多種植物類中藥材及其混偽品的鑒定中顯示出了較好的物種鑒定能力，涵蓋根及根莖類[20-23]、葉類[24-25]、莖木類[26-28]、皮類[29-31]、全草類[32]、花類[33]及果實(shí)及種子類[34-35]等中藥材。本研究成功提取了半枝蓮及其混偽品藥材的DNA，且所有實(shí)驗(yàn)樣本的PCR擴(kuò)增、測序成功率及序列獲得率均為100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明半枝蓮的種內(nèi)最大遺傳距離小于與其混偽品的種間最小遺傳距離，NJ樹中半枝蓮及其混偽品都能很好的各自聚為一支，與其混偽品能明顯分開，說明ITS2條形碼是對半枝蓮及其混偽品進(jìn)行準(zhǔn)確快速鑒定的好工具，也再次證實(shí)了DNA條形碼對中藥材物種鑒定的能力。DNA條形碼對半枝蓮及其混偽品鑒別的高度準(zhǔn)確性，為規(guī)范中藥材半枝蓮的市場流通，保障臨床用藥安全及療效提供了參考依據(jù)，也為全草類中藥材的鑒別提供了新的手段。

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(2016-04-12收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Identification of Scutellariabarbata and its adulterants using ITS2 barcode

Guo Mengyue，Ren Li，Chen Xinlian，Pang Xiaohui

(InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193,China)

Objective:To discriminate betweenScutellariabarbata and its adulterants using ITS2 barcode to provide evidence for its clinic safety.Methods:The DNA was extracted from the samples and the second internal transcribed spacer(ITS2)was amplified and sequenced.Sequence assembly was performed using the CodonCode AlignerV5.0.2.0.The genetic distances and variable sites of ITS2 region were analyzed using MEGA6.0 after sequence alignment.Nearest distance and neighbor-joining tree(NJ-tree)methods were used to test the identification efficiency of the ITS2 barcode.Results:The intraspecific genetic distances ofS.barbata were 0～0.0084，while the interspecific genetic distances between S.barbata and its adulterants were 0.3547～0.3696,0.0442～0.0542，and 0.2719～0.3018，respectively.The maximum intraspecific genetic distance of S.barbata was lower than the minimum interspecific genetic distance between S.barbataand its adulterants，which indicates that ITS2 barcode could discriminate S.barbata and its adulterants accurately.The NJ tree based on ITS2 sequences also reveals that S.barbata and its adulterants could be obviously identified.Conclusion:S.barbata could be accurately distinguished from its adulterants using ITS2.The ITS2 region is an efficient barcode to guarantee the quality of medicines.

Scutellariabarbata; ITS2; DNA barcode; Molecular identification

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號：81573541)

龐曉慧(1983—)，女，博士，副研究員，從事中藥分子鑒定研究，Tel：(010)57833051，E-mail：xhpang@implad.ac.cn

R282.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.010