湯 歡 蘇燕燕 雷志勇 李志明 李西文

(1 中國中醫(yī)科學院中藥研究所，中藥鑒定與安全性檢測評估北京市重點實驗室，北京，100700； 2 北京千菌方菌物科學研究院，北京，100005)

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藥用多孔菌DNA條形碼鑒定研究

湯 歡1蘇燕燕1雷志勇2李志明2李西文1

(1 中國中醫(yī)科學院中藥研究所，中藥鑒定與安全性檢測評估北京市重點實驗室，北京，100700； 2 北京千菌方菌物科學研究院，北京，100005)

目的：篩選采用DNA條形碼技術(shù)鑒定藥用多孔菌的有效條形碼及該方法的可行性。方法：對29種藥用多孔菌的69份樣品進行DNA提取，通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增ITS序列并進行雙向測序，去除低質(zhì)量區(qū)和引物區(qū)，得到ITS序列，通過BLAST比對及基于K2P遺傳距離構(gòu)建系統(tǒng)聚類NJ樹開展ITS鑒定效率評價。結(jié)果：經(jīng)過優(yōu)化的DNA提取方法，可對所有樣品成功提取到足量DNA，PCR擴增產(chǎn)物測序并經(jīng)過序列拼接剪切后均能得到高質(zhì)量ITS序列；物種內(nèi)ITS最大遺傳距離均遠小于物種種間最小遺傳距離；基于GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，鑒定效率達到100%；基于K2P遺傳距離構(gòu)建NJ樹，結(jié)果顯示相同物種均聚為一支。結(jié)論：DNA條形碼技術(shù)可以對多孔菌進行快速準確鑒定，ITS序列可作為藥用多孔菌有效候選DNA條形碼。

藥用多孔菌；DNA條形碼；真菌；ITS

多孔菌是子實體呈孔狀且質(zhì)地革質(zhì)至木質(zhì)的一類大型擔子菌，屬于寄生或腐生生物，主要生長在木材上，與高等綠色植物相比，多不常見。多孔菌包括多種大型藥用真菌，《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有以靈芝、茯苓、豬苓、雷丸等多孔菌藥用的記載。人類認識和利用真菌的歷史在西方已有3 500年以上，我國則超過6 000年，但真菌分類學的產(chǎn)生和發(fā)展卻是在近200年左右。瑞典博物學家林奈在SpeciesPlantarum[1]中，首次記載了8種多孔菌。Christiaan Hendrik Persoon[2]將多孔菌歸入裸果綱(Gymnocarpi)褶體目(Hymenothii)菇型類(Agaricoidei)中。Elias Magnus Fries[3]在Christiaan Hendrik Persoon的分類系統(tǒng)基礎(chǔ)上，采用新的分類標準，進行了新的科屬劃分。我國的多孔菌研究起步較晚，基礎(chǔ)薄弱，胡先骕先生將其最初采集的多孔菌送往國外進行物種鑒定[4]。鄧叔群[5]和戴芳斕[6]先后記載中國多孔菌有50個屬。卯曉嵐[7]、趙繼鼎、張小青[8-9]等對我國的靈芝科、多孔菌科真菌也做了大量深入的研究。與綠色植物以花和果實作為主要鑒定器官不同，傳統(tǒng)鑒定真菌的主要依據(jù)是菌絲和孢子的特征，需要鑒定者有多年的經(jīng)驗積累，主觀性較強。同時多孔類真菌親緣關(guān)系和進化趨向比較復(fù)雜，用傳統(tǒng)方法進行鑒定所需周期長，鑒定方法重現(xiàn)性較差。因此，急需尋求一種客觀且快速高效的鑒定方法。

DNA條形碼技術(shù)擺脫了傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法依賴長期經(jīng)驗的束縛，鑒定快速準確，易于實現(xiàn)標準化，是傳統(tǒng)生物鑒定方法的有效補充和重大突破[10]。真菌是數(shù)量僅次于昆蟲的第二大真核生物類群，與動、植物相比，真菌DNA條形碼研究鮮有報道。為此，國際生命條形碼組織專門為其設(shè)立了工作組，并成立了國際真菌條形碼專業(yè)委員會以組織協(xié)調(diào)國際真菌DNA條形碼相關(guān)研究工作。DNA條形碼技術(shù)可準確辨別形態(tài)分類難以區(qū)分的真菌，任何生長發(fā)育時期的真菌均可使用該技術(shù)進行鑒定，是傳統(tǒng)鑒定方法所不能比擬的[11]。因真菌多寄生或腐生，沒有葉綠體，適用于植物葉綠體的rbcL、matK、psbA-trnH序列不適用于真菌的鑒定，Conrad L Schoch等[12]經(jīng)過大量研究，推薦使用細胞核中的ITS基因片斷作為真菌的條形碼序列。目前，該體系已廣泛應(yīng)用于各類植物及真菌的鑒定中，均表現(xiàn)出較強的鑒定能力[13-32]。本研究運用DNA條形碼技術(shù)對多種藥用多孔菌進行鑒定研究，進一步評估ITS作為DNA條形碼鑒定多孔類真菌的可行性，以期篩選多孔真菌通用條形碼，為實現(xiàn)多孔類真菌的快速準確鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究共涉及29種藥用多孔菌的69份樣品。其中，51份來自北京陳康林野生藥用真菌研究院，5份來自大興安嶺漠河縣，5份來自西藏林芝，3份來自四川康定，1份來自四川攀枝花，4份來自市場購買，以上樣品經(jīng)過大型真菌分類專家卯曉嵐教授鑒定，詳細信息見表1。本研究中的69份樣品均獲得了ITS序列，其序列均已提交至GenBank。另外，從GenBank下載了這29個物種的ITS序列。樣品信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA提取、PCR擴增和測序 樣品DNA提?。河靡掖济薏潦谜婢蠊稳フ婢砻?，取靠近里面的組織(木耳等不適宜刮的真菌僅用乙醇棉擦拭后即可取樣)，用刀片切成細塊，稱取樣品約40 mg。用高通量組織研磨儀(Sceintz Biotech Co.，China)，在50 Hz頻率下研磨200 s，加入核分離液(100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，20 mmol/L EDTA(pH 8.0)，0.7 mmol/L NaCl，2% PVP-40，0.4% β-巰基乙醇)[33]清洗2～4次(800 μL/次)至上清液無色，用移液槍小心吸去上清液，留沉淀，加裂解液后，置于56 ℃水浴過夜(水浴約8 h)，再采用植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取樣品總DNA。詳細操作步驟參見2015版中國藥典“中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則”及試劑盒說明書。

表1 實驗所用樣品信息表

PCR擴增和測序：采用ITS序列通用引物ITS5F/4R進行擴增，ITS序列PCR擴增正向引物序列為ITS5F：5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3；反向引物序列為ITS4R：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3。PCR反應(yīng)體系：以25 μL為參照，2×Taq PCR Master Mix(Aidlab Biotech Co.，China)12.5 μL，正向和反向引物各1.0 μL(2.5 μmol/L)，模板DNA量為50～100 ng(約4.0 μL所提的DNA液)，再用dd H2O補至25 μL。PCR擴增程序：94°C變性5 min；再進行30個循環(huán)(每個循環(huán)均為：94 ℃變性1 min、50 ℃退火1 min、72 ℃延伸90 s)；72°C延伸7 min。用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR情況，對出現(xiàn)清晰目的條帶的樣品進行純化后，采用ABI 3730XL測序儀(Applied Biosystems Co.，USA)進行雙向測序。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 使用CodonCode Aligner V3.7.1(CodonCode Co.，USA)對測序序列進行質(zhì)量分析和校對拼接，去除低質(zhì)量區(qū)，導出序列。運用MEGA 6.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis.，USA)軟件將98條(包括實驗的69條和下載的29條)ITS序列進行序列分析，并基于Kimura 2-parameter model(K2P)計算種內(nèi)和種間遺傳距離，用鄰接法(Neighbor Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，并用自舉檢驗法Bootstrap 1 000次檢驗各分支的支持率[34]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取及PCR擴增 樣品DNA提取是開展DNA條形碼研究的首要環(huán)節(jié)。藥用多孔菌中普遍含有大量的次生代謝產(chǎn)物，采用核分離液洗滌后，可去除細胞核中大部分的多糖、多酚等物質(zhì)，提高DNA純度。將69份樣品用高通量組織研磨儀研磨后，用核分離液洗滌2～4次(800 μL/次)，至上清液無色為止，再按DNA提取試劑盒的操作步驟提取樣品DNA，均能得到高質(zhì)量的DNA，其PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后均能顯示單一目的條帶，擴增效率100%。

2.2 遺傳距離分析 29種藥用多孔菌的98條ITS序列的種內(nèi)和種間遺傳距離見表2。由表2可知：各物種的種內(nèi)最大遺傳距離均遠小于物種間最小遺傳距離，各物種在遺傳距離上差異明顯。

2.3 BLAST分析 將實驗獲得的69條藥用多孔菌的ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，結(jié)果見表3：在29種藥用多孔菌中，19個物種的最大BLAST相似度為100%，10個物種的最大BLAST相似度為99%，在69條序列中，只有漆柄小孔菌的1條序列的最大BLAST相似度為98%。BLAST相似度不是100%的序列中，其最大BLAST相似度對應(yīng)的物種均為所鑒定的基原物種。

2.4 NJ樹分析 運用K2P模型，選取實驗獲得的69條和從GenBank下載的29條ITS序列，以鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹。見圖1。結(jié)果顯示，各物種的ITS序列均聚為一支。由此可知，運用ITS序列能準確鑒定此類藥用多孔菌，具有較強的鑒定能力。

圖1 基于ITS序列構(gòu)建的藥用多孔菌鄰接(NJ)樹

3 討論

3.1 DNA提取 藥用多孔菌的子實體中含有較多的多酚、多糖類物質(zhì)，研磨時，多酚極易氧化成醌類，使提取出的DNA液帶顏色，在純化過程中很難去除，影響后續(xù)PCR反應(yīng)。本研究通過多次反復(fù)實驗發(fā)現(xiàn)，對DNA提取試劑盒操作步驟進行優(yōu)化后能獲得高質(zhì)量DNA。具體優(yōu)化步驟如下：1)取樣：刮去樣品表皮，稱取子實體里面的組織；2)洗滌：向每管研磨好的樣品中加核分離液清洗2～4次(800 μL/次)至上清液無色，提高所提DNA的純凈度；3)水?。杭恿呀庖汉蠓湃?6 ℃水浴鍋中水浴約8 h，使樣品細胞中的DNA充分溶出。

3.2 鑒定 藥用多孔菌形態(tài)多種多樣，在不同發(fā)育時期的形態(tài)差異較大，運用傳統(tǒng)鑒定方法對其進行鑒定較困難。并且，適用于植物葉綠體的rbcL、matK、psbA-trnH序列不適用于葉綠體已退化的真菌。因此，本研究選用細胞核中的ITS序列作為DNA條形碼，鑒定藥用多孔菌。本研究中，從不同產(chǎn)地收集的69份樣品均可穩(wěn)定獲得其ITS序列，各樣品種內(nèi)最大遺傳距離均遠小于種間最小遺傳距離，所有樣品在GenBank數(shù)據(jù)庫中均能BLAST比對到正確的物種。同時，NJ樹結(jié)果顯示各物種的ITS序列均聚為一支。由此可知，運用ITS序列能準確鑒定此類藥用多孔菌，具有較強的鑒定能力。

表2 藥用多孔菌種內(nèi)及種間遺傳距離表

表3 BLAST比對結(jié)果表

3.3 結(jié)論 依據(jù)真菌的形態(tài)特征、生長特性以及生理生化指標進行分類鑒定的傳統(tǒng)方法，重復(fù)性差，由于受到許多主觀因素影響，易于發(fā)生誤判。并且，由于真菌的鑒定不同于維管植物，分類特征微小，進化更為復(fù)雜，需要鑒定者有較豐富的鑒定經(jīng)驗，給真菌的傳統(tǒng)分類鑒定帶來了嚴峻挑戰(zhàn)。DNA條形碼技術(shù)作為一種分子鑒定技術(shù)，不受物種外部形態(tài)的影響，對能提取出DNA的各類型樣品均能進行鑒定。DNA條形碼技術(shù)經(jīng)過10余年的發(fā)展，已被用于中藥鑒定學、系統(tǒng)分類學、生態(tài)學、發(fā)育進化、生物多樣性保護等領(lǐng)域[35]。Scott E.Miller稱DNA條形碼技術(shù)推動了分類學的“文藝復(fù)興”[36]，能夠給日漸萎縮的傳統(tǒng)形態(tài)分類學帶來新的發(fā)展機遇。向麗等[37]使用ITS序列對冬蟲夏草進行了準確鑒定，Conrad L Schoch等推薦使用ITS基因片斷作為真菌的有效DNA條形碼序列。本研究對多種藥用真菌的條形碼鑒定研究結(jié)果表明ITS序列可作為潛在的多孔菌通用條形碼序列。

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(2016-04-12收稿 責任編輯：洪志強)

Identification of medicinal polypore using DNA barcoding

Tang Huan1，Su Yanyan1，Lei Zhiyong2，Li Zhiming2，Li Xiwen1

(1InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，KeyLaboratoryofBeijingforIdentificationandSafetyEvaluationofChineseMedicine，Beijing100700，China; 2BeijingQianjunfangMycologicalResearchInstitute，Beijing100005，China)

Objective:To study the feasibility of applying DNA barcoding technique to identify medicinal polypore.Methods:The genomic DNAs were extracted from 69 samples，and the ITS sequences were amplified and bidirectionally sequenced.All the sequences were assembled.The genetic distances were computed by Kimura 2-parameter(K2P)model and Neighbor-joining(NJ)phylogenetic tree was constructed.Results:The maximum intraspecific genetic distance of each species were all less than the minimum interspecific genetic distance.The ITS sequences were identified using Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)method in the GenBank database.The ITS sequences of each species were clustered into one clade respectively using NJ tree method.Conclusion:The ITS sequence can be used as a candidate DNA barcode of medicinal polypore.

Medicinal polypore; DNA barcoding; Fungi; ITS sequence

重大新藥創(chuàng)制國家科技重大專項(編號：2014ZX09304307001-014；2014ZX09301308-007)；國家科技支撐計劃(編號：2015BAI05B02)；中央科研院所公益項目(編號：ZXKT15029，ZZ2014029)

湯歡(1986—)，男，博士研究生，研究方向：經(jīng)典植物分類及中藥材分子鑒定

李西文(1978—)，男，博士，副研究員，電話/傳真：(010)84084107，E-mail：xwli@icmm.ac.cn

R282.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.005