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        Cr6+對(duì)草魚腦和肝胰臟組織結(jié)構(gòu)及其超氧化物歧化酶活性的影響

        2016-12-20 02:58:54任洪濤
        水產(chǎn)科學(xué) 2016年6期
        關(guān)鍵詞:質(zhì)量

        任洪濤,林 霖

        ( 河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,河南 洛陽 471003 )

        Cr6+對(duì)草魚腦和肝胰臟組織結(jié)構(gòu)及其超氧化物歧化酶活性的影響

        任洪濤,林 霖

        ( 河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,河南 洛陽 471003 )

        在水溫(20±1) ℃下,采用靜水測試法研究水體中不同質(zhì)量濃度Cr6+(120.00、160.80、215.47、288.73、386.90 mg/L,重鉻酸鈉配制) 對(duì)體質(zhì)量約10 g草魚腦和肝胰臟的組織結(jié)構(gòu)及肝胰臟中超氧化物歧化酶活性的影響,以探討重金屬的毒性積累和毒性機(jī)制。試驗(yàn)結(jié)果表明,Cr6+對(duì)草魚的24、48、96 h半數(shù)致死質(zhì)量濃度(LC50)分別為302.77、154.47、78.89 mg/L,由(48 h LC50×0.3)/(24 h LC50/48 h LC50)2和96 h LC50×0.1計(jì)算出安全質(zhì)量濃度分別為12.068 mg/L和7.489 mg/L。中毒初期肝細(xì)胞輕微肥大,無序離散,細(xì)胞核相對(duì)縮小,胞漿輕微展出;隨著時(shí)間的延長,肝胰臟異常的程度更加嚴(yán)重,甚至肝壞死,肝細(xì)胞明顯肥大,無序性離散程度明顯增大,細(xì)胞核明顯縮小,肝細(xì)胞胞漿展出,細(xì)胞空化;腦細(xì)胞開始出現(xiàn)破裂,細(xì)胞液溢出,細(xì)胞核輕微聚集;隨后腦細(xì)胞的異常程度更加嚴(yán)重,細(xì)胞破裂、細(xì)胞核聚集程度嚴(yán)重。隨著Cr6+質(zhì)量濃度的升高和時(shí)間的延長,草魚肝胰臟中超氧化物歧化酶活性降低。

        草魚;Cr6+;質(zhì)量濃度;組織器官;超氧化物歧化酶

        隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展,在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量重金屬廢棄物,這些重金屬大部分最終流入河流、湖泊等水域,對(duì)水生生物造成嚴(yán)重污染。在水環(huán)境中重金屬離子富集于底泥中, 然后被浮游生物富集, 再通過食物鏈進(jìn)入魚體內(nèi)大量蓄積。重金屬在魚體中不斷蓄積,通過食物鏈進(jìn)入人體后,對(duì)人體的生長發(fā)育造成了許多不良影響,甚至危及人類的生命安全,因此研究重金屬在魚體中的積累具有重要意義。鉻(Chromium,Cr)是水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體必需的微量元素之一,自然界中主要以鉻鐵礦FeCr2O4(Cr3+)的形式存在,適量的Cr3+可以降低動(dòng)物機(jī)體血漿中的血糖含量,提高機(jī)體胰島素的活性,促進(jìn)糖和脂肪的代謝,提高機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)能力等[1]。而Cr6+則是一種強(qiáng)氧化劑,具有強(qiáng)致癌變、致畸變、致突變的作用,對(duì)生物體的傷害較大。近年來隨著工業(yè)的迅猛發(fā)展,水環(huán)境中鉻的含量不斷上升,過量的鉻離子通過魚類的口、皮膚和鰓進(jìn)入魚體內(nèi),在魚體內(nèi)蓄積超出一定范圍時(shí),危害魚類的組織結(jié)構(gòu),影響其生理功能、生長發(fā)育。過量的鉻在水產(chǎn)動(dòng)物中蓄積,終將危及人類的健康。Cr6+嚴(yán)重危害水生生物以及自然生態(tài)環(huán)境,我國將其列入中國水環(huán)境優(yōu)先控制污染物黑名單。

        草魚(Ctenopharyngodonidellus)為我國四大家魚之一,是人工養(yǎng)殖的主要種類之一,每年產(chǎn)量居于世界前列。目前有關(guān)草魚的研究主要集中在營養(yǎng)價(jià)值、轉(zhuǎn)基因抗病、人工繁殖、疾病防治等方面,而針對(duì)養(yǎng)殖水環(huán)境重金屬污染對(duì)草魚毒性效應(yīng)的研究卻較少。

        養(yǎng)殖水環(huán)境中Cr6+的毒性主要取決于在生物體內(nèi)的吸收和積累,所以,研究在一定含量和時(shí)間下,Cr6+在草魚組織中的吸收、積累的影響,有利于揭示重金屬離子的吸收、積累機(jī)制。本試驗(yàn)主要研究了水體中不同含量Cr6+對(duì)草魚腦和肝胰臟組織結(jié)構(gòu)及肝胰臟中超氧化物歧化酶活性的影響,為研究重金屬的毒性積累和毒性機(jī)制提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        試驗(yàn)魚購自洛陽市水產(chǎn)市場,暫養(yǎng)3 d后進(jìn)行試驗(yàn)。暫養(yǎng)期間24 h連續(xù)充氣,每日投喂市售商品飼料1~2次,并及時(shí)清除殘餌及糞便。正式試驗(yàn)前停食1 d,選取體長8.0~10.0 cm、體質(zhì)量約10 g、體質(zhì)健壯、規(guī)格整齊的個(gè)體進(jìn)行試驗(yàn)。

        試驗(yàn)在6 L水桶中進(jìn)行。Cr6+由重鉻酸鈉(Na2Cr2O7·2H2O,分析純,上?;瘜W(xué)試劑總廠)配制。試驗(yàn)用水為曝氣24 h的自來水,水溫(20±1) ℃,pH 7.0±0.5。試驗(yàn)期間連續(xù)充氣。

        1.2 方法

        每一水桶中加入1 L的藥液,10尾草魚,不投喂也不充氧。死亡標(biāo)準(zhǔn)為腹部朝上、失去游動(dòng)能力、針刺無反應(yīng),及時(shí)撈出死亡個(gè)體。

        1.2.1 預(yù)試驗(yàn)

        配制1000 mg/L的重鉻酸鈉母液,按試驗(yàn)設(shè)置稀釋成不同質(zhì)量濃度的溶液。以10倍之差估計(jì)5個(gè)質(zhì)量濃度梯度。每個(gè)質(zhì)量濃度組用草魚5尾,處理24 h,試驗(yàn)進(jìn)行2~3次,找出Cr6+對(duì)草魚的24 h最小致死質(zhì)量濃度和100%致死質(zhì)量濃度的范圍,記錄重金屬離子染毒時(shí),草魚的反應(yīng),為正式試驗(yàn)設(shè)計(jì)質(zhì)量濃度梯度和觀察魚的活動(dòng)提供依據(jù)。

        1.2.2 正式試驗(yàn)

        根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果按等比級(jí)數(shù)設(shè)計(jì)5個(gè)質(zhì)量濃度組:120.0、160.8、215.472、288.73、386.9 mg/L,1個(gè)空白對(duì)照組,每組3個(gè)平行,每個(gè)桶中放入草魚10尾。隨時(shí)觀察試驗(yàn)魚的癥狀,撈出死亡個(gè)體,記錄24、48、96 h各組草魚死亡的尾數(shù),統(tǒng)計(jì)草魚的死亡率。死亡的判定標(biāo)準(zhǔn):魚腹部向上,鰓停止運(yùn)動(dòng)。用直線內(nèi)插法,以質(zhì)量濃度的常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo), 死亡率的概率單位為縱坐標(biāo),測出24、48、96 h草魚的半致死質(zhì)量濃度(LC50);由公式SCⅠ=(48 h LC50×0.3)/(24 h LC50/48 h LC50)2和SCⅡ=96 h LC50×0.1計(jì)算出安全質(zhì)量濃度(SC)。

        取出死亡草魚肝胰臟和腦組織,一部分放入10%甲醛溶液中固定,用來制作組織切片;另一部分裝入1.5 mL EP管中,做標(biāo)記,置于-20 ℃冰箱中保存。用南京建成生物工程研究所試劑盒測定肝胰臟中超氧化物歧化酶的活性。

        1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

        試驗(yàn)測得的所有數(shù)據(jù)均采用Excel進(jìn)行整理;用SPSS軟件中的單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析差異顯著性。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 草魚中毒的行為癥狀

        草魚種Cr6+中毒的癥狀為:草魚進(jìn)入高質(zhì)量濃度組水體后,躁動(dòng)不安,在水桶內(nèi)快速游動(dòng),隨著染毒時(shí)間的延長,平衡游泳能力受影響,不斷在水中側(cè)翻打轉(zhuǎn)、急速游動(dòng)、上下直竄,持續(xù)一段時(shí)間后,活動(dòng)力下降,游動(dòng)遲緩,反應(yīng)遲鈍,最后喪失運(yùn)動(dòng)能力,躺臥水底,魚體上浮,腹部側(cè)斜向上,僅見鰓蓋微動(dòng)直至死亡;最初幾小時(shí)內(nèi),低質(zhì)量濃度組草魚的活動(dòng)狀況與對(duì)照組無明顯差異,均在水桶內(nèi)平緩游動(dòng),看不出有任何中毒現(xiàn)象,隨著染毒時(shí)間的延長草魚逐漸失去活力,胸鰭和腹鰭基部充血,對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍,出現(xiàn)類似于高質(zhì)量濃度組的癥狀;而在染毒后期,無論高、低質(zhì)量濃度組死魚數(shù)目均增加,死魚體僵硬呈灰白色,懸浮于水面。

        2.2 Cr6+ 對(duì)草魚的急性毒性

        Cr6+質(zhì)量濃度與草魚的平均死亡率呈明顯的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系:相同質(zhì)量濃度條件下,草魚的平均死亡率隨著時(shí)間的延長而增加;相同時(shí)間內(nèi),草魚的死亡率隨著Cr6+質(zhì)量濃度的升高而增加(表1)。

        表1 草魚在不同質(zhì)量濃度Cr6+、不同暴露時(shí)間的死亡率 %

        24、48、96 h的半致死質(zhì)量濃度分別為302.77、154.47、78.89 mg/L;由SCⅠ=(48 h LC50×0.3)/(24 h LC50/48 h LC50)2和SCⅡ= 96 h LC50×0.1計(jì)算出安全質(zhì)量濃度分別為12.068 mg/L和7.489 mg/L(表2)。

        表2 Cr6+對(duì)草魚的急性毒性線性回歸方程、半致死質(zhì)量濃度及安全質(zhì)量濃度

        注:y:死亡率概率;x:質(zhì)量濃度對(duì)數(shù).

        2.3 Cr6+對(duì)草魚肝胰臟和腦組織結(jié)構(gòu)的影響

        顯微鏡下觀察組織切片發(fā)現(xiàn),肝細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的異常(圖1)。由圖1可見,對(duì)照組草魚肝胰臟細(xì)胞完整,細(xì)胞輪廓清晰,無異常;Cr6+處理24 h時(shí),肝胰臟出現(xiàn)輕微異常,肝細(xì)胞輕微肥大,無序離散,細(xì)胞核相對(duì)縮小,胞漿也有輕微展出;Cr6+處理96 h時(shí),肝胰臟異常程度加重,甚至肝壞死,肝細(xì)胞明顯肥大,無序離散程度明顯增大,細(xì)胞核相對(duì)縮小明顯,肝細(xì)胞胞漿展出,細(xì)胞空化。

        對(duì)照組草魚腦細(xì)胞完整,可以清晰地分辨出細(xì)胞輪廓,無異常;Cr6+處理24 h時(shí),腦細(xì)胞出現(xiàn)輕微異常,細(xì)胞開始破裂,細(xì)胞液溢出,細(xì)胞核輕微聚集;Cr6+處理96 h時(shí),草魚腦細(xì)胞異常的程度加重,細(xì)胞破裂、細(xì)胞核聚集程度嚴(yán)重。

        在顯微鏡下觀察石蠟切片,發(fā)現(xiàn)腦細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的異常(圖2)。

        圖2 Cr6+對(duì)草魚腦組織結(jié)構(gòu)的影響

        2.4 Cr6+對(duì)超氧化物歧化酶活性的影響

        與對(duì)照組相比,48 h時(shí),Cr6+質(zhì)量濃度120 mg/L處理組草魚肝胰臟超氧化物歧化酶的活性下降不顯著,到96 h時(shí)下降顯著(P<0.05);215.472 mg/L時(shí),48、96 h時(shí)草魚肝胰臟超氧化物歧化酶活性下降顯著(P<0.05)。同一質(zhì)量濃度下,48、96 h時(shí)120 mg/L組草魚肝胰臟超氧化物歧化酶活性差異不顯著(P>0.05);215.472 mg/L時(shí),48、96 h時(shí)草魚肝臟超氧化物歧化酶活性差異不顯著(P>0.05)。同一時(shí)間,48 h時(shí) 120 mg/L和215.472 mg/L組草魚肝臟超氧化物歧化酶活性差異顯著(P<0.05),96 h差異不顯著(P>0.05)(圖3)。

        圖3 Cr6+作用下草魚肝胰臟超氧化物歧化酶的活性

        3 討 論

        3.1 鉻對(duì)魚類的急性毒性

        鉻是生物體必需的微量元素之一,微量的鉻對(duì)生物無毒害,并能促進(jìn)生物生長發(fā)育[2],但過量可影響其生長代謝,可使蛋白質(zhì)變性,使核酸和核蛋白沉淀,干擾酶系統(tǒng),抑制動(dòng)物的生長繁殖,引起機(jī)體中毒[3]。重金屬對(duì)魚類的毒害作用主要通過兩條途徑:一是重金屬離子與魚體表及鰓分泌的黏液結(jié)合,形成蛋白質(zhì)的復(fù)合物充塞于鰓瓣間隙,阻礙鰓絲的正常生理機(jī)能,引起呼吸障礙,窒息而亡;二是重金屬離子通過鰓及體表進(jìn)入魚體內(nèi),與體內(nèi)的關(guān)鍵酶活性中心的硫氫結(jié)合成難溶解的硫醇鹽,抑制酶的活性,妨礙機(jī)體的代謝作用,引起死亡[4]。本研究發(fā)現(xiàn),草魚在Cr6+中毒時(shí)首先是引起呼吸障礙,然后引起機(jī)體魚鰭部位充血,最后衰竭死亡。本研究發(fā)現(xiàn)水體Cr6+對(duì)草魚種的96 h半致死質(zhì)量濃度為74.89 mg/L,安全質(zhì)量濃度為7.489 mg/L,遠(yuǎn)高于我國漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的Cr6+≤0.1 mg/L的指標(biāo),說明草魚對(duì)Cr6+的耐受性相對(duì)較高。Cr6+對(duì)黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)仔魚和稚魚的安全質(zhì)量濃度分別為1.579、5.798 mg/L[5];Cr6+對(duì)鯽魚(Carassiusauratus)的96 h半致死質(zhì)量濃度為244.1 mg/L,安全質(zhì)量濃度為24.41 mg/L[6];Cr6+對(duì)孔雀魚(Poeciliareticulata)的96 h半致死質(zhì)量濃度和安全質(zhì)量濃度分別為43.40 mg/L和4.34 mg/L[7];Cr3+對(duì)于唐魚(Tanichthysalbonubes)96 h半致死質(zhì)量濃度和安全質(zhì)量濃度分別為55.96 mg/L和5.596 mg/L[8]。由此可見,不同魚種對(duì)鉻的耐受性存在較明顯的種間差異,除重金屬外,環(huán)境中的理化因素如pH、溫度、水質(zhì)硬度等也影響著重金屬毒性[9]。因此,綜合考慮環(huán)境污染物對(duì)魚類的毒性有著更重要的意義。

        3.2 Cr6+急性中毒對(duì)魚類組織結(jié)構(gòu)的影響

        重金屬離子被魚體組織吸收后,隨血液循環(huán)到達(dá)各組織器官,妨礙組織細(xì)胞代謝過程而出現(xiàn)組織學(xué)的超微損傷。肝胰臟是魚代謝和積累重金屬離子的主要器官[10]。重金屬對(duì)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞無疑將影響魚類的代謝功能,導(dǎo)致魚類死亡。解剖發(fā)現(xiàn),不同質(zhì)量濃度下死亡的草魚肝胰臟出現(xiàn)不同程度的彌散現(xiàn)象,在相同時(shí)間內(nèi),彌散的程度隨著水體中Cr6+的質(zhì)量濃度升高而嚴(yán)重,同一質(zhì)量濃度條件下,死亡草魚的肝胰臟彌散程度隨時(shí)間的延長而嚴(yán)重。組織異常的原因可能是Cr6+誘導(dǎo)自由基介導(dǎo)過程發(fā)生改變,脂質(zhì)出現(xiàn)過氧化,破壞生物膜,改變細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞功能出現(xiàn)障礙。

        機(jī)體感應(yīng)外部環(huán)境的變化通過神經(jīng)傳導(dǎo)傳遞至大腦組織,經(jīng)大腦處理后,通過機(jī)體調(diào)節(jié)來適應(yīng)環(huán)境變化。試驗(yàn)過程中觀察到,草魚出現(xiàn)一系列異常行為,皆因水中含有Cr6+而對(duì)草魚的腦組織造成影響的外在表現(xiàn)。

        3.3 Cr6+對(duì)魚類超氧化物歧化酶活性的影響

        超氧化物歧化酶是保護(hù)酶系統(tǒng)的重要組成部分,能維持體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡,防止自由基的毒害。本試驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組草魚肝臟中超氧化物歧化酶的活性均降低;48 h時(shí),高質(zhì)量濃度組的超氧化物歧化酶活性低于低質(zhì)量濃度組;96 h時(shí),高質(zhì)量濃度組的超氧化物歧化酶活性高于低質(zhì)量濃度組;同一質(zhì)量濃度下,隨著時(shí)間的延長,超氧化物歧化酶的活性降低。這與黃姑魚(Nibeaalbiflora)肝胰臟超氧化物歧化酶的活性變化大致相同[11],也與Lee等[12]描述的生物受到外界環(huán)境脅迫時(shí)體內(nèi)保護(hù)酶的變化規(guī)律相一致。Vlahogianni 等[13]研究認(rèn)為,當(dāng)機(jī)體抗氧化酶活性受到抑制后,清除自由基的能力下降,引起氧化損傷,因此抗氧化酶活性降低造成的活性氧傷害可能是魚類死亡的重要原因之一。水生動(dòng)物抗氧化酶是一類敏感的分子生態(tài)毒理學(xué)指標(biāo),抗氧化酶可作為生物體氧化脅迫和損傷的標(biāo)志物,用于監(jiān)測重金屬污染物對(duì)水生動(dòng)物的毒性效應(yīng)[14]。

        本研究中草魚肝胰臟組織中超氧化物歧化酶活性的降低程度與水體Cr6+污染水平有一定的關(guān)系,可否用Cr6+作為檢測水體污染的生物學(xué)指標(biāo),還有待進(jìn)一步深入研究。

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        EffectsofConcentrationsofChromiumIononHistologicalStructureofBrainandHepatopancreasandHepatopancreaticSODActivityinGrassCarp

        REN Hongtao,LIN Lin

        ( Animal Science and Technology College, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China )

        In the experiment, the influence of different concentrations of Cr6+(120.00, 160.80, 215.47, 288.73, and 386.90 mg/L) on histological structure of brain and hepatopancreas and superoxide dismutase (SOD) activity in hepatopancreas were studied in grass carp (Ctenopharyngodonidellus) with body weight of some 10 g at water temperature of (20±1) ℃ by a hydrostatic test to seek for the accumulation and toxicity mechanism of heavy metal. It was found that the LC50of Cr6+to grass carp was 302.77 mg/L in 24 h, 154.47 mg/L in 48 h, and 78.89 mg/L in 96 h, with safe concentration of 12.068 mg/L calculated by formula(48 h LC50×0.3)/(24 h LC50/48 h LC50)2and 7.489 mg/L estimated by formula 96 h LC50×0.1. In the early stage of Cr6+poisoning, the grass carp exposed to Cr6+had clustered hepatopancreas cells with slightly enlarged nuclei and the slightly exhibited cytoplasm. As the time elapsed, the significantly aggregated hepatopancreatic cells showed obvious hypertrophy and disorder discrete. The nucleus was relatively narrow in shape, and the cavitation. The brain cells were found to be expansion, discrete, nuclear reduction, a slight overflow of the cytoplasm, a small number of brain cell cytoplasm overflow, and residual nuclear material scattered distribution in the grass carp exposed to Cr6+, thus leading to hepatopancreatic cell necrosis. With the increase in Cr6+concentration and time, the activity of SOD was decreased in the hepatopanceas of grass carp.

        grass carp; Cr6+; mass concentration; tissue and organ; SOD

        10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.06.007

        S965.112

        A

        1003-1111(2016)06-0644-05

        2015-12-24;

        2016-03-10.

        河南科技大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(09001760);河南科技大學(xué)科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目(2014QN059).

        任洪濤(1977—),男,講師,博士;研究方向:水產(chǎn)動(dòng)物分子生物學(xué). E-mail:hthn2012@163.com.

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