許友卿，高 巍，劉富娟，丁兆坤

( 廣西大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)研究所，廣西高校水生生物健康養(yǎng)殖與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)科技學(xué)院，廣西 南寧 530004 )

殼寡糖添加量對(duì)青魚幼魚血清特定生化指標(biāo)、肝和腸白介素IL-2、IL-8和IL-10 mRNA表達(dá)量的影響

許友卿，高 巍，劉富娟，丁兆坤

( 廣西大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)研究所，廣西高校水生生物健康養(yǎng)殖與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)科技學(xué)院，廣西 南寧 530004 )

將30日齡、體質(zhì)量約4.7 g的青魚放養(yǎng)在12個(gè)網(wǎng)箱中，每箱40尾，分別投喂添加0(對(duì)照組)、0.3%、0.6%和1.2%殼寡糖的飼料50 d，每種飼料3個(gè)重復(fù)，研究殼寡糖添加量對(duì)青魚血清特定生化指標(biāo)、肝和腸白介素-2(IL-2)、白介素-8(IL-8)和白介素-10(IL-10 ) mRNA表達(dá)量的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，0.3%殼寡糖組青魚血清乳酸脫氫酶的活性顯著降低(P<0.05)，0.6%殼寡糖組青魚血清甘油三酯、葡萄糖的含量和乳酸脫氫酶的活性顯著降低(P<0.05)，0.3%組的肝IL-2和IL-10的表達(dá)量顯著提高(P<0.05)，0.6%殼寡糖組的肝IL-2和IL-8的表達(dá)量顯著提高(P<0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，在飼料中添加殼寡糖能促進(jìn)青魚幼魚肝和腸白介素的表達(dá)，增強(qiáng)免疫力，降低血糖血脂含量，其中以添加0.6%殼寡糖的效果最佳。

殼寡糖；白介素；表達(dá)；幼魚；青魚

白介素(全稱白細(xì)胞介素，Interleukin, IL)是指在白細(xì)胞或免疫細(xì)胞間相互作用的淋巴因子，由淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生，能刺激T、B淋巴細(xì)胞及其他參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖、分化，提高其功能。白介素和血細(xì)胞生長(zhǎng)因子同屬細(xì)胞因子。兩者相互協(xié)調(diào)，相互作用，共同完成造血和免疫調(diào)節(jié)功能。白介素在傳遞信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化、增殖與分化及炎癥反應(yīng)中起重要作用。至1994年已發(fā)現(xiàn)了15種白介素，其中IL-2、IL-8和IL-10是主要成員，發(fā)揮重要的生理作用[1-2]。研究表明，血清中的酶、糖、脂肪等水平與機(jī)體健康和功能密切相關(guān)。

殼寡糖可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高免疫力、降血脂、抗菌、抗炎和抗癌等[3-5]。在飼料中添加適量殼寡糖可以顯著提高吉富羅非魚(GIFT，Oreochromisniloticus)幼魚的生長(zhǎng)速度和抗嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)感染的能力[6]。殼寡糖添加劑可以不同程度地提高三疣梭子蟹 (Portunustrituberculatus)血淋巴的過氧化物酶活性等[7]。用殼寡糖添加劑飼喂的肉雞血液中免疫球蛋白數(shù)量增加，提高了肉雞的免疫力[8]。殼寡糖還能降血糖，且無毒副作用，是一種無污染、無殘留的飼料添加劑[9]。但是，少見殼寡糖對(duì)青魚(Mylopharyngodonpiceus)幼魚作用的研究。

本試驗(yàn)研究了在飼料中添加殼寡糖對(duì)青魚幼魚血清乳酸脫氫酶活性、甘油三酯和葡萄糖含量及肝和腸IL-2、IL-8和IL-10 mRNA表達(dá)的影響，以其為青魚健康養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)魚是湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的23日齡青魚稚魚800尾，用基礎(chǔ)飼料馴化投喂1周后，挑選機(jī)體健康、規(guī)格一致的30 日齡、體質(zhì)量約4.7 g的魚560尾，隨機(jī)取其中80尾作0周樣品，其余隨機(jī)分為4組，每組3個(gè)重復(fù)，放入12個(gè)正方體1 m×1 m×1 m網(wǎng)箱，每箱40尾。

不加殼寡糖，僅為基礎(chǔ)飼料的為對(duì)照飼料；試驗(yàn)飼料是基礎(chǔ)飼料分別添加0.3%、0.6%和1.2%殼寡糖(表1)。殼寡糖購自大連中科格萊克生物科技有限公司，平均分子量小于1000，聚合度2～7，顆粒度≥100目，水分少于10%，灰分少于1%，pH 5.5～7.0。

粉碎和混勻的原料經(jīng)60目過篩后，用小型商用制粒機(jī)制成粒徑1.5 mm、長(zhǎng)約2 cm的柱狀顆粒，60 °C烘干密封備用。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(以干飼料計(jì)算)

注：預(yù)混料(mg/kg)：氯化鉀，200 mg；碘化鉀(1%)，60 mg；六水氯化鈷(1%)，50 mg；五水硫酸銅，30 mg；一水硫酸亞鐵，400 mg；一水硫酸鋅，400 mg；一水硫酸錳，150 mg；五水亞硒酸納(1%)，65 mg；一水硫酸鎂，2000 mg；沸石粉，3645.85 mg；維生素B1，12 mg；核黃素，12 mg；維生素B6(鹽酸吡哆醇)，8 mg；維生素B12，0.05 mg；維生素K3，8 mg；肌醇，100 mg；泛酸鈣(維生素B3)，40 mg；煙酸，50 mg；葉酸，5 mg；生物素，0.8 mg；維生素A，25 mg；維生素D3，5 mg；乙氧基喹啉，150 mg；小麥粉，2584.15 mg.

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)用水庫水，pH 7.2～7.5，溶氧量>5 mg/L。每日9:00、15:00各投喂一次，日投喂量為魚體總質(zhì)量的3%，飼養(yǎng)50 d。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)取8尾魚，用1∶13 000的間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽麻醉，分別從尾靜脈采血，血液于室溫靜止4 h后，用3800 g低溫離心12 min，分別取血清裝于PC樣品瓶中，標(biāo)記牢固，用液氮速凍后，移存于-80 °C中作測(cè)定用。將取血后的青魚腸、肝臟取出，用0.65%的生理鹽水清洗干凈，用錫箔紙包好，標(biāo)記牢固，用液氮速凍，移存于-80 °C待測(cè)定。

血清甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、葡萄糖、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶等生化指標(biāo)，用南京建成生物工程研究所制備的試劑盒和全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞B(yǎng)S-190全自動(dòng)生化分析儀)測(cè)定。

肝臟和腸免疫因子IL-2、IL-8和IL-10 mRNA的表達(dá)量用下述方法測(cè)定：先用Trizol試劑(Invitrogen, CA, USA)提取樣品中的總RNA，用TAKARA試劑盒反轉(zhuǎn)錄，用SYBR-Green Ⅰ染料法，用Thermo試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量(RTQ-PCR)，所使用的TRQ-PCR儀為ABI熒光定量PCR儀(9700系統(tǒng))。

引物設(shè)計(jì)：用Primer Premier 5.0(Premier Biosoft International, Palo Alto, CA)設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物公司合成。目的基因及內(nèi)參基因見表2。

表2 免疫相關(guān)基因的引物設(shè)計(jì)

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0單因素Duncan法分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，差異顯著表示為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 殼寡糖的添加量對(duì)青魚幼魚血清生化特定指標(biāo)的影響

添加0.6%殼寡糖組魚血清甘油三酯含量[(1.76±0.05) mmol/L]顯著低于對(duì)照組[(1.97±0.10) mmol/L](P<0.05)，添加0.3%、1.2%殼寡糖組魚血清甘油三酯含量[(1.87±0.01 ) mmol/L和(1.84±0.04) mmol/L]與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)；添加0.6%殼寡糖組魚血清葡萄糖含量[(6.08±0.22) mmol/L]顯著低于對(duì)照組[(7.67 ± 0.33 ) mmol/L](P<0.05)，添加0.3%、1.2%殼寡糖組魚血清葡萄糖含量[分別為(6.98 ± 0.44) mmol/L和(6.78±0.13 ) mmol/L]與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)；添加0.3%和0.6%殼寡糖組魚血清乳酸脫氫酶[分別為(536.80±13.84) U/L和(412.10±21.79 ) U/L]顯著低于對(duì)照組[(715.23±80.88) U/L](P<0.05)，但1.2%殼寡糖組魚血清乳酸脫氫酶[(689.17±10.98 ) U/L]與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)；添加不同劑量的殼寡糖，對(duì)青魚幼魚總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白的含量以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性的影響均不顯著(P>0.05)(表3)。

表3 殼寡糖添加量對(duì)青魚幼魚血清特定生化指標(biāo)的影響

注：上述所有數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n = 3×3). 同行數(shù)據(jù)上標(biāo)不同字母者表示數(shù)據(jù)間差異顯著(P< 0.05).

2.2 殼寡糖的添加量對(duì)青魚幼魚腸和肝IL-2、IL-8和IL-10 mRNA表達(dá)量的影響

添加0.6%殼寡糖組魚肝IL-2 mRNA的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和添加0.3%、1.2%殼寡糖組(P<0.05)，添加0.3%和0.6%殼寡糖組魚肝IL-2 mRNA的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但添加1.2%殼寡糖組魚肝IL-2 mRNA的表達(dá)量與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)；添加0.6%殼寡糖組魚腸IL-2 mRNA的表達(dá)量顯著高于1.2%殼寡糖組(P<0.05)，但與0.3%組差異不顯著(P>0.05)，添加0.6%殼寡糖組魚腸IL-2 mRNA的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但添加0.3%、1.2%殼寡糖組魚腸IL-2 mRNA的表達(dá)量與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)(圖1)。

添加0.6%殼寡糖組魚肝IL-8 mRNA的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，添加0.3%、1.2%殼寡糖組魚肝IL-8 mRNA的表達(dá)量與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，且添加0.6%殼寡糖組魚肝IL-8 mRNA的表達(dá)量顯著高于0.3%殼寡糖組(P<0.05)；各組魚腸IL-8 mRNA的表達(dá)量彼此差異不顯著(P>0.05)(圖1)。

添加0.3%殼寡糖組魚肝IL-10 mRNA的表達(dá)量顯著高于添加0.6%、1.2%殼寡糖組(P<0.05)，添加0.3%殼寡糖組魚肝IL-10 mRNA的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但添加0.6%、1.2%殼寡糖魚肝IL-10 mRNA的表達(dá)量與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)；添加0.6%殼寡糖組魚腸IL-10 mRNA的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組、添加0.3%和1.2%組(P<0.05)(圖1)。

對(duì)照組 0.3%殼寡糖組 0.6%殼寡糖組 1.2%殼寡糖組

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，0.6%殼寡糖添加劑能顯著促進(jìn)青魚幼魚肝和腸IL-2、IL-8和IL-10 m RNA的表達(dá)。筆者認(rèn)為，促炎癥因子IL-2、IL-8和抗炎癥因子IL-10的表達(dá)同時(shí)提高，可有效提升機(jī)體的抗炎水平，并不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利因素，其理由是：IL-2是T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)T細(xì)胞免疫反應(yīng)，能活化T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的表達(dá)[10]，促進(jìn)多種細(xì)胞反應(yīng)，促進(jìn)淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞分化和分泌免疫球蛋白(Ig)[11]。IL-8是典型的促炎癥因子，也是一種重要的趨化因子，還有很強(qiáng)的促血管生成作用。IL-8調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，對(duì)感染組織有一定的恢復(fù)作用[12]。IL-10具有抗炎、抗腫瘤作用[13-14]，參與炎癥反應(yīng)并能緩解炎癥，對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用，在硬骨魚中具有免疫調(diào)節(jié)作用[15]。IL-10 mRNA的表達(dá)增加可抑制炎癥反應(yīng)，緩解炎癥疾病，有助于治療炎癥[15-16]。

本研究表明，添加0.3%和0.6%的殼寡糖顯著降低了青魚幼魚血清中乳酸脫氫酶的活性。該酶活性的降低有利于保護(hù)青魚機(jī)體組織，維持乳酸脫氫酶平衡。用中藥降低球蟲感染雛雞血清乳酸脫氫酶活性，具有保護(hù)腸道黏膜，降低其受損程度的作用[17]。

研究表明，飼料中添加0.6%的殼寡糖能顯著降低青魚幼魚血清中甘油三酯的含量。血清甘油三酯降低使血脂減少，有益于心血管健康和發(fā)揮生理功能。試驗(yàn)結(jié)果與孫立威等[6，18]研究結(jié)果一致，孫立威等[6]在日糧中添加適量的殼寡糖可以顯著降低吉富羅非魚幼魚血清中總膽固醇和低密度脂蛋白水平。劉含亮等[18]在飼料中添加殼寡糖顯著降低了虹鱒(Oncorhynchusmykiss)血清甘油三酯和膽固醇等含量(P> 0.05)。

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EffectofChito-oligosaccharideonSerumBiochemicalIndicesandExpressionofIL-2,IL-8andIL-10mRNAinJuvenileBlackCarpMylopharyngodonpiceus

XU Youqing, GAO Wei, LIU Fujuan, DING Zhaokun

( Key Laboratory for Aquaculture and Nutritional Control of Living Organism in Guangxi High Education, Institute for Fishery Sciences, Faculty of Animal Sciences and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China )

A total of 560 30 day old black carp (Mylopharyngodonpiceus) juveniles with body weight of about 4.7 g acclimatized for 1 week were reared in 12 net cages each of 1 m×1 m×1 m at a rate of 40 fish per cage and fed 4 diets containing 0 (control group), 0.3%, 0.6% and 1.2% of chito-oligosaccharide twice a day at a rate of 3% of total fish body weight with triplication for 50 days to study the effects of chito-oligosaccharide on specific biochemical indices in the serum and the expression of IL-2, IL-8 and IL-10 mRNA in hepatopancreas and intestine of the juvenile. The lactate dehydrogenase activity was found to be decreased significantly in the fish fed 0.3% chito-oligosaccharide(P<0.05). The levels of triglycerides and glucose and activity of lactate dehydrogenase were found to be significantly reduced in the fish fed 0.6% chito-oligosaccharide (P<0.05). The expression of IL-2 and IL-10 mRNA was found to be increased significantly in the hepatopancreas of the fish fed 0.3% chito-oligosaccaride(P<0.05). The expression of IL-2 and IL-8 mRNA was found to be increased significantly in the hepatopancreas of the fish fed 0.6% chito-oligosaccharide(P<0.05). The expression of IL-2 and IL-10 mRNA was found to be increased significantly in the intestine of the fish fed 0.6% chito-oligosaccharide(P< 0.05). It is concluded that chito-oligosaccharide supplementation significantly decreases blood glucose and lipid levels, and significantly promotes the expression of interleukin in the hepatopancreas and intestine of juvenile black carp. It is suggested that the optimal dietary supplementation of chito-oligosaccharide be 0.6%.

chito-oligosaccharide; interleukin; expression; juvenile;Mylopharyngodonpiceus

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.02.011

S963.73

A

1003-1111(2016)02-0157-05

2015-08-28；

2015-10-26.

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31360639); 廣西壯族自治區(qū)生物學(xué)博士點(diǎn)建設(shè)項(xiàng)目(P11900116, P11900117); 廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012GXNSFAA053182, 2013GXNSFAA019274, 2014GXNSFAA118286, 2014GXNSFAA118292); 廣西科技項(xiàng)目(1298007-3).

許友卿(1958-)，女, 教授, 博士生導(dǎo)師；研究方向：環(huán)境生物學(xué)、水生動(dòng)物營養(yǎng)、生理、生化和分子生物學(xué). E-mail: youqing.xu@hotmail.com. 通訊作者: 丁兆坤(1956-)，男，教授, 博士生導(dǎo)師；研究方向：環(huán)境生物學(xué)、水生動(dòng)物營養(yǎng)、生理、生化和分子生物學(xué). E-mail: zhaokun.ding@hotmail.com.